ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה היא טכניקה של מולקולה בודדת המבוססת על פינצטה לייזר המאפשרת לחקור את הכימומכניקה של מנועי מיוזין תחת עומס ברזולוציית הזמן הגבוהה ביותר. טכניקה זו מאפשרת לחקור אירועים מהירים מאוד בייצור הכוח על ידי שמירה על קבוע הכוח בכל שלב של האינטראקציה המוטורית עם שליטה מלאה על כיווניות הכוח. על ידי ביצוע התאמות מתאימות, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות על סוגים אחרים של מנועים תהליכיים, כולל קינזין ודינינים, כדי לחשוף את הרגולציה בכוח.

לאחר הרכבת סט אחד של מסיט אקוסטי-אופטי על מתרגם ליניארי, קח קשתית וכוונן את הצמצם שלה כך שיתאים לגודל הצמצם האחורי האובייקטיבי. החלף את המטרה בקשתית המרוכזת בבית המטרה המושחל. הזיזו את המתרגם לכיוון קרן הלייזר עד שהחלק של הקרן שנחסם על ידי גביש הפיזו ייראה אחרי הקשתית, וסובבו את המתרגם מעט אחורה עד שהקרן תמלא לחלוטין את פתח הקשתית.

כדי להכין חרוזי סיליקה בפנטיל אצטט, תחילה יש לדלל 20 מיקרוליטר של 1.2 מיקרון 10% חרוזי סיליקה מוצקים ב-1-1.5 מיליליטר אצטון עם מערבולות ו-30 שניות של סוניקציה. לאחר הסוניקציה, לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ולהשעות מחדש את גלולת החרוז במיליליטר אחד של אצטון טרי לשטיפה שנייה. לאחר שטיפת האצטון השנייה, שטפו את החרוזים שלוש פעמים במיליליטר אחד של פנטיל אצטט טרי בכל שטיפה באותם תנאי צנטריפוגה, והשהו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של 1% ניטרוצלולוז ו-900 מיקרוליטר פנטיל אצטט.

לאחר מכן, השתמשו בחתיכת רקמת מעבדה טהורה ספוגה באתנול כדי לנגב בזהירות כיסוי זכוכית בגודל 24 x 24 מילימטר לפני שתשתמשו בפינצטה נקייה כדי לשטוף את הזכוכית ישירות באתנול ולאפשר לכיסוי להתייבש תחת זרימת חנקן עדינה. מערבבים ומסוננים את מלאי חרוזי הסיליקה המוכנים למשך 30 שניות ומשתמשים בכיסוי 24 x 60 מ"מ מנוקה אתנול כדי למרוח 2 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי סיליקה על פני השטח של הכיסוי הקטן יותר. בזמן שהחרוזים מתייבשים, נקו מגלשה בגודל 26X76 מ"מ כפי שהודגם והניחו שני קווים בעובי 60-100 מיקרון של 3 מ"מ דו-צדדיים מודבקים על הקצוות הארוכים של המגלשה.

בעזרת פינצטה נקייה, הניחו את הכיסוי מצופה החרוזים על הסרט כשהחרוזים פונים לחלק הפנימי של תא ההחלקה, ומלאו את התא בחיץ פוספט 15 מילימולרי ותמיסת חרוזי פוליסטירן צפה. לאחר מכן, לאטום את החדר עם שומן סיליקון. כדי לכייל את יחס הפיקסלים לננומטר של מצלמת שדה הבהיר, קבל תמונה ראשונה של חרוז סיליקה על משטח הכיסוי במרחק של כ -5 מיקרון ממרכז שדה הראייה.

הזיזו את הבמה כדי להזיז את החרוז 10 מיקרון לכיוון מרכז שדה הראייה ולצלם תמונה שנייה. חשב את קבוע כיול המצלמה על-ידי מדידת מרחק הפיקסלים בין שני מיקומים של החרוז. כדי לכייל את מיקום ההשמנה, לכדו חלקיק צף בודד במלכודת אחת והזיזו את מסיטי ההדבקה האקוסטיים-אופטיים בצעדים של 0.2 מגה-הרץ, תוך קבלת תמונה של החלקיק והתדירות המתאימה של המסיט לכל שלב.

לאחר מכן, חזור על הכיול עבור המלכודת השנייה באותו אופן. כדי לכייל את עוצמת המלכודת ואת קשיחותה, לכוד חלקיק בודד בכל מלכודת והזז את שתי המלכודות באמצעות מסיטי האקוסטיקה האופטיים בצעדים של 0.2 מגה-הרץ, תוך רישום תנועה בראונית של החלקיק בשתי המלכודות עם גלאי פוטודיודה רבעוניים והתדר המתאים של מסיטי האקוסטיקה-אופטיים. קבל קבועי כיול על ידי התאמת פונקציה לורנציאנית לספקטרום עוצמה של התנועה הבראונית המוקלטת.

כדי להרכיב דגימה למדידה, הוסף 1 מיליגרם למיליליטר של BSA ביוטינילציה לתא חדש עם חרוזי סיליקה על משטח הכיסוי. לאחר 5 דקות, לשטוף את החדר עם חיץ AB ולהוסיף 1 מיליגרם לכל מיליליטר של סטרפטווידין לחדר. לאחר 5 דקות, שטפו את התא כפי שהודגם והוסיפו 3 מרומיוזין כבד מיוזין-5B ביוטינילציה ננומולרית במאגר M5B בתוספת 2 קלמודולין מיקרומולארי.

לאחר 5 דקות, שטפו את החדר שלוש פעמים עם 1 מיליגרם למיליליטר של BSA ביוטינילציה בתוספת 2 קלמודולין מיקרומולרי במאגר AB והמתינו 3 דקות לאחר השטיפה הסופית. מזרימים את תערובת התגובה ואוטמים את התא בשומן סיליקון. כדי למדוד את הדגימה, הניחו את התא על במת המיקרוסקופ והזיזו את המטרה עד שחרוזי האלפא-אקטינין הצפים יהיו ממוקדים.

הפעילו מלכודת אחת ולכדו חרוז אחד. לאחר שהמלכודת הראשונה תפוסה, הזיזו את המתרגם כדי למקם את החרוז הלכוד קרוב למשטח הכיסוי כדי למנוע השמנת חרוזים מרובים, ולכדו חרוז במלכודת השנייה. העבירו את הדגימה דרך המתרגמים ארוכי הטווח כדי לאתר סיבי אקטין באורך של לפחות 5 מיקרון בתוך התמיסה.

כאשר זוהה חוט להט, הזיזו את הדגימה כדי לאפשר לחרוז לכוד להתקרב לקצה אחד של חוט הלהט. לאחר חיבור חוט הלהט, התאימו את מרחק החרוז לאורך הנימה המשוער והזיזו את הבמה כדי ליצור זרימה בכיוון החרוז הלא קשור. חוט הלהט יימתח על ידי הזרימה ובסופו של דבר ייקשר לחרוז השני.

הקומפלקס המתקבל נקרא משקולת"כדי ליצור מגע אקטין מיוזין, להפריד בעדינות את שתי המלכודות ולהגדיר את חוט הלהט לרמות יומרה עד כ 3 piconewtons. כדי לבחון את קשיחות המשקולת, גרמו למלכודת אחת להתנדנד בגל משולש על ידי שינוי התדר של מסיט אקוסטי-אופטי אחד ואימות העברת התנועה לחרוז הנגרר באמצעות אות המיקום שלו. הזיזו את הבמה כדי למקם את המשקולת בקרבת חרוז סיליקה והתאימו את גובה המשקולת כך שחוט האקטין יבוא במגע עם משטח חרוזי הסיליקה.

כפי שנצפה ברשומת מיקום מייצגת זו, כאשר מנוע המיוזין אינו מקיים אינטראקציה עם חוט האקטין , החרוזים הלכודים נעים במהירות קבועה כנגד כוח הגרר הצמיגי של התמיסה. ברגע שמנוע המיוזין מתחיל לתקשר עם חוט הלהט, הכוח הנישא על ידי חוט הלהט הנע מועבר במהירות רבה לחלבון, ומהירות המערכת יורדת לאפס, כאשר אירועי הדריכה מתרחשים תחת כוח קבוע עד סוף הריצה. הכוח מועבר מהכיוון החיובי לכיוון השלילי על ידי מערכת המשוב, שמחליפה את כיוון הכוח כאשר החרוז מגיע לקצה טווח התנודות שנקבע על ידי המשתמש.

כאשר המיוזין נקשר ומזיז את חוט הלהט לכיוון החיובי, הוא דוחף את החרוז לכיוון הקצה העליון של טווח התנודות. אם זה קורה תחת כוח מסייע, הריצה של המיוזין תופרע על ידי היפוך כיוון הכוח בקצה התנודה, מה שיגביל את אורך הריצה למשרעת של תנודת המשקולת. יישור מדויק של המערכת האופטית נחוץ כדי להשיג את הרזולוציה המרחבית והזמנית האופטימלית, בעוד כיול מדויק נחוץ כדי לקבוע במדויק את ערכי הכוחות המופעלים.

טכניקה זו הותאמה לחקר הזזה וחיפוש ממוקד של גורמי שעתוק בדנ"א, כמו גם אינטראקציות דינמיות בין חלבוני מכנוטרנסדוקציה המושרים על חוטי מיקרוטובול.