Name: כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: למד הדמיה של צבירי הטרוכרומטין בתאי פוליטן בבלוטות הרוק של Drosophila באמצעות HP1 ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעת מוטציות גנטיות על ארגון הכרומטין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרקו אנטוניו רוסאלס וגה ואייבל סגורה על שלקחו חלק מהתמונות הקונפוקליות, כרמן מוניוז על ההכנה לתקשורת וד"ר ארתורו פימנטל, מ.C ארנס סרלגי וד"ר כריס ווד מה- LMNA לקבלת ייעוץ על השימוש במיקרוסקופים.

1. תרבות הזחלים השלישית
<ol><li>הכן 1 ליטר של מדיה סטנדרטית על ידי הוספת 100 גרם של שמרים, 100 גרם של סוכר קנים שלם מזוקק, 16 גרם אגר, 10 מ"ל של חומצה פרופיונית ו 14 גרם של ג'לטין. ממיסים את כל החומרים למעט השמרים ב 800 מ"ל של מי ברז ולאחר מכן להמיס את השמרים. יש לאלתר למשך 30 דקות.<ol>
<li>לאחר מכן, לתת את התקשורת להתקרר עד 60 °C (60 °F) ולהוסיף חומצה פרופיונית לריכוז הסופי 0.01%. תן לבקבוק לעמוד עד הג'לטין נוצר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לייעל את תרבות הזחלים ה-3o instar, אספו תחילה מבוגרים בני 5 עד 10 ימים והכניסו 50 (25 גברים ו-25 נקבות) לבקבוק רחב של מדיה סטנדרטית.</li>
	<li>מניחים את הבקבוק עם הזבובים באינקובטור טמפרטורה מבוקרת ב 25 °C (50 °F) עד מספר הביצים שהונחו הוא 50 (כ 12 שעות עבור זן סוג הבר).</li>
	<li>לאחר זמן הדגירה נגמר, להסיר את המבוגרים ולהעביר אותם לבקבוק חדש לחזור על ההליך. תן לעוברים לגדול ב 18 °C (72 שעות) הערה: למידע נוסף על תנאי התחזוקה של מניות Drosophila, ראה טנסין ותמימל13.</li>
</ol>2. אוסף זחלים
<ol><li>עבור אוסף זחלים לבחור את הזחלים הנודדים כי אין אי פעם spiracles. לאחר ההסתה של הספירקלים, הזחל נכנס לשלב הטרום-אפופל, תוך שמירה על כרומוזומי פוליטן מעולים המתאימים לניתוח. רק לאחר 12 שעות מתחילים התאים של בלוטת הרוק להתכונן למוות תאי מתוכנת14,15.</li>
	<li>קח 15 3° זחלים instar ולשים אותם בכוס שעון לשטוף אותם. לאחר מכן העבירו אותם לתמיסת מלח קרה כקרח או PBS (1x PBS: 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מNa 2HPO4, 2 מ"מ KH2PO4, כוונון pH ל 7.4).</li>
	<li>לנתח 15 עד 30 זוגות של בלוטות רוק (או רבים ככל האפשר ב 30 דקות) ב PBS קר עם מעכבי פרוטאז תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. מעבירים את בלוטות הרוק לצינור 1.5 מ"ל עם PBS קר כקרח.</li>
	<li>לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS בתוספת מעכבי פרוטאז. חכה שהרקמה תגיע לתחתית הצינור.</li>
	<li>לאחר הכביסה, להסיר את PBS עם 1000 μL pipette. יש להקפיד לא לגעת ברקמה.<ol>
<li>לחלופין, לנתח את בלוטות הרוק ב 5 מ"ל של PBS כדי לחסל את הצורך בשלב כביסה זה ולהמשיך לשלב 3 על ידי העברת בלוטות הרוק ל 0.5 מ"ל של רובקון תיקון חוצץ המתואר להלן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. קיבוע רקמת בלוטת הרוק
<ol><li>לאחר הסרת PBS מהשלב האחרון, הוסף ישירות 0.5 מ"ל של 1x Ruvkun תיקון חוצץ, עם 50% מתנול (להוסיף 0.5 מ"ל של מתנול) ו 2% פורמלדהיד. הערה: פתרון 2x Ruvkun הוא 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES ב pH 7.4.</li>
	<li>דגירה במשך 2 שעות ב 4 °C (5 °F) עם סיבוב מתון.</li>
</ol>4. שטיפת רקמות בלוטת הרוק
<ol><li>בצע שטיפת סיבוב אחת של 5 דקות עם 1 מ"ל של חיץ טריס/טריטון (100 mM Tris pH 7.4, 1% טריטון X-100 ו- 1 mM EDTA). הערה: המתן עד שהרקמה תגיע לתחתית הצינור.</li>
</ol>5. פרמזביליזציה
<ol><li>לדגור על בלוטות הרוק ב 1 מ"ל של טריס / טריטון X-100 (זהה לעיל). עבור חלבונים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להוסיף 1% β-mercaptoethanol.</li>
	<li>דגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל (300 סל"ד).</li>
</ol>6. שלב השימור (אופציונלי)
הערה: אם לא ממשיכים מיד לדגירה עם הנוגדן, לשמר את הרקמה כדלקמן.
<ol><li>לשטוף עם 1 מ"ל של BO3 חוצץ (0.01 M H3BO3 pH 9.2 + 0.01 M NaOH) ולאחר מכן דגירה BO3/10mM DTT ב 37 ° C עם רועד קל (300 סל"ד) במשך 15 דקות.</li>
	<li>בסוף תקופת הדגירה, בצע לשטוף עם 1 מ"ל של חיץ BO3 לבד. הערה: המתן עד שהרקמה תגיע לתחתית הצינור.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של PBS. שמור על הרקמה בתמיסה זו ב 4 °C (72 שעות) ולאחר מכן להמשיך עם השלב הבא. שלב זה מועיל במיוחד בעת עבודה עם זנים מוטנטיים שונים שעשויים להציג מחזור חיים מאוחר, כך שניתן לבצע את החיסון בו זמנית יחד עם הפקדים.</li>
</ol>7. חסימת רקמות
<ol><li>לדגור על בלוטות הרוק ב 1 מ"ל של חוצץ B (PBS + 0.1% BSA + 0.5% טריטון X-100 + 1 mM EDTA) במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.</li>
</ol>8. חיסונים
<ol><li>הסר את כל המאגר B והוסף מאגר A (PBS + 0.1% BSA) בתוספת נוגדן של עניין. הערה: אנו משתמשים ב- HP1a C1A9c (נוגדן מרוכז) מבנק Hybridoma עד השעה 1:3000. בעת שימוש C1A9s (supernatant) ניסינו מ 1: 100 כדי 1:500 דילול וכל דילול בין דרגה זו עובד טוב) לילה ב 4 oC עם סיבוב. בשלב זה חשוב כי הרעידות לא להעלות בועות אשר עלול לפגוע בנוגדן.</li>
</ol>9. כביסה חיסונית
<ol><li>בצע שטיפות של 3 x 15 דקות עם חוצץ B מתחת לבחוש בטמפרטורת החדר באמצעות 1 מ"ל בכל פעם.</li>
	<li>העבר את הבלוטות כדי חוצץ B יחד עם הנוגדן המשני בשילוב פלואורופור במשך 2 שעות תחת סיבוב ב 4 oC (נוגדן משני Alexa פלואור 568 Invitrogen שימשו 1:3000).<ol>
<li>לכסות את הצינור עם רדיד נייר אלומיניום כדי להגן על הנוגדן המשני מפני האור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצע 2 x 15 דקות שטיפות בטמפרטורת החדר תוך סיבוב עם 1 מ"ל של חוצץ B.</li>
	<li>דגירה עם סמן DNA כגון Sytox (לקחת 2 μL של 5 mM מלאי להתמוסס 1 מ"ל של חוצץ B) או Hoechst (לקחת 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל מלאי להתמוסס 1 מ"ל של חוצץ B) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.</li>
	<li>בצע לשטוף אחד עם חוצץ B ופעם אחת עם PBS, כל לשטוף נמשך 10 דקות תוך סיבוב בטמפרטורת החדר. הערה: זכור להגן עליו מפני האור.</li>
</ol>10. הדמיה
<ol><li>הר בלוטות הרוק על שקופית, מה שהופך בריכה עם כיסוי.</li>
	<li>שים את בלוטות הרוק באמצע הבריכה לכסות עם citifluor AF1 כדי למנוע היווצרות של בועות הרחבת הנוזל הצמיג בכל מקום. ואז לאטום את כל הצדדים עם לק ברור.</li>
	<li>שימו לב תחת פלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי. אם המדגם לא הולך להיות נצפה באותו יום, לאחסן הרחק מהאור ב 4 °C (50 °F).</li>
	<li>השתמש במנסרה של GraphPad 6 כדי ליצור את כל הגרפים ניתחוים סטטיסטיים.</li>
	<li>נתח את הנתונים מהפצת HP1a בבלוטות הרוק באמצעות בדיקת Kruskal-Wallis. משמעות סטטיסטית נקבעה ב ( p < 0.05 *, < 0.01 **, < 0.001**, < 0.0001****).</li>
</ol>

<ol><li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emil+Heitz%2C+a+true+epigenetics+pioneer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).</li>
<li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+function+for+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li>
<li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li>
<li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+markers%3A+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin%2C+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li>
<li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+%28VAR%293-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039(2002).</li>
<li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li>
<li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-effect+variegation%2C+heterochromatin+formation%2C+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li>
<li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li>
<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1%CE%B1+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li>
<li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li>
<li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li>
<li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li>
<li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin%3A+Lessons+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li>
<li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li>
<li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li>
<li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li>
<li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li>
<li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeti%2C+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene%2C+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li>
<li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p8%2FTTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li>
<li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li>
<li>Farkaš, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+%282%29gl-dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li>
<li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li>
<li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyteny%3A+still+a+giant+player+in+chromosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

הפונקציה התאית של אורגניזמים אאוקריוטים יכולה להגדיר את המבנה התלת-ממדי בתוך הגרעין, הנתמך על ידי אינטראקציות בין חלבונים שונים עם כרומטין ומולקולות שונות כולל RNA. בשלוש השנים האחרונות, העיבויים הביולוגיים שיש להם רלוונטיות, כולל הטרוצ'ורומטין, לקחו תפקיד בסיסי בקביעת הפרדת השלבים המקדמת את הארגון המרחבי הגרעיני המובהק של כרומטין פעיל ודכאני 16,17,18.
הטרוכרומטין חיוני לשמירה על תפקודי התא וזהותו. בע...

מאז המחקרים המוקדמים של אמיל הייץ1, הטרוכרומטין נחשב רגולטור חשוב של תהליכים תאיים כגון ביטוי גנים, הפרדה מיוטית ומיטוטית של כרומוזומים, ושמירה על יציבות הגנום2,3,4.
הטרוכרומטין מחולק בעיקר לשני סוגים: הטרוקרומטין מהווה המגדיר באופן אופייני רצפים חוזרים ונשנים, ואלמנטים הניתנים לתחלפתם הנמצאים באתרי כרומוזום ספציפיים כגון הטלומרים והצנטרומרים. סוג זה של הטרוכרומטין מוגדר בעיקר באופן אפיגנטי על ידי סימני היסטון ספציפיים כגון di או תלת-מתילציה של ליצין 9 של היסטון H3 (H3K9me3) ואת הכריכה של חלבון Heterochromatin 1a (HP1a)5,6. מצד שני, הטרוצ'ורומטין פקולטיבי ממקם דרך זרועות הכרומוזום ומורכב בעיקר גנים מושתקים התפתחותית7,8. חיסון של בלוקים הטרוצ'ורומטין בתאי metaphase, או תצפית של אגרגטים הטרוצ'ורומטין בתאים בין-פאזיים, חשף הרבה אור בהבנת היווצרות ותפקוד של אזורים הטרכוכרומטיים9.
השימוש Drosophila כמערכת מודל אפשר פיתוח של כלים חיוניים ללמוד הטרוצ'רומטין ללא שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית10. מאז התיאור של שינוי אפקט המיקום וגילוי חלבונים הקשורים להטרוכרומטין, כגון HP1a, ושינויים לאחר תרגום histone, קבוצות רבות פיתחו מספר טכניקות אימונוהיסטוכימיות המאפשרות הדמיה של אזורים הטרכוכרומטיים אלה10,11.
טכניקות אלה מבוססות על שימוש בנוגדנים ספציפיים המזהים חלבונים הקשורים להטרוכרומטין או סימני היסטון. עבור כל סוג תא ונוגדן, יש לקבוע את תנאי הקיבעון והחמלול באופן אמפירי. כמו כן, התנאים עשויים להשתנות אם נעשה שימוש בתהליכים מכניים נוספים כגון טכניקות מעיכה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש בבלוטות הרוק של Drosophila כדי לחקור מוקדים הטרוקרומטיים. בלוטות הרוק יש תאים רביטציה המכילים יותר מ -1,000 עותקים של הגנום, ובכך מספקים תצוגה מוגברת של רוב תכונות הכרומטין, למעט DNA לווין וכמה אזורים הטרכוכרומטיים אשר נמצאים תחת משוכפל. עם זאת, אזורי הטרוכרומטין מוצגים בקלות בתכשירי כרומוזום פוליטן, אך טכניקות העיוץ עלולות לעתים לשבש מתחמים אופייניים הקשורים לכרומטין או את ארכיטקטורת הכרומטין. לכן, אימונולוקלציה של חלבונים ברקמת בלוטת הרוק כולה יכול לעלות על ההשפעות הבלתי רצויות האלה. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לזהות מספר חלבונים הקשורים לכרומטין, והוכחנו כי פרוטוקול זה בשילוב עם מלאי Drosophila מוטציה יכול לשמש כדי ללמוד הפרעה הטרוקרומטין12.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Axygen MCT-150-C</td><td></td><td>מותג 11351904 לא קריטי</td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>AF1 Citifluor</td><td>Ted pella</td><td>19470</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>BSA, ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>Roche</td><td>10735078001</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>שלם, מעכבי פרוטאז Ultra EDTA-free פרוטאז מעכבים</td><td>Merck</td><td>5892953001</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Corning</td><td>CLS285022-200EA</td><td>22x22, מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>d9779</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>זכוכית שקופית</td><td>זהב</td><td>3011</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Baker</td><td>0084-01</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>8889</td><td></td></tr><tr><td>HP1a</td><td>Hybridoma Bank</td><td>C1A9</td><td>צורת מוצר&nbsp; תרכיז 0.1 מ"ל</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Baker</td><td>3040-01</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>בייקר</td><td>9070-03</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr>מותג<td>NaOH</td><td></td><td></td><td>לא קריטי</td></tr><tr>מותג<td>PIPES</td><td></td><td></td><td>לא קריטי</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>&nbsp; Labquake Tube Shaker</td></tr><tr><td>Thermo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>SmartBlock 1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Milipore</td><td>648311</td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>100 מ"ל, מותג לא קריטי</td></tr> <tr><td>& בטא;-מרקפטואתנול</td><td>ביו-ראד</td><td></td><td>1610710 25 מ"ל, המותג לא קריטי</td></tr></tbody></table>

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

הדמיה של אגרגטים הטרוכרומטינים על ידי חיסון יכול להיות מאתגר. רכיבים יונקים רבים של כרומטין נשמרים Drosophila melanogaster. לכן, זהו מודל מצוין ללמוד היווצרות ותחזוקה הטרוצ'ורומטין. תאים רב-תאיים, כגון אלה שנמצאו בבלוטות הרוק של זחלי אינסטאר D. מלנוגאסטר השלישי, מספקים כלי מצוין להתבוננות בכרומטין מוגבר כמעט אלף פעמים ואפשרו לחוקרים לחקור שינויים בהתפלגות הטרוכרומטין בגרעין. למרות התצפית של רכיבי heterochromatin יכול להתבצע ישירות בתכשירי כרומוזום פוליטן, לוקליזציה של חלבונים מסוימים ניתן לשנות על ידי חומרת הטיפול. לכן, הדמיה ישירה של הטרוקרומטין בתאים משלימה סוג זה של מחקר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את טכניקות החיסון המשמשות לרקמה זו, את השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים משניים, ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לבחון את אגרגטים הטרוקרומטין אלה בדיוק ובפרטים גדולים יותר.

תוצאות מייצגות של HP1a חיסוני בבלוטות הרוק של Drosophila מוצגות באיור 1. תוצאה חיובית היא להתבונן בנקודת מוקד אחת (איור 1a) (צבירה או עיבוי הטרכוכרומטי). תוצאה שלילית היא לא אות או אות מפוזר. לפעמים ניתן לצפות באות כפול, כלומר, עם נקודה כפולה (איור 1c), אך הוא מתרחש בדרך כלל בכמויות קטנות יותר.
ניתן לייצג ניתוח נתונים כופרפים של עמודות, תוך השוואת ההתפלגות של HP1a בתוך רקעים מוטנטיים שונים. לדוגמ...

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

מטרת הפרוטוקול הזה היא לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי Drosophila. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים בתאי פוליטן הנמצאים בבלוטות הרוק של זחלי אינסטאר שלישי הגנום של תאים אלה מוגבר כמעט אלף פעמים, והכרומוזומים משמרים את התכונות של תאי ממשק. יש להם טלומרים מוגדרים היטב, וגשרים הנקראים כרומוסנטר שבהם כל הצנטרומרים מצטברים, וזה בעיקר הטרוקרומטי.באמצעות רקמת הזחלים השלישית, מאפשר לנו גם להעריך את השינוי במצטברים ההטרוכרומטיים ברקע של מוטציות גנטיות שונות. כדי לייעל את תרבות הזחלים השלישית, יהיה עליך קודם לאסוף מבוגרים בני 5 עד 10 ימים, ולשים סביב 50 בבקבוק צוואר רחב של מדיה סטנדרטית. 25 גברים ו-25 נשים.מניחים את הבקבוק באינקובטור טמפרטורה מבוקר ב 25 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר זמן הדגירה נגמר, להסיר את המבוגרים ולהעביר אותם לבקבוק חדש לחזור על ההליך. תן לעוברים לגדול ב 18 מעלות צלזיוס במשך 22 שעות.עבור אוסף זחלים, הקפד לבחור את הזחלים הנודדים, אשר אין כדורי גלוי. לנתח 15 זוגות של בלוטות רוק, או ככל שאתה יכול בתקופה של 30 דקות PBS קר עם מעכבי מחאה מתחת למיקרוסקופ. מעבירים את בלוטות הרוק לצינור אחר עם PBS קר כקרח.לשטוף פעם אחת עם PBS קר בתוספת מעכבי מחאה. זכור, תמיד לחכות לרקמה להגיע לתחתית הצינור. לאחר הסרת PBS מהשלב האחרון, להוסיף ישירות 0.5 מיליליטר של מאגר קיבוע חניכיים קבוצתי X אחד ו 50%מתנול בתוספת 2%פורמלדהיד.דגירה במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב קל. בצע שטיפה סיבוב אחת חמש דקות עם חוצץ טריס-טריטון, הוספת מיליליטר אחד. תמיד לחכות לרקמה להגיע לתחתית הצינור.הערה:המתן עד שהרקמה תגיע לתחתית הצינור. לדגור על בלוטות הרוק עם טריס-טריטון, כמו לעיל, בתוספת 1% של מרקפטואתנול בטא במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל. לשטוף עם חוצץ BO3, ודגורה עם BO3 בתוספת 10 מילימולר DTT ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל במשך 15 דקות.בסוף תקופת הדגירה, לבצע לשטוף עם מיליליטר אחד של חוצץ BO3 לבד. לדגור את בלוטות הרוק במיליליטר אחד של חוצץ B במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם סיבוב. הסר את כל המאגר B והוסף מאגר A בתוספת נוגדן עניין.במקרה זה, אנו משתמשים HP אחד, C 18 9 מבנק אירידיום. 1 ל-3,000 בלילה בארבע מעלות עם סיבוב. בשלב זה חשוב כי הרעידות לא להעלות בועות, אשר עלול לפגוע בנוגדן.תן פינוק על ידי 15 דקות שטיפות עם חוצץ B, תחת ערבוב בטמפרטורת החדר באמצעות מילימטר אחד בכל פעם. הבלוטות מועברות חוצץ B יחד עם זוג אנטיביוטיקה משני לרצפה להפנות במשך שעתיים, תחת סיבוב בארבע מעלות. בשלב זה, חשוב לכסות את הצינור בנייר נייר אלומיניום כדי להגן על הנוגדן המשני מפני האור.בצע מכונות כביסה 2x15 דקות בטמפרטורת החדר, תוך סיבוב עם מיליליטר אחד של חוצץ B.Incubate עם סמן DNA כגון Sydox או OH, ולהמיס מיליליטר אחד של חוצץ B במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב. בצע לשטוף אחד עם חוצץ B ופעם אחת עם PBS, כל לשטוף נמשך 10 דקות, תוך סיבוב בטמפרטורת החדר. לבסוף, לעלות על בלוטות הרוק על שקופית, מה שהופך בריכה עם פתק כיסוי.שים את בלוטות הרוק באמצע הבריכה לכסות עם Sidiflor. כדי למנוע עיוות של בועה, הרחבת הנוזל הצמיג בכל מקום. לאחר מכן, לאטום את כל השקופיות עם לק ברור.שימו לב תחת פלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי. אם המדגם לא הולך להיות נצפה באותו יום, אז לאחסן מהאור בארבע מעלות. תוצאות מייצגות של HB1 monostaining בבלוטות הרוק Drosophila מוצגים באיור אחד.תוצאה חיובית היא להתבונן בנקודת מוקד אחת כמו ב- A, צבירה כרומטית אתרו או עיבוי. תוצאה שלילית היא לא אות או אות מפוזר. לפעמים, אות כפול ניתן לראות כמו נקודה כפולה ב- C, אבל בדרך כלל מתרחש בכמויות קטנות יותר.כדי לנתח את הנתונים שניתן לייצג כגרף עמודות, השוואת ההתפלגות של HP1 עם רקעים מוטנטיים שונים. לדוגמה, באיור השני, אנו יכולים לראות כי 98% מהגרעין מציגים התפלגות של נקודה אחת. ו-2% משני מוקדים בסוג פראי.במוטנט, השיעור השתנה, ונוכחותם של שני מוקדים גדלה ל-40% איור שלוש מראה ליצין 9H3 מייצג בשחור-ממד. התוצאה של בלוטות הרוק של Drosophila התבוננות בנקודת מוקד אחת ב- B, זוהי תוצאה חיובית במצטבר הכרומטי או עיבוי, אות כפול או משולש ב- C ניתן לראות במקרים נדירים, אך בכמויות קטנות. בסוף פרוטוקול זה, תוכל לראות עיבוי דיכרומטי של חלבון HP1 למרות מגבלות המדינה, זו תהיה גישה ראשונה טובה.

immunofluorescent-staining-for-visualization-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר,...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של מוח דרוזופילה טרנסגני להדמיה חד-תאית של תאי גליה. המוח מבטא חלבונים ממוקדי ממברנה המאוחים עם שילובים שונים של אפיטופים אנטיגניים תחת שליטת מערכת רקומבינאז ספציפית לגליה. המוחות המבודדים והקבועים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ספציפיים לאפיטופים האנטיגניים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. תיוג זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של תת-אוכלוסיות שונות של תאי גליה על פני אזורי מוח שונים.

צביעה אימונופלואורסצנטית של מוחות דרוזופילה להדמיה חד-תאית של תאי גליה

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למד הדמיה של צבירי הטרוכרומטין בתאי פוליטן בבלוטות הרוק של Drosophila באמצעות HP1 ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעת מוטציות גנטיות על ארגון הכרומטין.

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

גלה סרטונים נוספים