Name: פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: למד הכנת פרוסות ריאות חתוכות מדויקות מעכברים לחקר מבנה כלי הדם והתכווצותם. שיטה זו שומרת על ארכיטקטורת הריאה התלת-ממדית ומאפשרת הדמיה חיה וניתוח מולקולרי של מחלות ריאה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר יואן האו וקייפנג ליו על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01 HL150106-01A1, מלגת פארקר ב פרנסיס, ואת פרס מחקר אלדריגטי האגודה ליתר לחץ דם ריאתי לד"ר Ke יואן.

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של בית החולים לילדים בבוסטון וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית אישרה פרוטוקולים. העכברים המשמשים במחקר זה הם עכברי C57/B6 מסוג בר ו- Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato חצה עכברים.
1. הכנת פתרונות
<ol><li>הכן פתרון חיץ פוספט (1x PBS) ופתרון אגרוז 2% הנדרש במהלך הניסוי מראש.<ol>
<li>מערבבים 2 גרם אבקת אגרוז ל-100 מ"ל של מים משועבדים אוטומטית. מחממים אותו במיקרוגל כמה שניות בכל פעם עד הפתרון ברור.</li>
		<li>מניחים את הפתרון באמבט מים ב 42 °C (50 °F) עד השימוש. הערה: ניתן לאחסן הן PBS והן 2% אגרוז בטמפרטורת החדר במשך שבועות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מיצוי של ריאה העכבר
<ol><li>להרדים את העכבר על ידי מנת יתר איזופלוריין. להשיג מנת יתר איזופלורן על ידי הצבת כמות קטנה של איזופלוראן על נייר טישו במפלס התחתון והצבת העכבר במפלס העליון בחיטוי. העכבר נשאר בחיטוי עד שהוא מחוסר הכרה.</li>
	<li>להבטיח את מותו של העכבר על ידי הפעלת לחץ נחות על הצוואר ומשיכת caudal על הזנב. הבא את העכבר למשטח הניתוח.</li>
	<li>הנח את העכבר בתנוחת העפר והבטח אותו במקום הדבקת כפות רגליים ואף לשולחן עם סרט הדבקה.</li>
	<li>לרסס את פני השטח הגחון של העכבר עם 70% אתנול ולנגב את האתנול עודף.</li>
	<li>הרם את עור הבטן של העכבר עם מלקחיים במיקום של שלפוחית השתן לחתוך בקו האמצע עם מספריים כירורגיים, נע מעולה לאזור צוואר הרחם, חשיפת קנה הנשימה.</li>
	<li>הרם את השכבה הפאשיאלית הבסיסית עם פינצטה וחתוך עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף איברים קרביים ותא mediastinal, שוב חיתוך נחות מעולה.</li>
	<li>תחתוך את החזה בקו האמצע כדי לחשוף את הלב והריאה.</li>
	<li>באמצעות ניתוח קהה, לנתק את הסרעפת מן הכבד ותא הבטן.</li>
	<li>אתר את הוועד הנעית הנחות (IVC) מתחת למעיים וחתוך את ה- IVC.</li>
	<li>אתר את החדר הימני. הערה: החדר הימני יהיה מראה קל יותר בהשוואה לחדר השמאלי ואת המחיצה intraventricular צריך להיות חזותי, הפרדת החדר הימני מן החדר השמאלי.</li>
	<li>הזריקו 0.5 מ"ל של הפרין חלקי של 1% לחדר הימני עם מחט פרפר 25-30 גרם ואז שטפו לאט אך בהתמדה עם 10-15 מ"ל של 1x PBS(איור 1A).<ol>
<li>היזהר לא להכניס את המחט דרך הלב ולהזריק הפרין לתוך חלל החציון. הערה: ההזרקה של 1x PBS הופכת את רקמת הריאה ללבן. נוזל extravasating מאבי העורקים הבטן צריך להיות ברור וחסר צבע הכבד עשוי להיות לבן במראה לאחר שטיפה מוצלחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אתר את הגרון ונותח את הפאסיה והרקמות שמסביב באמצעות פינצטה קהה.</li>
	<li>מניחים את התבר הכירורגי מתחת קנה הנשימה וקושרים קשר כירורגי באופן רופף.</li>
	<li>מניחים חור קטן בקנה הנשימה עדיף על חוט ו canulate עם 20 G מחט קהה.</li>
	<li>הדקו את התיל סביב המחט ו קנה הנשימה באמצעות קשר כירורגי.</li>
	<li>הזריקו 2.5-4 מ"ל של אגרוז לתוך קנה הנשימה ופקחו על אינפלציית הריאה.</li>
	<li>לאחר אגרוז הוא החדיר, לשפוך קר, מצונן 1x PBS מעל הריאה כדי לחזק את אגרוז.</li>
	<li>חותכים את קנה הנשימה העליון על התפר כירורגי לנתח את הריאה והלב מן mediastinum על ידי הסרת כל הידבקויות fascia.</li>
	<li>לאחר התגבשות, מניחים ב- 1x DMEM (מספיק כדי להטביע רקמה) בצלחת פטרי כדי לשמור על קרח. פרוס מיד אונה אחת באמצעות מכונת ויברטום(איור 1B).</li>
</ol>3. פרוסות ריאות חתוכות במדויק
<ol><li>חבר את המדגם לפלטפורמה באמצעות דבק-על, תוך שמירה על הצד המהודד של המדגם פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>מלא את מיכל המדגם עם 1x PBS, להבטיח כי המדגם הוא שקוע לחלוטין.</li>
	<li>מלא את המיכל המקיף את מיכל הדגימה בקרח כדי לשמור על PBS שמסביב לדגום קר.</li>
	<li>הפעל את הוויברטום והסתגל להגדרות הרצויות להלן.<ol>
<li>הגדר את העובי ל 300um.</li>
		<li>הגדר את התדר ל- 100 הרץ.</li>
		<li>הגדר את המשרעת ל 0.6 מ"מ.</li>
		<li>הגדר את המהירות ל 5 מיקרומטר /s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעזרת מפתח ברגים של אלן, הפכו את מחזיק הלהב לתנוחה הבטוחה ופתחו את הלסתות כדי להכניס להב.</li>
	<li>הדקו את הלסתות עם מפתח ברגים של אלן והפכו את מחזיק הלהב לתנוחה המתאימה לתחינה.</li>
	<li>הנח את הדגימה ואת הפלטפורמה על הקופסה והחליק לפני הלהב.</li>
	<li>מלא את התיבה סביב פלטפורמת המדגם ב- 1x PBS עד שהדגימה שקועה.</li>
	<li>מביאים את להב הוויברטום לקצה הבלוק ומנמיכים ידנית את הלהב עד שהוא אפילו עם החלק העליון של הדגימה.</li>
	<li>אשרו את ההגדרות המתאימות והפעילו את הוויברטום(איור 2).</li>
	<li>כאשר פרוסות טריות נחתכות, הסר את הדגימות מן PBS ומניחים אותם לתוך צלחת פטרי סטרילי עם 10 מ"ל של 1x DMEM המכיל 1x אנטי-ממיקוטי אנטישמי.</li>
	<li>בסיום, לסגת הלהב לחלוטין ולאחר מכן להשתמש מפתח ברגים אלן להרים את הלהב למצב בטוח.</li>
	<li>לאחסן את הדגימות ב 1x DMEM באינקובטור ב 37 °C עם הכדאיות נשמר עד 10 ימים (ראה ניסוי קיימא להלן).</li>
</ol>4. ניסוי נסוקונסטרי לדוגמה
<ol><li>הנח פרוסת רטט על שקופית מיקרוסקופ.</li>
	<li>לפני הנחתו על השקופית, השתמש במחיק ניקוי כדי להיפטר מהמדיום העודף (PBS).</li>
	<li>מקם את המדגם תחת מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה והשתמש בהגדלה של פי 10-20 כדי לזהות כלי שיט.</li>
	<li>שים 500 μL של vasoconstrictors, כגון 60 mM KCl או 1 μM אנדותלין-1 כדי להטביע לחלוטין את השקופית.</li>
	<li>צפה ולכוד את הווידאו על ידי הקלטה עבור 30 s-60 s(וידאו 1).</li>
</ol>5. הכנת הרקמה ל-RNA או לתזה של חלבון ב-PCLS
<ol><li>לפני תחילת הניסוי, מלאו קופסת קצף פוליסטירן קטנה ב-1 ליטר של חנקן נוזלי.</li>
	<li>מניחים שני צינורות מיקרוצנטריפוגה קטנים (1.5 מ"ל) במיכל עם חנקן נוזלי לפני תחילת. הערה: חנקן נוזלי צריך להתקרר מחוץ לצינורות, עם זאת, לא להיות בפנים. הקפד לטפל חנקן נוזלי בזהירות ולא לחשוף את העור חנקן נוזלי. השתמש במלקחיים ובכפפות כדי למקם ולהסיר צינורות מהקופסה.</li>
	<li>מניחים 4-5 פרוסות רטט טריות בקערת מרגמה.</li>
	<li>יוצקים 5-10 מ"ל של N2 נוזלי על גבי הפרוסות בקערת המרגמה.</li>
	<li>השתמשו במהירות במעלה כדי לטחון את פרוסות ההקפאה של הפלאש לאבקה לפני שהחנקן הנוזלי מתאדה. הערה: רקמה צריכה לדחוס לאבקה דקה. אם לא, מוסיפים חנקן נוזלי נוסף עד להשגת.</li>
	<li>בעזרת כף מדידה של מעבדת פלדה (עם חנקן נוזלי), יש לגרוף את האבקה לתוך שני צינורות המיקרוצנטריפוגה המצוננים.</li>
	<li>Lyse האבקה על ידי הוספת 500 μL של ריאגנט מיצוי RNA להמשיך עם בידוד RNA או 500 μL של מאגר RIPA (מכיל מעכבי פרוטאז 1x) כדי להמשיך עם תמוגת חלבון.</li>
	<li>יש לאחסן את הדגימות ב-80 °C (80 °F) עד לבידוד RNA נוסף, מדידת BCA וכתם מערבי.</li>
</ol>6. קביעת הכדאיות
<ol><li>לאחר הכנת ויברטום, מניחים שתי פרוסות ריאות לתוך צלחת תרבית 24-well עם 450 μL של מדיה DMEM ו 50 μL של ריאגנט הכדאיות התא (להבטיח כי הרקמה שקועה לחלוטין).</li>
	<li>מחזירים את הדגימות ל-5% CO2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם חשיפה מינימלית לאור.</li>
	<li>בבוקר, התבונן בפתרון לשינוי צבע. הפתרון הכחול הופך ורוד כאשר הרקמה היא בת קיימא.</li>
</ol>7. שימור תיוג תאים
<ol><li>לטפל Cdh5-CreERT2 מהונדס חצה עם עכבר Ai14 tdTomato עם הזרקת IP של טמוקסיפן (2 מ"ג ליום) במשך סך של 5 ימים (מינון כולל 10 מ"ג טמוקסיפן) כדי לגרום tdTomato תווית Cre תאים חיוביים.</li>
	<li>שבוע לאחר ההזרקה, להכין את הריאות באמצעות השלבים לעיל 1 עד 3.</li>
	<li>לאחר הכנת פרוסת הריאות החתכה במדויק, מניחים את הרקמה על שקופית מיקרוסקופ ומניחים כיסוי על גבי הרקמה.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות כתמי tdTomato (באמצעות אורך גל עירור 555 ננומטר).</li>
</ol>

<ol><li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Gerontology+%26+Geriatrics%22%5BJournal%5D)">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li>
<li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+%283D-LTCs%29+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437(2019).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).</li>
<li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lung+slices%3A+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li>
<li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li>
<li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li>
<li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li>
<li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li>
<li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902(2019).</li>
<li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698(2011).</li>
<li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT%2C+ACH%2C+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li>
<li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128(2014).</li>
<li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitial+dissection%3A+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+Cardiovascular+and+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li>
<li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), Bethesda, Md. 1119-1124 (2005).</li>
<li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li>
<li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 72 (3), Hoboken, N.J. 477-487 (2020).</li>
<li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Ca2%2B+sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+function+and+endothelin-1%3A+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), Bethesda, Md. 354-360 (2017).</li>
<li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li>
<li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2%2B+from+intracellular+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, Dallas, Tex. 222-227 (1997).</li>
<li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בכתב יד זה, שיטה משופרת לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמת ריאה מורינה המשמרת את מבנה כלי הדם ומייעלת את הגמישות הניסיונית מתוארת, במיוחד באמצעות היישום של PCLS כדי להשיג microslices של רקמת ריאה שניתן לראות בשלושה ממדים עם התכווצות השתמרה של כלי הדם. באמצעות ריאגנט הכדאיות, הפרוטוקול מדגים כי פרוסות מוכנות בקפידה ונשמר יכול לשמור על הכדאיות במשך יותר משבוע. הכדאיות המשומרת של microslices מאפשרת את האפשרות לניסויים מרובים וממושכים להתבצע על vasculature ומבני דרכי הנשימה, מה שהופך אותו מדגם אידיאלי כדי לבדוק את התגובה <...

ההתקדמות בהכנת והדמיה של רקמת ריאה המשמרת רכיבים תאיים מבלי להקריב מבנה אנטומי מספקת הבנה מפורטת של מחלות ריאות. היכולת לזהות חלבונים, RNA ותרכובות ביולוגיות אחרות תוך שמירה על מבנה פיזיולוגי מציעה מידע חיוני על הסידור המרחבי של תאים שיכולים להרחיב את ההבנה של הפתופיזיולוגיה במחלות ריאות רבות. תמונות מפורטות אלה יכולות להוביל להבנה טובה יותר של מחלות כלי דם ריאתיים, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, כאשר הם מוחלים על מודלים של בעלי חיים, מה שעלול להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.
למרות ההתקדמות הטכנולוגית, השגת תמונות באיכות גבוהה של רקמת ריאה מורינה נותרה אתגר. מחזור הנשימה מונע על ידי לחץ תוך-אתורי שלילי שנוצר במהלך שאיפה1. כאשר באופן מסורתי להשיג ביופסיות והכנת דגימות ריאות להדמיה, שיפוע הלחץ השלילי הולך לאיבוד וכתוצאה מכך קריסת דרכי הנשימה vasculature, אשר כבר לא מייצג את עצמו במצב הנוכחי שלה. כדי להשיג תמונות מציאותיות המשקפות את התנאים הנוכחיים, יש לנפח מחדש את דרכי הנשימה הריאתיות, ואת כלי השיט, שינוי הריאה הדינמית לתוך מתקן סטטי. היישום של טכניקות ייחודיות אלה מאפשר שימור של שלמות מבנית, כלי דם ריאתי, ורכיבים תאיים, כולל תאים חיסוניים כגון מקרופאגים, המאפשר רקמת ריאה להיות גלוי קרוב ככל האפשר למצבה הפיזיולוגי.
חיתוך ריאות מדויק (PCLS) הוא כלי אידיאלי לחקר האנטומיה והפיזיולוגיה של כלי הריאות2. PCLS מספק הדמיה מפורטת של רקמת הריאה בשלושה ממדים תוך שמירה על רכיבים מבניים ותאיים. PCLS שימש במודלים של בעלי חיים ובני אדם כדי לאפשר תמונות חיות ברזולוציה גבוהה של תפקודים תאיים בשלושה ממדים, מה שהופך אותו לכלי אידיאלי לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות, למדוד התכווצות דרכי הנשימה הקטנות וללמוד את הפתופיזיקה של מחלות ריאות כרוניות כגון COPD, ILD וסרטןריאות 3. באמצעות טכניקות דומות, החשיפה של דגימות PCLS vasoconstrictors יכול לשמר את מבנה הריאות ואת התכווצות כלי הדם, שכפול בתנאי הפריה. יחד עם שמירה על התכווצות, דגימות מוכנות יכולות לעבור ניתוח נוסף כגון רצף RNA, כתם מערבי, וציטומטריית זרימה כאשר הם מוכנים כראוי. לבסוף, כתב צבע מסומן עם פלואורסצנטיות tdTomato לאחר קציר ריאות יכול לשמר תיוג לאחר הכנת microslices, מה שהופך אותו אידיאלי עבור מחקרי מעקב אחר תאים. השילוב של טכניקות אלה מספק מודל מתוחכם המשמר את הסידור המרחבי של תאים והתכווצות כלי שיכול להוביל להבנה מפורטת יותר של מפלי האיתות ואפשרויות טיפוליות פוטנציאליות במחלת כלי הדם הריאתי.
בכתב יד זה, רקמת הריאה המורינה של PCLS נחשפת ל vasoconstrictors, המדגימה שלמות מבנית שמורה והתכווצות כלי. המחקר מדגים כי הרקמה מוכנה ומטופלת כראוי יכול להישאר קיימא במשך 10 ימים. המחקר מדגים גם את שימור התאים עם פלואורסצנטיות אנדוגני (tdTomato), ומאפשר דגימות לספק תמונות ברזולוציה גבוהה של vasculature ריאתי וארכיטקטורה. לבסוף, תוארו דרכים לטפל ולהכין פרוסות רקמות למדידת RNA וכתם מערבי כדי לחקור מנגנונים הבסיסיים.

<table><tbody><tr><td>0.5 סמ"ק של הפרין מפוצל במזרק</td><td>BD</td><td>100 יחידות USP למ"ל</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>20 1/2 אינץ 'מד מחט קצה קהה לקנה הנשימה Cml</td><td>אספקת</td><td>90120050D</td><td></td></tr><tr><td>30cc מזרק</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנטי תמיסה</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>אוטומטי רוטט להב מיקרוטום</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כדאיות תא (alamarBlue)</td> <td>Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי</td><td>צייס</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle Medium ו-GLutaMAX, בתוספת 10% FBS, 1% Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>מרגמה ועלי</td><td>אמזון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה ומיצוי</td><td>Thermoscientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>תפר כירורגי 6/0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen, Thermofisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure נקודת התכה נמוכה Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>סט איסוף דם מכונף (מחט פרפר) 25-30G</td><td>BD</td><td>25-30G</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות ex vivo ולמחקרי התכווצות

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

ההדמיה של רקמת ריאה מורינית מספקת מידע מבני ותאי בעל ערך לגבי דרכי הנשימה הבסיסיות ו vasculature. עם זאת, שימור כלי הריאות המייצגים באמת תנאים פיזיולוגיים עדיין מציב אתגרים. בנוסף, התצורה העדינה של ריאות מורינה גורמת לאתגרים טכניים בהכנת דגימות לתמונות באיכות גבוהה המשמרות הן את הרכב התאים והן את הארכיטקטורה. באופן דומה, בדיקות התכווצות הסלולר יכולות להתבצע כדי לחקור את הפוטנציאל של תאים להגיב vasoconstrictors במבחנה, אבל בדיקות אלה אינם לשחזר את הסביבה המורכבת של הריאה שלם. בניגוד לבעיות טכניות אלה, ניתן ליישם את שיטת פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) כחלופה יעילה להדמיית רקמת ריאה בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ולשמש מודל קבלנות פונדקאית חיה עד 10 ימים. רקמות מוכנות באמצעות PCLS יש מבנה משומר אוריינטציה מרחבית, מה שהופך אותו אידיאלי ללמוד תהליכי מחלה ex vivo. המיקום של תאים אנדוגניים המסומנים ב- PCLS שנקטפו ממודל מורינה של כתב tdTomato שניתן לתמצית יכול להיות חזותי בהצלחה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר חשיפה vasoconstrictors, PCLS מדגים את השימור של התכווצות כלי הדם ואת מבנה הריאות, אשר ניתן ללכוד על ידי מודול לשגות זמן. בשילוב עם ההליכים האחרים, כגון כתם מערבי וניתוח RNA, PCLS יכול לתרום להבנה מקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ולהוביל להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיים.

כאשר נוסף לתאים או רקמה, ריאגנט הכדאיות משתנה על ידי הסביבה המפחיתה של רקמה בת קיימא והופך ורוד / אדום, הופך פלואורסצנטי מאוד. שינויי הצבעים המייצגים שזוהו מהיום 0-1 ומהיום 9-10 מוצגים באיור 3. כאמור, הפתרון התחיל בכחול והפך ורוד בן לילה, והפגין כדאיות. שינוי צבע מתרחש בדרך כלל בתוך 1-4 שעות; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בזמן ארוך יותר. כדי להיערך, נעשה שימוש בקורא לוחות כדי לקבוע את הספיגה של מדגם מוכן רטט ופרוסת ריאות קבועה של PFA 4%, המשמשת כשליטה. פתרונות שבהם דוגרו דגימות נקראו בספיגה של 56...

מוצג כאן פרוטוקול לשימור התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונה תלת ממדית מתוחכמת של כלי הדם הריאתי ודרכי הנשימה, אשר ניתן לשמר עד 10 ימים כי הוא רגיש הליכים רבים.

פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

שיטת פרוסות ריאות חתוכות מדויקות תשמור על המבנה והכיוון המרחבי בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ויכולה לשמש מודל פונדקאי חי לכלי שיט ומדידות התכווצות דרכי הנשימה. בשילוב עם הדמיה בזמן, כתם מערבי וניתוח RNA, פרוסות ריאות חתוכות במדויק תורמות להבנה המקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ומובילות להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיות. כדי להתחיל, מניחים את העכבר הבוגר המתחסד בתנוחה על-סופית ומאבטחים אותו במקום על ידי הדבקת כפות הרגליים והאף לשולחן עם סרט הדבקה.לרסס את פני השטח הגחון של העכבר עם 70%אתנול. השתמש במלקחיים כדי להרים את עור הבטן של העכבר במיקום של שלפוחית השתן ומספריים כירורגיים לחתוך בקו האמצע, נע מעולה לאזור צוואר הרחם כדי לחשוף את קנה הנשימה. לאחר מכן השתמש פינצטה כדי להרים את שכבת fascia הבסיסית ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לחשוף את האיברים הקרביים ותא mediastinal, שוב חיתוך נחות מעולה.תחתוך את החזה בקו האמצע כדי לחשוף את הלב והריאה. לנתח את הסרעפת בזהירות מהכבד ותא הבטן. אתר את הוועד הנתון הנחות מתחת למעיים וחתוך אותו.לאחר איתור החדר הימני, השתמש במחט פרפר 25 עד 30 מד כדי להזריק 0.5 מיליליטר של 1%הפרין מופרד לחדר הימני לשטוף אותו לאט אבל בהתמדה עם 10 עד 15 מילימטרים של PBS. לאחר איתור הגרון, השתמש פינצטה קצה קהה לנתח את fascia ורקמות שמסביב, ולאחר מכן למקם את התפר הכירורגי מתחת קנה הנשימה ולקשור באופן רופף קשר כירורגי. מניחים חור קטן בקנה הנשימה עדיפה על החוט ומתכרבלים עם מחט באורך 20 מד.הדקו את התיל סביב המחט ו קנה הנשימה באמצעות קשר כירורגי. לאחר מכן הזריקו 2.5 עד 4 מיליליטר של אגרוז לתוך קנה הנשימה ופקחו על אינפלציית הריאה. לאחר הזרקת אגרוז, לשפוך PBS קר על הריאה כדי לחזק את האגורז.לאחר מכן לחתוך את קנה הנשימה מעולה התפר הכירורגי לנתח את הריאה והלב מן mediastinum על ידי הסרת כל הידבקויות fascia. לאחר התגבשות, מניחים את הרקמה ב- DMEM בצלחת פטרי על קרח, ומיד ממשיכים לתוחך אונה אחת באמצעות מכונת ויברטום. כדי להכין את פרוסות הריאה, חבר את הדגימה לפלטפורמה עם דבק-על, תוך שמירה על הצד המהודל פונה כלפי מעלה.לאחר מכן מלא את הגורם המכיל לדוגמה ב- PBS. מלא את המיכל בקרח כדי לשמור על PBS שמסביב לדגום קר. תדליק את הוויברטום.כוונן את העובי ל-300 מיקרומטר, תדירות ל-100 הרץ, משרעת ל-0.6 מילימטרים ומהירות לחמישה מיקרומטר לשנייה. בעזרת מפתח ברגים של אלן, הפכו את מחזיק הלהב לתנוחה הבטוחה ופתחו את הלסתות כדי להכניס להב. ואז להדק את הלסתות עם מפתח ברגים אלן.הנח את הדגימה על הקופסה, והבטח שהיא שקועה ב- PBS. החלק את התיבה למעלה במיקום הנכון וודא שהיא מאובטחת. הפוך את מחזיק הלהב לעמדה המתאימה ל חיתוך.מביאים את להב הוויברטום לקצה הבלוק ומנמיכים ידנית את הלהב עד שהוא אפילו עם החלק העליון של הדגימה. אשר את ההגדרות והפעל את הוויברטום. לאחר פרוסות טריות נחתכות, להסיר את הדגימות מן PBS ומניחים אותם לתוך צלחת פטרי סטרילית עם 10 מיליליטר של DMEM המכיל אנטיביוטיקה אנטי-ממיקוטית חד פעמית.לאחר הנחת כל הפרוסות בצלחת פטרי, לסגת הלהב לחלוטין ולהשתמש מפתח אלן להרים את הלהב למצב בטוח. אחסן את הדגימות ב- DMEM ב 37 מעלות צלזיוס. ומניחים פרוסת ויברטום על שקופית מיקרוסקופ.השתמש במחיקה לניקוי כדי להסיר מדיום עודף. הנח את הדגימה על מיקרוסקופיית ניגודיות הפאזה והשתמש בהגדלה של פי 10 עד 20 כדי לזהות כלי שיט. לאחר מכן להוסיף 500 microliters של vasoconstrictors, כגון 60 מילימולר אשלגן כלורי או אנדותלין מיקרומולרי אחד כדי להטביע לחלוטין את השקופית.צפה ולכוד את הווידאו על-ידי הקלטה למשך 30 עד 60 שניות. לפני תחילת הניסוי, מלאו קופסת קצף פוליסטירן קטנה בליטר אחד של חנקן נוזלי והניחו שתי צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר במיכל עם חנקן נוזלי. מניחים ארבע עד חמש פרוסות רטט טריות בקערת מרגמה.יוצקים 5 עד 10 מיליליטר של חנקן נוזלי על גבי הפרוסות ולהשתמש במהירות עלה לטחון את הפרוסות לאבקה לפני החנקן הנוזלי מתאדה. השתמשו בסקופ מעבדת פלדה מצוננת מראש כדי לגרוף את האבקה לתוך שני צינורות מיקרוצנטריפוגה צוננים ולזר את האבקה על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של ריאגנט מיצוי RNA לבידוד RNA או 500 מיקרוליטרים של חיץ RIPA לתסיסת חלבון. בניסוי הכדאיות הייצוגית, שינוי הצבע של פרוסות PCLS זוהה מיום אפס ליום אחד ויום תשע עד 10.הפתרון היה בתחילה כחול והפך ורוד בן לילה, והפגין כדאיות. שינוי צבע מתרחש בדרך כלל בתוך שעה עד ארבע שעות, אך ייתכן שיהיה צורך בזמן ארוך יותר. ההבדל היומי בין ספיגה ב 562 ו 613 אורכי גל ננומטר עבור הרקמה מוכנה רטט מוצג כאן.התכווצות כלי העיון ברקמת ריאה מוכנה רטט באמצעות אנדותלין-1 ואשלגן כלורי ניתן לדמיין כאן. שימור תיוג tdTomato בתאים שבוע לאחר הזרקת טמוקסיפן מוכח בפרוסות ריאות אלה. חשוב ביותר לבצע את ניקוי הריאות ואת צעד האינפלציה היטב כדי להסיר את כל הדם מהמחזור לפני ניסויים נוספים והדמיה.בנוסף למחלות כלי דם, ניתן ליישם PCLS כדי לחקור פיזיוביולוגיה של מחלות הקשורות דרכי הנשימה, וניתן לבדוק עוד יותר על רקמות הריאה האנושית בתרחישים רלוונטיים מבחינה קלינית.

precision-cut-lung-slices-as-an-efficient-tool-for-ex-vivo-pulmonary

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה אנו מתארים הליך לניפוח ריאות אנושיות מבודדות באגרוז והכנת פרוסות ריאה אנושיות חתוכות במדויק. פרוסות הריאות המוכנות ex vivo יכולות לשמש לניסויים אימונולוגיים נוספים.

הכנה מבוססת אגרוז של פרוסות ריאה חתוכות בדייקנות אנושית

איזוקונסטריאקציה ריאתי היפוקסית (HPV) היא תופעה פיזיולוגית חשובה שבאמצעותה ב זלוף ריאות היפוקסיה מכתשי מותאם אוורור. מגזר כלי הדם העיקרי התורם ל- HPV הוא העורק התוך-אציני. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לניתוח של HPV של כלי ריאות מורין עם קטרים של 20-100 מיקרומטר.

ניתוח וידאומורפומטרי של Vasoconstriction ריאתי היפוקסי של עורקים תוך ריאתי באמצעות מוריס דיוק לחתוך פרוסות ריאות

אנו מתארים שיטה לייצור פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS) ו immunostaining להם לדמיין את הלוקליזציה של סוגי תאים שונים חיסוניים הבריא. פרוטוקול שלנו ניתן להאריך לדמיין את המיקום והתפקוד של סוגי תאים שונים תחת מגוון של תנאים.

Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

אזור פני השטח הפנימי של הריאות (ISA) הוא קריטריון קריטי להערכת מורפולוגיה ריאות ופיזיולוגיה במחלות ריאה ו-התחדשות שנגרם על ידי פציעה. אנו מתארים כאן שיטה סטנדרטית שיכולה למזער את הטיה המדידה עבור השב"כ הן ריאות pneumonectomy ריאות מודלים השתלת עכבר פרוטה.

שיטה מתוקננת למדידת שטח הפנים של הריאות הפנימיות באמצעות דלקת ריאות של עכבר והשתלת תותב

על רקע העיקרון 3Rs, מודלים הנשימה חלופות מחקרים שנעשו בבעלי חיים כמו מתפתחים. במיוחד עבור הערכת סיכונים מחומרים בדרכי הנשימה, יש מחסור של מבחני המתאים. כאן, אנו מתארים את השימוש אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות להערכה לחומרים הנישאים באוויר.

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות בקנה מידה קטן הניתנות לשחזור, על-ידי אכלוס מחדש של פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת עם תאי אפיתל מסוג 2, פיברובלסטים ותאי אנדותל.

רקמות ריאה מהונדסות שהוכנו מפרוסות ריאה נטולות תאים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .

שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

פיתחנו טכניקת עיבוד רקמות המשתמשת ברקמת ריאה משובצת ויברטומה ואגרוז ליצירת קטעי ריאה, ובכך אפשרנו רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ריאות. השתמשנו בצביעת אימונופלואורסנציה כדי לצפות בביטוי חלבונים מרחבי באמצעות סמנים מבניים ספציפיים של הריאה.

חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וחסכוני לביצוע כימות בלתי משוחד של צפיפות כלי הדם הריאתיים עבור רקמת ריאה של עכברים שלמים באמצעות צביעה יחידה של איזולקטין B4.

כימות צפיפות כלי הדם הריאתיים בעכברים על פני אונות

ניתוח תמונה ברשתית הוא הליך לא פולשני המאפשר הדמיה זרימת הדם. ההשפעה של גורמי סיכון למחל לב וכלי דם יכולה לגרום לשינויים של קליבר כלי רשתית. הנהלים לרכוש תמונות הפונדוס וצעדים לחישוב הכלי בקליבר מתוארים.

צילום קרקעית העין ככלי נוח ללמוד תגובות כלי הדם לגורמי סיכון קרדיווסקולריים מחלות באפידמיולוגיים לימודים

למד הכנת פרוסות ריאות חתוכות מדויקות מעכברים לחקר מבנה כלי הדם והתכווצותם. שיטה זו שומרת על ארכיטקטורת הריאה התלת-ממדית ומאפשרת הדמיה חיה וניתוח מולקולרי של מחלות ריאה.

פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות

גלה סרטונים נוספים