סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים
9 באפריל 2021
פרויקט מדעי אזרחי תוכנן לגייס את תושבי סן דייגו לאסוף דגימות סביבתיות עבור SARS-CoV-2. פלטפורמה רב-לשונית מבוססת אינטרנט נוצרה לשליחת נתונים באמצעות ממשק מכשיר נייד ידידותי למשתמש. מערכת ניהול מידע במעבדה אפשרה איסוף של אלפי דגימות מגוונות גיאוגרפית עם מעקב אחר תוצאות בזמן אמת.
מחקר זה מציג זרימת עבודה חדשנית לגילוי SARS-CoV-2 על משטחים המנקים לעתים רחוקות בסביבה העירונית, כגון ידיות משאבת גז, גני שעשועים וכספומטים. במגיפה, האספקה נדירה. אנו משתמשים בחומרים הניתנים להשגה בקלות ריאגנטים וציוד זמין בהגדרות מעבדה בסיסיות.
אנו משתמשים בשיטת מיצוי המשמרת את ה- RNA ללא שרשרת קרה, ושיטת זיהוי עמידה בפני מעכבים. פרוטוקול זה הוא אינטרס בריאות הציבור. הוא מספק מסגרת להערכת מאגרים ויראליים סביבתיים למגפת COVID-19 הנוכחית וסוכנים זיהומיים אחרים במהלך התפרצויות עולמיות עתידיות.
לגייס מדענים אזרחיים באמצעות קריאה ישירה וברורה לפעולה שפורסמה באמצעות מדיה מקומית וחברתית. צור מזהה ייחודי (handle) של מדיה חברתית כדי לחבר את הנושא בין תוכן מדיה חברתית. צור קישור ל- SMP, המספק תוסף רב-לשוני כדי לאפשר ניווט בשפות מרובות עבור אנשים להגיש בקשה להשתתף במאמץ הדגימה הסביבתית על-ידי מענה על שאלות הקשורות ל- biosafety שצוינו בטופס מקוון.
כלול במקטע הדגימה פרוטוקולים גרפיים ושמעיים באנגלית ובספרדית. דמיין נתונים גאו-מרחביים באמצעות ממשק תכנות יישומים גאו-מרחבי בהנחיית ספק שירותי מחשב בענן. אחסן את הנתונים שנשלחו ל- LIMS באמצעות SMP כדי להקל על אחסון מרכזי, מעקב אחר תהליכי עבודה של עיבוד וניהול הלוגיסטיקה.
טען מראש מידע כגון מזהה ערכה לדוגמה, מזהה לדוגמה, תאריך, שעה וקואורדינטות מערכת מיקום כלליות כדי לאפשר תאימות של סוגי נתונים ולמזער את השגיאה. כלול קישור לדוגמה לבקשת איסוף עבור המשתתפים, שבו הם יכולים להשתמש לאחר שאספו את כל הדגימות. בנה ערכה המכילה את כל ציוד הדגימה, כולל ציוד המגן האישי הדרוש, כגון מסכה וכפפות, פרוטוקול דגימה ומידע רלוונטי לאבטחה ביולוגית.
ספוגית לעתים רחוקות חיטוי משטחים במשקי הבית ובסביבה העירונית על ידי הרטבת ספוגית פוליאסטר מרובע סנטימטר אחד סופג עם חומר ניקוי וניקוי משטח של 10 ס"מ בריבוע. בעזרת קיסם, להטביע כל דגימת דגימה בצינור שכותרתו מראש המכיל 200 microliters של guanidinium thiocyanate. ללבוש את המסכה שסופקה זוג חדש של כפפות עבור האוסף של כל מדגם, כדי למנוע זיהום צולב.
לאחר סיום הדגימה, השתמש בחיטוי הידיים שסופק. לאחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מועברים למעבדה. ברגע שהדגימות מגיעות למעבדה, אחסנו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי להגביר את מהירות ההקרנה, לעבד את הדגימות בבריכות. אם מאגר הוא חיובי, לחלץ את ה-RNA של כל מדגם באופן עצמאי. שלב את הדגימות מכל ערכת דגימה לשתי בריכות על ידי איגום 50 מיקרוליטרים של כל אחת משמונה הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה ושמירת הדגימות הנותרות במינוס 80 מעלות צלזיוס.
הוסף 80 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת במשך 15 שניות. ואז דגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים את השכבה המ מימית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. אחסנו את שאר הממשק והנוזל הוורוד במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. שברים אלה מכילים DNA וחלבונים.
לחלץ RNA משכבת מימית התאושש באמצעות פרוטוקול מיצוי גולמי RNA מבוסס guanidinium. הכינו את תערובת התגובה RT-LAMP בטמפרטורת החדר עם נפח עודף של 10% כדי להסביר את אובדן הצינור. הוסף חמישה מיקרוליטרים של RNA לתגובת המדגם וחמישה מיקרוליטרים של RNA בתוספת 2.5 מיקרוליטרים של SARS-CoV-2 RNA סינתטי לתגובה הממוסמרת.
הוסף 2.5 מיקרוליטרים של SARS-CoV-2 סינתטי RNA לשליטה חיובית וחמישה microliters של מים לשליטה שלילית. מערבבים היטב ומסובבים את התגובות. עבור התבוננות עיוורת, תוצאה שלילית מסומנת על ידי ורוד ותוצאה חיובית מסומנת על ידי צהוב.
לאחר RT-LAMP, בצע אלקטרופורזה ג'ל. ההפצה של אתרי איסוף לדוגמה מוצגת כאן. רוב הערכות הושלמו, והנתונים המתאימים הועלו ל- LIMS.
מגבלת הגילוי בתדר של 100% הייתה 500 עותקים לכל 25 מיקרוליטרים של תגובה. ב- RT-LAMP הצבעוני, דגימות חיוביות שינו צבע מוורוד לצהוב עקב שינוי pH משמונה ל- 5.5. במספרי עותק נמוך, דגימות היו לרוץ על ג'ל agarose כדי לאשר את החיוביות עם דפוס דמוי סולם וכתוצאה מכך.
שיטות QPCR RT נבדקו עם דגימות סביבתיות. כל תערובות האב היו רגישות למעכבים בריכוזי מספר עותק נמוך של השליטה החיובית. בריכוזים נמוכים של התבנית, שיטות PCR RT מסורתיות הראו תוצאות חיוביות שגויות ותשלילים כוזבים.
לבסוף, טכניקה הנקראת הגברה מעגלית מתגלגלת זיהתה כמויות קטנות של רצף היעד. עם זאת, זה הראה הגברה של החללית בהיעדר תבנית RNA. חיוני לשחרר קריאה לפעולה שמגיעה לכל המגזרים בקהילה כך שהדגימה באמת מייצגת את הסיכון לחשיפה של כל חברי הקהילה.
מסגרת זו מזהה חומר גנטי SARS-CoV-2. מחקרים לבדיקת כדאיות נגיפית הם השלב הבא.
סקירה כללית
מאמר זה מציג זרימת עבודה המבוססת על מדע אזרחי לזיהוי SARS-CoV-2 על משטחים עירוניים המנוקים לעיתים רחוקות במהלך פנדמיית ה-COVID-19. הפרוטוקול רותם חומרים וריאגנטים נגישים בקלות, ומאפשר דגימה סביבתית רחבת היקף וזיהוי רגיש של RNA ויראלי, גם תחת מגבלות של שרשראות אספקה. הגישה תוכננה להיות עמידה בפני מעכבים הנמצאים בדרך כלל בדגימות סביבתיות, והיא ניתנת להתאמה למעקב בריאות הציבור בעתיד עבור וירוסים אחרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- וירולוגיה סביבתית
- מעקב בריאות הציבור
- דיאגנוסטיקה מולקולרית
רקע
- העברה של SARS-CoV-2 דרך משטחים הייתה מקור לדאגה במהלך פנדמיית ה-COVID-19.
- רוב הניטור הסביבתי התמקד במיקומים בעלי שכיחות גבוהה, כגון בתי חולים ותחבורה ציבורית.
- משטחים עירוניים המנוקים לעיתים רחוקות עשויים לשמש כמאגרים ויראליים.
- מחסור באספקה במהלך הפנדמיה הצריך אסטרטגיות דגימה וזיהוי חלופיות.
מטרת המחקר
- פיתוח ותיקוף של תהליך עבודה לגילוי SARS-CoV-2 על משטחים עירוניים שאינם עוברים חיטוי באופן שגרתי.
- שיתוף מדענים אזרחים בדגימה סביבתית רחבת היקף.
- יצירת פרוטוקול העמיד למחסור באספקה ולמעכבים סביבתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גיוס של 350 מדעני אזרחים באמצעות מדיה מקומית וחברתית, עם תמיכה רב-לשונית.
- חלוקת ערכות דגימה המכילות ציוד מגן אישי (PPE), מטושים ופרוטוקולים.
- דגימה של שטחי פנים של 10 cm2 באמצעות מטושי פוליאסטר טבולים בחומר ניקוי.
- שימור הדגימות ב-guanidinium thiocyanate ללא צורך בשרשרת קירור.
- איחוד דגימות (pooling) לצורך סריקה ראשונית, ולאחריה הפקת RNA אינדיבידואלית אם המאגרי המאוחדים נמצאו חיוביים.
- הפקת RNA באמצעות פרוטוקול המבוסס על guanidinium thiocyanate.
- זיהוי באמצעות RT-LAMP קולורימטרי, שאושר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
- השוואה עם שיטות RT-qPCR והגברה של מעגל מתגלגל (rolling circle amplification).
- ניהול נתונים מרכזי באמצעות מערכת לניהול מידע מעבדתי (LIMS) וכלים לוויזואליזציה גיאוספציאלית.
תוצאות עיקריות
- מעל 4,000 דגימות נאספו ממשטחים עירוניים מגוונים.
- בדיקת ה-RT-LAMP הדגימה סף גילוי של 500 עותקים לכל תגובה של 25 µL עם קריאה קולורימטרית ברורה.
- איחוד דגימות (Pooling) העלה את יעילות הסריקה; מאגרי דגימות חיוביים עברו דקונבולוציה לצורך אנליזה פרטנית.
- בדיקת RT-qPCR הייתה רגישה למעכבים במספרי עותקים נמוכים, מה שהוביל לתוצאות חיוביות/שליליות שגויות.
- הגברה במעגל מתגלגל (Rolling circle amplification) הראתה הגברה לא ספציפית בהיעדר תבנית RNA.
- תהליך העבודה רתם בהצלחה את הקהילה ואפשר ניטור סביבתי מקיף.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מאפשר זיהוי רגיש של RNA של SARS-CoV-2 על משטחים עירוניים באמצעות חומרים נגישים והשתתפות של אזרחים.
- תהליך העבודה עמיד בפני מעכבים סביבתיים וניתן להתאמה להתפרצויות עתידיות של וירוסים אחרים.
- דרושים מחקרים נוספים כדי להעריך את החיוניות של הווירוס על המשטחים שזוהו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניטור סביבתי של RNA ויראלי על משטחים עירוניים מספק מסגרת ניתנת להרחבה לגילוי מוקדם של סיכוני הדבקה בקהילה ומאגרים סביבתיים. תהליך עבודה זה מאפשר דגימה מבוזרת ומהירה וזיהוי חסון גם תחת מגבלות של שרשראות אספקה, ובכך תומך בביטחון חיזוי בתחומי בריאות הציבור והמו"פ הביופארמצבטי. הגישה ניתנת להתאמה לניטור פתוגנים עתידיים, ומספקת מידע להערכת סיכונים ואסטרטגיות התערבות לאורך כל הרצף, משלב הגילוי ועד לשלב הניטור.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה מבוססת השערות של מאגרי נגיפים סביבתיים הרלוונטיים לדינמיקת ההעברה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת הנוכחות והפיזור של RNA ויראלי על משטחים מגוונים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי במודלים של חשיפה סביבתית לגורמים זיהומיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פרוטוקולים מתוקפים לזיהוי ברגישות גבוהה של RNA ויראלי במטריצות סביבתיות מורכבות.
- מנרמל את איסוף הדגימות והעיבוד שלהן להשגת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור בקרב קוהורטות גדולות.
- מדגים את חוסנו של הבדיקה (assay) אל מול מעכבים, ובכך תומך בסריקה אמינה בתנאי אמת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין נתוני ניטור סביבתי לבין אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים לבריאות הציבור לצורך מוכנות להתפרצויות.
- מאפשר רציפות מזיהוי סביבתי ועד למידול סיכונים פרה-קליני ותכנון התערבות.
- תומך בקידום מבוסס התאמה לסיכון של כלי מעקב עבור פתוגנים מתהוותים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
תהליך עבודה זה מגשר בין דגימה סביבתית, זיהוי מולקולרי וניהול נתונים מרכזי, ובכך הוא מקיף את השלבים החל מגילוי מוקדם ועד למעקב תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי התפשטות סביבתית ומיפוי מאגרים.
- סריקה: מספק זיהוי כמותי הניתן לשחזור של RNA נגיפי מדגימות מאוגדות ודגימות בודדות.
- אנליטיקה: משלב נתונים גאוספציאליים ונתונים מבוססי LIMS לצורך ניתוח השוואתי ועמידה בתקנים.
- מחקר תרגומי: מספק מידע ליישור קו של סמנים ביולוגיים לבריאות הציבור ואסטרטגיות תגובה להתפרצויות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת להרחבה ולהתאמה עבור יוזמות עתידיות למעקב אחר פתוגנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בהערכת סיכונים סביבתיים ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מאפשר דגימה וזיהוי סטנדרטיים וניתנים להרחבה תחת מגבלות משאבים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנוגע להתנעת מעקבים (go/no-go) ותיעדוף התערבויות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של פיתוח כלי מעקב ואבחון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באבחון מולקולרי ובפרוטוקולים של דגימה סביבתית.
- נדרשת גישה לתשתיות מעבדה בסיסיות ולמערכת LIMS לניהול נתונים.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לאיסוף דגימות, עיבודן ודיווח נתונים.
- ניתן להתאמה לסביבות עירוניות וקהילתיות שונות עם דרישות מינימליות לאספקה.
- הגילוי מוגבל ל-RNA ויראלי; מחקרי חיוניות הם השלב הבא ההכרחי.
