כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

מטרת הפרוטוקול הזה היא לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי Drosophila. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים בתאי פוליטן הנמצאים בבלוטות הרוק של זחלי אינסטאר שלישי הגנום של תאים אלה מוגבר כמעט אלף פעמים, והכרומוזומים משמרים את התכונות של תאי ממשק. יש להם טלומרים מוגדרים היטב, וגשרים הנקראים כרומוסנטר שבהם כל הצנטרומרים מצטברים, וזה בעיקר הטרוקרומטי.

באמצעות רקמת הזחלים השלישית, מאפשר לנו גם להעריך את השינוי במצטברים ההטרוכרומטיים ברקע של מוטציות גנטיות שונות. כדי לייעל את תרבות הזחלים השלישית, יהיה עליך קודם לאסוף מבוגרים בני 5 עד 10 ימים, ולשים סביב 50 בבקבוק צוואר רחב של מדיה סטנדרטית. 25 גברים ו-25 נשים.

מניחים את הבקבוק באינקובטור טמפרטורה מבוקר ב 25 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר זמן הדגירה נגמר, להסיר את המבוגרים ולהעביר אותם לבקבוק חדש לחזור על ההליך. תן לעוברים לגדול ב 18 מעלות צלזיוס במשך 22 שעות.

עבור אוסף זחלים, הקפד לבחור את הזחלים הנודדים, אשר אין כדורי גלוי. לנתח 15 זוגות של בלוטות רוק, או ככל שאתה יכול בתקופה של 30 דקות PBS קר עם מעכבי מחאה מתחת למיקרוסקופ. מעבירים את בלוטות הרוק לצינור אחר עם PBS קר כקרח.

לשטוף פעם אחת עם PBS קר בתוספת מעכבי מחאה. זכור, תמיד לחכות לרקמה להגיע לתחתית הצינור. לאחר הסרת PBS מהשלב האחרון, להוסיף ישירות 0.5 מיליליטר של מאגר קיבוע חניכיים קבוצתי X אחד ו 50%מתנול בתוספת 2%פורמלדהיד.

דגירה במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב קל. בצע שטיפה סיבוב אחת חמש דקות עם חוצץ טריס-טריטון, הוספת מיליליטר אחד. תמיד לחכות לרקמה להגיע לתחתית הצינור.

הערה:המתן עד שהרקמה תגיע לתחתית הצינור. לדגור על בלוטות הרוק עם טריס-טריטון, כמו לעיל, בתוספת 1% של מרקפטואתנול בטא במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל. לשטוף עם חוצץ BO3, ודגורה עם BO3 בתוספת 10 מילימולר DTT ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל במשך 15 דקות.

בסוף תקופת הדגירה, לבצע לשטוף עם מיליליטר אחד של חוצץ BO3 לבד. לדגור את בלוטות הרוק במיליליטר אחד של חוצץ B במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם סיבוב. הסר את כל המאגר B והוסף מאגר A בתוספת נוגדן עניין.

במקרה זה, אנו משתמשים HP אחד, C 18 9 מבנק אירידיום. 1 ל-3,000 בלילה בארבע מעלות עם סיבוב. בשלב זה חשוב כי הרעידות לא להעלות בועות, אשר עלול לפגוע בנוגדן.

תן פינוק על ידי 15 דקות שטיפות עם חוצץ B, תחת ערבוב בטמפרטורת החדר באמצעות מילימטר אחד בכל פעם. הבלוטות מועברות חוצץ B יחד עם זוג אנטיביוטיקה משני לרצפה להפנות במשך שעתיים, תחת סיבוב בארבע מעלות. בשלב זה, חשוב לכסות את הצינור בנייר נייר אלומיניום כדי להגן על הנוגדן המשני מפני האור.

בצע מכונות כביסה 2x15 דקות בטמפרטורת החדר, תוך סיבוב עם מיליליטר אחד של חוצץ B.Incubate עם סמן DNA כגון Sydox או OH, ולהמיס מיליליטר אחד של חוצץ B במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב. בצע לשטוף אחד עם חוצץ B ופעם אחת עם PBS, כל לשטוף נמשך 10 דקות, תוך סיבוב בטמפרטורת החדר. לבסוף, לעלות על בלוטות הרוק על שקופית, מה שהופך בריכה עם פתק כיסוי.

שים את בלוטות הרוק באמצע הבריכה לכסות עם Sidiflor. כדי למנוע עיוות של בועה, הרחבת הנוזל הצמיג בכל מקום. לאחר מכן, לאטום את כל השקופיות עם לק ברור.

שימו לב תחת פלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי. אם המדגם לא הולך להיות נצפה באותו יום, אז לאחסן מהאור בארבע מעלות. תוצאות מייצגות של HB1 monostaining בבלוטות הרוק Drosophila מוצגים באיור אחד.

תוצאה חיובית היא להתבונן בנקודת מוקד אחת כמו ב- A, צבירה כרומטית אתרו או עיבוי. תוצאה שלילית היא לא אות או אות מפוזר. לפעמים, אות כפול ניתן לראות כמו נקודה כפולה ב- C, אבל בדרך כלל מתרחש בכמויות קטנות יותר.

כדי לנתח את הנתונים שניתן לייצג כגרף עמודות, השוואת ההתפלגות של HP1 עם רקעים מוטנטיים שונים. לדוגמה, באיור השני, אנו יכולים לראות כי 98% מהגרעין מציגים התפלגות של נקודה אחת. ו-2% משני מוקדים בסוג פראי.

במוטנט, השיעור השתנה, ונוכחותם של שני מוקדים גדלה ל-40% איור שלוש מראה ליצין 9H3 מייצג בשחור-ממד. התוצאה של בלוטות הרוק של Drosophila התבוננות בנקודת מוקד אחת ב- B, זוהי תוצאה חיובית במצטבר הכרומטי או עיבוי, אות כפול או משולש ב- C ניתן לראות במקרים נדירים, אך בכמויות קטנות. בסוף פרוטוקול זה, תוכל לראות עיבוי דיכרומטי של חלבון HP1 למרות מגבלות המדינה, זו תהיה גישה ראשונה טובה.