התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
31 במרץ 2021
מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.
פרוטוקול זה מפרט שיטה ליצירת אוכלוסייה מאופיינת היטב של תאי אנדותל המוגניים אנושיים. ניתן להשתמש בתאים אלה כדי לחקור את הוויסות המולקולרי ואת המעבר האנדותל-להמטופויאטי. התחילו בהתרבות תאי גזע עובריים אנושיים במשך ארבעה ימים כדי להבדיל אותם לתאי אנדותל קדמוניים.
ביום החמישי, שאפו את המדיום שמעל התאים. לאחר מכן שטפו בעדינות את התאים עם מיליליטר אחד של DMEM/F-12 לכל באר. הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום התמיינות תאי אנדותל המוגני טרי לכל באר ודגרו על התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
ביום השישי וביום השביעי, החליפו את המדיום שמעל התאים במיליליטר אחד של מדיום התמיינות של תאי אנדותל הומוגני טרי לכל באר, ודגרו על התאים למשך 24 שעות נוספות. ביום השמיני. לאחר ניתוק ושטיפת התאים, מחלקים אותם באופן שווה לצינורות מיקרוצנטריפוגה על קרח, שכל אחד מהם מכיל מינימום של 600 מיקרוליטר של תאים בצפיפות של 1 כפול 10 עד התאים החמישיים למיליליטר.
מוסיפים נוגדנים לצינורות המכילים תאים לפי הצורך ודוגרים על קרח מוגן מפני אור במשך 30 דקות. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1000 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את supernatant ולהשהות את הכדורים ב 600 microliters של חיץ מיון קר כקרח.
מסננים את הדגימות דרך מכסה מסנן הרשת של צינורות FACS של חמישה מיליליטר ומאחסנים את התאים על קרח המוגנים מפני אור למיון תאים מיידי. כדי לבודד תאי אנדותל המונוגניים על ידי FACS, יש לשער תחילה את אוכלוסיית התאים השליליים CD45. לאחר מכן, בתוך האוכלוסייה השלילית של CD45, יש לשער את התאים החיוביים ל-CD31.
הבא באוכלוסייה החיובית ל-CD31, שער לאוכלוסיית התאים השליליים ל-VE-cadherin. ואז בתוך האוכלוסייה השלילית של VE-cadherin, שער לתאים חיוביים ל-c-Kit. מתוך האוכלוסייה החיובית ל-c-Kit, יש לשער את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD34.
ולבסוף מאוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD34, לזהות ולאסוף את התאים החיוביים ל-KDR. לאחר זריעת תאי אנדותל המוגני במדיום מבוסס מתילצלולוז שפותח לצמיחה של תאי אב המטופויאטיים, מושבות יוצרות מושבה-אריתרואיד, ומושבות אריתרואיד יוצרות פיצוץ נספרות ביום השמיני. יחידה יוצרת מושבה-גרנולוציט-מקרופאג' ויחידה יוצרת מושבה-גרנולוציט, אריתרואיד, מקרופאג' ומגה-קריוציטים.
מושבות אב המטופויאטיות רב-פוטנטיות נספרות ביום 14. לכל 1000 תאי אנדותל המוגני מצופה, נוצרות כ -20 יחידות יוצרות מושבה. תאים עם מורפולוגיה של תאי אנדותל נראים גם בתרביות.
אלה הם תאי האנדותל ההמוגניים המולידים אבות המטופויאטיים מרובי תאים ברמה של תא יחיד. פרוטוקול זה הוא מערכת תרבית דו-ממדית ללא מזין מורין שיכולה לייצר תאי אנדותל המוגוגניים אנושיים תוך כשבוע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להשגת תאים אנדותליאליים המוגנים (hemogenic endothelial cells) מתאי גזע עובריים אנושיים בתוך כשבוע. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להפיק אוכלוסייה מאופיינת היטב של תאים אלו, החיוניים לחקר המעבר מאנדותליום להמטופואזה (endothelial-to-hematopoietic transition), ובעלי פוטנציאל ליישומים ברפואה רגנרטיבית וביצור מוצרי דם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- ביולוגיה של כלי דם
- המטופואזיס
- הנדסת רקמות
רקע
- כלי דם חיוניים לתפקוד הרקמה והם מרופדים בתאי אנדותל וסקולריים.
- תאי אנדותל המוגנים (Hemogenic endothelial cells) הם תת-סוג מתמחה המהווה את המקור לתאי שם ותאי מקור המטופואטיים במהלך ההתפתחות.
- יצירת תאים אלו במבחנה (in vitro) היא בעלת ערך למחקר של התפתחות תאי דם וליישומים טיפוליים פוטנציאליים.
- פרוטוקולים קיימים לגזירת תאי אנדותל אינם מניבים תאי אנדותל המוגנים (hemogenic endothelial cells) המאופיינים היטב מתאי גזע אנושיים.
מטרת המחקר
- לבסס פרוטוקול הניתן לשחזור להפקת תאי אנדותל המוגנים (hemogenic endothelial cells) מתאי גזע עובריים אנושיים.
- לאפשר את חקר הרגולציה המולקולרית והמעבר מאנדותל להמטופוייזה (endothelial-to-hematopoietic transition) in vitro.
- לספק מערכת נטולת תאי מאכיל (feeder-free) ונטולת סרום, המתאימה ליישומים המשכיים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תרבית של תאי גזע עובריים אנושיים וגזירה מדורגת לאורך שמונה ימים.
- השראה של שורות תאי בלוסדרמה ואנדותל באמצעות גורמי גדילה ומולקולות קטנות ספציפיות (למשל, מעכב GSK3β, bFGF, BMP4, VEGF-A, וחומצה רטינואיות).
- ציטומטריית זרימה (FACS) עבור סינון רצפי (gating) ובידוד של תאי אנדותל המוגנים (hemogenic endothelial cells) על בסיס סממנים שטח (CD45-, CD31+, VE-cadherin-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- הערכה פונקציונלית באמצעות בדיקות יצירת מושבות במצע המבוסס על מתילצלולוז להערכת הפוטנציאל ההמטופואטי.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מניב אוכלוסייה מוגדרת של תאים אנדותליאליים המוגנים (hemogenic endothelial cells) בתוך שבוע אחד.
- נוצרות כ-20 יחידות יוצרות מושבות לכל 1000 תאים אנדותליאליים המוגנים, מה שמעיד על פוטנציאל המטופואטי חזק.
- נצפו מושבות של תאי אב המטופואטיים רב-פוטנציאליים וכן מושבות אריתרואידיות.
- מורפולוגיית התאים האנדותליאליים נשמרת בתרבית, מה שמאשר את זהות התאים.
מסקנות
- פרוטוקול זה, הנם ללא מזינים (feeder-free) וללא סרום, מייצר ביעילות תאי אנדותל המטוגנים אנושיים מתאי גזע עובריים.
- השיטה מקלה על ביצוע מחקרים in vitro של מעבר מאנדותל להמטופוייזה (endothelial-to-hematopoietic transition) ועל בקרה מולקולרית.
- היא מספקת פלטפורמה לייצור פוטנציאלי של מוצרי דם ex vivo ומפחיתה את התלות בתורמים אנושיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דיפרנציאציה מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים נותנת מענה לבקבוק קריטי במידול ההתפתחות ההמטופואטית וביצירת שושלות דם ex vivo. יכולת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של המעבר מהשלב האנדותלי לשלב ההמטופואטי, ותומכת בביטחון חיזוי בנתיבי עבודה של תרפיה תאית בשלבים מוקדמים ורפואה רגנרטיבית. התכנון של הפרוטוקול, שהוא ללא תאי מאכיל (feeder-free) וללא סרום, משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) עבור פורטפולי מו"פ ארגוניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולים מולקולריים השולטים במעבר מאנדותל לתאי המטופויזה (endothelial-to-hematopoietic transition).
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות עבור גורמים המשפיעים על קביעת שושלת דם.
- מסייע בהפחתת סיכונים חזויה של מטרות מועמדות בפיתוח ההמטופואטי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת אוכלוסיית תאים סטנדרטית ומאופיינת היטב עבור בדיקות תפקודיות המשך.
- מאפשרת הערכה כמותית של pembentukan מושבות המטופואטיות מסינאפטורים מוגדרים.
- תומכת בסריקה הדירה של מודולטורים המשפיעים על גורל אנדותליאלי או המטופואטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקימה פלטפורמה למידול פגמים המטופרופואטיים רלוונטיים למחלה in vitro.
- מאפשרת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות ליצירת תאי דם.
- תומכת בקידום מותאם-סיכון של קונספטים טיפוליים מבוססי תאים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות ליצירה ובידוד עמידים של תאי אנדותל המוגנים (hemogenic endothelial cells) לצורך מחקרים מכניסטיים ובדיקות תפקודיות.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת היפותזות על ויסות מולקולרי של הופעת שושלות דם.
- סריקה: מספק תוצרי יצירת מושבות כמותיים הניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליזה: מספק סינון (gating) מבוסס פלו-ציטומטריה וכמותיות מושבות לקבלת קריאות אובייקטיביות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מידול in vitro להערכה פרה-קלינית של פוטנציאל המטופואטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע מערכת ניתנת להרחבה ללא תאי מאכל (feeder-free), הניתנת להתאמה למגוון קווי תאי גזע ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודלים של שושלות המטופ oi-פואטיות ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של זרימות עבודה של התמיינות תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go עבור תוכניות של תרפיה תאית ורפואה רגנרטיבית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפולים מבוססי תאים בשלבים מוקדמים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ובפרוטוקולי גזירה.
- מחייב גישה למכשור ציטומטריה של זרימה למיון תאים רב-פרמטרי.
- מצריך סטנדרטיזציה בין צוותים של אסטרטגיות גייטינג (gating) וכמותיות מושבות.
- ניתן להתאמה לקווי תאי גזע אנושיים שונים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בפאנלים מאושרים של נוגדנים ובבדיקות תפקודיות מבוססות מתילצלולוז.
