Name: ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למד שיטת צביעת אימונופלואורסצנציה לניטור דינמי של כלי רשתית בעכברים עם רטינופתיה מושרית חמצן. פרוטוקול זה מאפשר שימור שלמות הרשתית והשוואת תוצאות מדויקת בין עיניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל החברים מהמעבדה שלנו וממעבדת בעלי החיים של Zhongshan Ophthalmic Center על הסיוע הטכני שלהם. אנו מודים גם לפרופ' צ'ונקיאו ליו על התמיכה הניסיונית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC: 81670872; בייג'ינג, סין), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מענק מס '2019A1515011347), ופרויקט בניית בית חולים ברמה גבוהה ממעבדת מפתח המדינה לרפואת עיניים במרכז העיניים ז'ונגשאן (מענק מס '303020103; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין).

למחברים אין מה לחשוף.

הרגישות של עכברים ל- OIR מושפעת מגורמים רבים. לא ניתן להשוות בין גורים בעלי רקע גנטי וזנים שונים. בעכברי לבקנים BALB/c, כלי הדם צומחים מחדש לאזור ה-VO במהירות עם הפחתה משמעותית של ציצים ניאו-וסקולריים38, מה שמביא כמה קשיים למחקר. בעכברי C57BL/6 יש נזק מוגבר לפוטורצפטור בהשוואה לזן עכבר BALB/cJ39,40. כנ"ל לגבי סוגים שונים של עכברים מהונדסים41,42,43...

ניאו-וסקולריזציה של הרשתית (RNV), המוגדרת כמצב שבו כלי דם פתולוגיים חדשים מקורם בוורידים קיימים ברשתית, משתרעת בדרך כלל לאורך המשטח הפנימי של הרשתית וגדלה לתוך הזגוגית (או החלל התת-קרקעי בתנאים מסוימים)1. זהו סימן היכר ומאפיין נפוץ של רטינופתיות איסכמיות רבות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית (RVO) ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR)2.
תצפיות קליניות וניסיוניות רבות הצביעו על כך שאיסכמיה היא הגורם העיקרי לניאו-וסקולריזציה של הרשתית 3,4. ב- ROP, ילודים נחשפים לחמצן ברמה גבוהה באינקובטורים סגורים כדי להגדיל את שיעורי ההישרדות, שהוא גם מניע חשוב לעצירת צמיחת כלי הדם. לאחר סיום הטיפול, הרשתיות של תינוקות חווים תקופה היפוקסית יחסית5. מצבים אחרים נראים בחסימה של ורידים ברשתית מרכזית או מסועפת ב- RVO ונזק של נימי הרשתית נצפה גם אשר נגרמת על ידי מיקרואנגיופתיה ב PDR2. היפוקסיה מגבירה עוד יותר את הביטוי של גורמים אנגיוגניים כגון גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) דרך מסלול האיתות המושרה על ידי היפוקסיה-1α (HIF-1α) אשר בתורו מנחה את תאי אנדותל כלי הדם לגדול לתוך האזור ההיפוקסי וליצור כלי דם חדשים 6,7.
ROP הוא סוג של רטינופתיה שגשוגית וסקולרית בפגים וגורם מוביל לעיוורון ילדות8,9, המאופיין בהיפוקסיה ברשתית, ניאו-וסקולריזציה של הרשתית והיפרפלזיה סיבית10,11,12. בשנות ה-50 של המאה ה-20, חוקרים מצאו כי ריכוז גבוה של חמצן יכול לשפר באופן משמעותי את התסמינים הנשימתיים של פגים13,14. כתוצאה מכך, טיפול בחמצן היה בשימוש הולך וגובר בפגים באותה תקופה15. עם זאת, במקביל לשימוש הנרחב בטיפול בחמצן בפגים, שכיחות ה-ROP עלתה משנה לשנה. מאז, חוקרים קישרו חמצן ל-ROP, וחקרו מודלים שונים של בעלי חיים כדי להבין את הפתוגנזה של ROP ו-RNV16.
באדם, רוב התפתחות כלי הדם ברשתית מסתיימת לפני הלידה ואילו במכרסמים כלי הדם ברשתית מתפתחים לאחר הלידה, ומספקים מערכת מודל נגישה לחקר אנגיוגנזה בכלי הדם ברשתית2. עם ההתקדמות המתמשכת של המחקר, מודלים של רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) הפכו למודלים מרכזיים לחיקוי אנגיוגנזה פתולוגית הנובעת מאיסכמיה. אין מיני בעלי חיים ספציפיים במחקר של מודל OIR והמודל פותח במיני בעלי חיים שונים, כולל חתלתול 17, חולדה18, עכבר19, גור ביגל 20 ודג זברה21. כל המודלים חולקים את אותו מנגנון שבאמצעותו הם נחשפים להיפראוקסיה במהלך התפתחות הרשתית המוקדמת ולאחר מכן מוחזרים לסביבה הנורמוקסית. סמית' ואחרים הבחינו בכך שחשיפת גורי עכברים להיפרוקסיה מ-P7 במשך 5 ימים גרמה לצורה קיצונית של רגרסיה של כלי הדם ברשתית המרכזית והחזרתם לאוויר החדר ב-P12 עוררה בהדרגה ציצים ניאו-וסקולריים, שגדלו לכיוון הגוף הזגוגי19. זה היה דגם עכבר OIR סטנדרטי שנקרא גם כמודל סמית'. Connor et al. המשיכו לייעל את הפרוטוקול וסיפקו שיטה ישימה אוניברסלית לכימות האזור של VO (מחיקה של vaso) ו- NV (neovascularization) בשנת 2009, מה שהגדיל את הקבלה והניצול של מודל22. מודל עכבר OIR הוא עדיין המודל הנפוץ ביותר כיום בגלל גודלו הקטן, רבייה מהירה, רקע גנטי ברור, יכולת חזרה טובה ושיעור הצלחה גבוה.
בעכברים, כלי הדם ברשתית מתחילים לאחר הלידה עם צמיחה של כלי דם מראש עצב הראייה לתוך הרשתית הפנימית לכיוון ora serrata. במהלך התפתחות רשתית תקינה, כלי הרשתית הראשונים נובטים מראש עצב הראייה סביב הלידה, ויוצרים רשת מתרחבת (מקלעת ראשונית) המגיעה לפריפריה סביב היום שלאחר הלידה 7(P7)23. לאחר מכן כלי הדם מתחילים לגדול לתוך הרשתית כדי ליצור שכבה עמוקה, לחדור את הרשתית, וליצור רשת למינרית סביב השכבה הגרעינית הפנימית (INL) כמו באדם24. בסוף השבוע השלישי שלאחר הלידה (P21), פיתוח מקלעת עמוקה יותר כמעט הושלם. עבור מודל עכבר OIR, חסימת כלי הדם מופיעה תמיד ברשתית המרכזית בגלל התנוונות מהירה של מספר רב של רשתות כלי דם לא בשלות באזור המרכז במהלך חשיפה להיפרוקסיה. לכן, הצמיחה של neovascularization פתולוגי מתרחשת גם ברשתית ההיקפית האמצעית, שהיא הגבול של האזור שאינו זלוף ואת אזור כלי הדם. עם זאת, כלי רשתית אנושיים כמעט נוצרו לפני הלידה. באשר לפגים, הרשתית ההיקפית אינה וסקולרית לחלוטין כאשר היא נחשפת להיפרוקסיה25,26. אז חסימת כלי דם וניאו-וסקולריזציה מופיעות בעיקר ברשתית ההיקפית27,28. למרות הבדלים אלה, מודל OIR העכבר משחזר מקרוב את האירועים הפתולוגיים המתרחשים במהלך ניאו-וסקולריזציה הנגרמת על ידי איסכמיה.
ניתן לחלק את האינדוקציה של מודל OIR לשני שלבים29: בשלב 1 (שלב היפרוקסיה), התפתחות כלי הדם ברשתית נעצרת או מפגרת עם חסימה ורגרסיה של כלי הדם כתוצאה מהירידה ב- VEGF והאפופטוזיס של תאי האנדותל 24,30; בשלב 2 (שלב ההיפוקסיה), אספקת החמצן ברשתית תהפוך לבלתי מספקת בתנאי אוויר בחדר29, החיוניים להתפתחות עצבית ולהומאוסטזיס 19,31. מצב איסכמי זה גורם בדרך כלל לניאו-וסקולריזציה לא מפוקחת ולא תקינה.
נכון לעכשיו, שיטת המידול הנפוצה היא חשיפה לחמצן גבוה/נמוך לסירוגין: אמהות והגורים שלהן נחשפים ל-75% חמצן במשך 5 ימים ב-P7 ולאחר מכן 5 ימים באוויר החדר עד ש-P17 הדגים תוצאות דומות22, שהיא נקודת הקצה של אינדוקציה של מודל עכבר OIR. (איור 1). בנוסף להדמיית ROP, זה neovascularization פתולוגי בתיווך איסכמיה יכול לשמש גם כדי לחקור מחלות רשתית איסכמיות אחרות. המדידות העיקריות של מודל זה כוללות כימות השטח של VO ו- NV, אשר מנותחים מתוך תושבות שטוחות רשתית על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה או זלוף FITC-dextran. כל עכבר יכול להיחקר רק פעם אחת בגלל הפעולה הקטלנית. כיום, ישנן כמה שיטות לבחון שינויים דינמיים של כלי הדם ברשתית ברציפות במהלך תהליך של רגרסיה וסקולרית ואנגיוגנזה פתולוגית32. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של אינדוקציה של מודל OIR, ניתוח של תושבות שטוחות ברשתית, כמו גם זרימת עבודה של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) על עכברים אשר יהיה מועיל להשיג הבנה מקיפה יותר של שינויים דינמיים של כלי הדם במהלך שני שלבים של מודל עכבר OIR.

<table><tbody><tr><td>מזרק סטרילי 1 מ"ל</td><td>Solarbio</td><td>YA0550</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית והזרקה תוך-צפקית</td></tr><tr><td>1& פעמים; תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>&nbsp; FG701-01</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>2 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>MCT-200-C</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>48 צלחות-באר מרובות מטופלות TC שקופות</td><td>קורנינג</td><td>3548</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ דביקות</td><td>שונות</td><td></td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CC 2019</td><td>אדובי בע"מ</td><td></td><td>לניתוח תמונה</td></tr><tr><td>גז פחמן דו חמצני</td><td>מגוון</td><td></td><td>להקרבה</td></tr><tr><td>שקופית כיסוי</td><td>מגוון</td><td></td><td>להכנת תושבות שטוחות רשתית</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14127</td><td>להכנת תושבות שטוחות רשתית</td></tr><tr><td>תמיסת צביעה DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td>לתיוג גרעין על תושבות שטוחות רשתית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ חיתוך</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>פלואורסצאין נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F6377</td><td>להדמיה in vivo</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>&nbsp; Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td>לרכישת תמונות פלואורסצנטיות של תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>Fluoromount-G מדיית הרכבה</td><td>SouthernBiotech</td><td>&nbsp; 0100-01</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>הידרוקסיפרופיל מתיל צלולוז</td><td>מאיה</td><td>89161</td><td>להדמיה in vivo הדמיה</td></tr><tr><td>איזולקטין B4 594 נוגדן</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>לתיוג כלי דם ברשתית על תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>עכברים C57/BL6J</td><td>GemPharmatech של מחוז ג'יאנגסו</td><td>לאינדוקציה של מודל OIR</td>מיקרו חיתוך <td></td></tr><tr><td> מספריים-להב ישר</td> World <td>Precision Instruments</td><td>503242</td><td>להכנת תושבות שטוחות רשתית</td></tr><tr><td>מס' 4 מלקחיים ישרים</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501978-6</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>Abcam</td><td>ab7475</td><td>להכנת</td></tr><tr><td>חיישן O2</td><td>שונים</td><td></td><td>לניטור רמת O2</td></tr><tr><td>OxyCycler</td><td>Biospherix</td><td>A84XOV</td><td>לאינדוקציה של דגם OIR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>לקיבוע רקמות</td></tr><tr><td>נתרן פנטוברביטל</td><td>שונים</td><td></td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>סודה ליים</td><td>שונים</td><td></td><td>לספיגת עודף CO2 בתא החמצן</td></tr><tr><td>SPECTRALIS HRA+OCT</td><td>היידלברג</td><td>HC00500002</td><td>עבור in vivo הדמיה</td></tr><tr><td>SPSS סטטיסטיקה 22.0</td><td>IBM</td><td></td><td>לניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>שייקר Tansference decloring</td><td>Kylin-Bell</td><td>ZD-2008</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות (חיבור נמוך)</td> <td>Corning</td><td>3261-20EA</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>העברת פיפטות</td><td>שונות</td><td></td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; SLBW6818</td><td>להכנת תושבות שטוחות ברשתית</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Different</td><td></td><td>For in vivo הדמיית</td></tr><tr><td>ZEN תוכנת הדמיה</td><td>ZEISS</td><td></td><td>לרכישה וייצוא של תמונות</td></tr></tbody></table>

ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

רטינופתיה הנגרמת על-ידי חמצן (OIR) נמצאת בשימוש נרחב לחקר צמיחת כלי דם חריגה במחלות רשתית איסכמיות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתרבה (PDR) וחסימת ורידים ברשתית (RVO). רוב מחקרי OIR מתבוננים בניאו-וסקולריזציה של הרשתית בנקודות זמן ספציפיות; עם זאת, הצמיחה הדינמית של כלי שיט בעכברים חיים לאורך מסלול זמן, החיונית להבנת מחלות כלי הדם הקשורות ל-OIR, לא נחקרה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב להשראת מודל עכבר OIR, המדגיש את המלכודות הפוטנציאליות, ומספק שיטה משופרת לכימות מהיר של אזורים של מחיקת כלי דם (VO) וניאו-וסקולריזציה (NV) באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה. חשוב מכך, עקבנו אחר צמיחה מחדש של כלי דם בעכברים חיים מ-P15 עד P25 על-ידי ביצוע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) במודל עכבר OIR. היישום של FFA למודל העכבר OIR מאפשר לנו לבחון את תהליך השיפוץ במהלך צמיחה מחדש של כלי שיט.

במודל עכבר OIR, התוצאה החשובה והבסיסית ביותר היא כימות אזור ה- VO וה- NV. לאחר שחיו בסביבת היפרוקסיה במשך 5 ימים מ-P7, הרשתית המרכזית של הגורים הראתה את האזור הגדול ביותר ללא זילוף. תחת גירוי של היפוקסיה בעוד 5 ימים, neovascularization הרשתית הופק בהדרגה אשר פלואורסצנטי בעוצמה רבה יותר מאשר סביב כלי הדם הרגילים. לאחר P17, האות הפלואורסצנטי של ניאו-וסקולריזציה פתולוגית נסוג במהירות עם השיפוץ של הרשתית (איור 5A). על-ידי שליטה בגודל ההמלטה ובעלייה במשקל לאחר הלידה של הגורים, האזור של ה-VO וה-NV...

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תושבות שטוחות רשתית של עכברים וניתוח. השימוש באנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) עבור גורי עכברים ועיבוד תמונה מתוארים בפירוט גם כן.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים להפריד בקלות את הרשתיות של עכברים ולבחון את השינויים הדינמיים בכלי הדם ברשתית של מודל עכבר OIR. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שימור שלמות הרשתיות המופרדות ומתן אפשרות לכל עכבר לשמש כבקרה משלו, מה שהופך את התוצאות להשוואה יותר. חוקרים שמנסים את השיטה הזו בפעם הראשונה עשויים להתקשות בזמן שהם לוקחים את חמש הדמיות האוריינטציה מכיוון שקצת קשה למקם את הגורים בתנוחה הנכונה.כדי לאסוף את הרקמה להרכבה מלאה של הרשתית, השתמש במספריים מעוקלים כדי לנתק את גלגלי העיניים מהרקמה המסלולית של גור C57-Black/6 שעבר המתת חסד. לאחר מכן, הכנס מלקחיים מעוקלים לחלק האחורי של גלגל העין, הידוק עצב הראייה והרמת העין במהירות מהמסלול. הניחו את גלגלי העיניים ב-PBS מקורר מראש כדי להסיר שיער ודם מפני השטח.לאחר שכל גלגלי העיניים נאספו, העבירו את גלגלי העיניים המנוקים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 4% פרפורמלדהיד, ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ו-12 עד 15 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, הוסיפו טיפה של PBS למרכז צלחת תרבית תחת מיקרוסקופ מנתח, והכניסו גלגל עין אחד לתוך הטיפה. מחזיק את גלגל העין עם זוג מלקחיים, להשתמש מחט מזרק של מיליליטר אחד כדי לנקב בזהירות את הקרנית בלימבוס הקרנית.הכנס את הקצה של זוג מספריים לתוך לנקב, לחתוך את הקרנית לאורך לימבוס הקרנית, נזהר לא לחתוך את הרשתית. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הקשתית והעדשה, והניחו את שארית העינית ב-4% פרפורמלדהיד לדגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר על השייקר. בסוף הדגירה, הניחו את העין הקבועה בטיפה טרייה של PBS במרכז מנת תרבות חדשה.החזיקו את העין עם זוג מלקחיים אחד, השתמשו בזוג מלקחיים שני כדי להפריד בעדינות את שכבות הרשתית והסקלרה. מניחים את קצה המספריים בין שכבות הרשתית והסקלרה, וחותכים את הסקלרה לכיוון עצב הראייה. יש לקלף את הסקלרה מהרשתית כדי לקבל את הרשתית.באמצעות מלקחיים, לשחרר את החיבור בין כלי hyaloid רדיאלי ורשתית היקפית. השתמשו בפיפטה של שני מיליליטר כשהקצה חתוך כדי להעביר את הרשתית לבאר אחת של צלחת של 48 בארות לשלוש שטיפות של חמש דקות בטמפרטורת החדר PBS על השייקר. לאחר הכביסה האחרונה, יש לדגום את הגביע ב-1% טריטון X-100 ו-5% סרום חמורים רגיל ב-PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.כדי לסמן את כלי הדם ברשתית עם איזולקטין B4, יש לדגור את הרשתית בבאר אחת של צלחת 48 באר ב-400 מיקרוליטרים 0.1% סרום חמורים רגיל בתוספת איזולקטין B4-594 למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר. במידת הצורך, ניתן להוסיף נוגדן ראשוני נוסף בו זמנית. ביום שלמחרת, יש לשטוף את הרשתית עם שלוש שטיפות של 20 דקות ב-0.1% PBST על השייקר.לאחר הכביסה האחרונה, לדגור על הרשתית עם נוגדן משני מתאים בעל זיקה גבוהה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לפני תיוג הדגימה עם DAPI למשך 20 עד 25 דקות. בסוף הדגירה, שטפו את הרשתית בשלוש כביסות של 30 דקות ב-0.1% PBST בטמפרטורת החדר עם רעידות. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הרשתית למגלשה נקייה כשהפתח פונה כלפי מעלה, והשתמשו במיקרוסקופ כדי לחתוך את הרשתית באופן רדיאלי בתנוחות שלוש, שש, תשע ו-12 מהפריפריה לכיוון המרכז, עד 1 עד 1.5 מילימטרים מראש עצב הראייה.שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם כמה טיפות של PBS בכל שטיפה לפני שתשתמשו בנייר מונחה באוויר לייבוש ושיטוח הרשתית. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה למרכז הכיסוי עד שקוטר הטיפה מכסה מחצית ממכסה את הכיסוי. לאחר מכן הניחו במהירות את החלק הבינוני של הכיסוי על הרשתית החיצונית.לאחר הכנת כל התושבות השטוחות של הרשתית, ניתן לדמות את הדגימות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. להדמיית in vivo, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של טיפות עיניים מידריאטיות כדי להשיג התרחבות אישונים לאורך זמן. לאחר חמש דקות, הניחו את הגורים בתנוחה יציבה על כרית חימום קטנה מול מכשיר ההדמיה.כדי לשמור על הלחות בקרניות, יש להוסיף באופן קבוע קרעים מלאכותיים לאורך הליך ההדמיה. לאחר מכן, לחץ על הדמיית פונדוס אינפרא אדום במכשיר כדי להתאים את ראש עצב הראייה למרכז המסך. הזרקת 150 מיקרוליטר של תמיסת מלח נתרן 0.5% פלואורסצין, ולחץ מיד על לחצני FA והזרקה בלוח המגע של מכשיר ההדמיה כדי להפעיל את הטיימר.לאחר שלוש דקות, כאשר זרימת הדם של הרשתית נכנסה לשלב הוורידי, לרכוש את התמונה הראשונה של הרשתית המרכזית. הזז את עדשת מכשיר ההדמיה אופקית לצד האף של העין עד שראש עצב הראייה ממוקם בנקודת האמצע של צד אחד של אזור רכישת התמונה, וצלם את התמונה השנייה. המשך להזיז את העדשה ולקבל תמונות של הרשתית הטמפורלית, העליונה והנחותה באותו אופן.לעיבוד תמונות הרשתית בתוכנית עיבוד הדמיה מתאימה, פתחו את התפריט 'קובץ' ולחצו על 'חדש' ליצירת בד ציור חדש עם רקע שחור. פתח את התמונה של הרשתית המרכזית. לאחר מכן לחץ על קובץ כדי להוסיף תמונה שנייה.התאימו את אטימות התמונה השנייה ל-60%, הזיזו את התמונה ושנו את גודלה עד ששתי התמונות יחפפו. לחצו על 'עבור בין מצבי שינוי צורה חופשי' ו'עיקום', ובצעו התאמות עדינות בכלי הדם במידת הצורך. לאחר מכן החזירו את האטימות של התמונה השנייה ל- 100% בחרו בשתי התמונות, ולחצו על 'מיזוג שכבות אוטומטי'.סמן את פנורמה כשיטת המיזוג, וסמן גם את התיבות עבור גוונים וצבעים חלקים ומילוי מודע לתוכן אזורים שקופים. לחץ על אישור כדי להשלים את התפירה של שתי התמונות הראשונות. לאחר מכן, הוסף את התמונה השלישית, ותפור תמונה זו לשתי התמונות הראשונות כפי שהודגם עד שכל חמש התמונות מרשתית אחת נתפרו.לאחר עיבוד כל התמונות מניתוח, השתמש בכלי החיתוך כדי לחתוך את תמונות ה- FFA לגודל אחיד כדי להקל על התצפית על השינויים בדינמיקה של כלי הדם ברשתית בנקודות זמן התפתחותיות שונות. לאחר חמישה ימים של חשיפה להיפרוקסיה, הרשתיות המרכזיות של גורים לאחר יום 12 מדגימות אזור גדול ללא זילוף. עם המעבר לחמישה ימים של תנאים היפוקסיים, הרשתיות בהדרגה neovascularize, מראה עלייה באות פלואורסצנטי חזק יותר מזה שנצפה בכלי הדם הרגילים שמסביב.לאחר יום 17 לאחר הלידה, הניאו-וסקולריזציה הפתולוגית נסוגה במהירות והרשתית מדגימה מראה נורמלי לחלוטין ביום 25 שלאחר הלידה. ניתן להשיג חזרה טובה ויציבות של מודל רטינופתיה המושרה על ידי חמצן על ידי שליטה בגודל ההמלטה ועלייה במשקל לאחר הלידה של הגורים. כפי שנצפה, הכחדת כלי הדם מגיעה לשיאה בדרך כלל ביום 12 שלאחר הלידה ונעלמת ביום 25 שלאחר הלידה, בעוד שהניאו-וסקולריזציה מגיעה לשיאה ביום 17 שלאחר הלידה ונסוגה ביום 25 שלאחר הלידה.ביום שלאחר הלידה 15 עד 25 עכברי רטינופתיה המושרה על ידי חמצן, קוטר כלי הדם ברשתית עולה ונעשה מייסר מאוד בהשוואה לזה שנצפה עבור הרשתיות של עכברים רגילים. המלקחיים ביד שמאל משחקים בעיקר בתפקיד תומך. היזהר לא לסחוט את גלגל העין, אשר יכול לעוות או לקרוע אותו.

monitoring-dynamic-growth-retinal-vessels-oxygen-induced-retinopathy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיונית בבעלי חיים כדי להמחיש ולמדוד את קוטר כלי הדם ברשתית, מהירויות זרם הדם וזרימת הדם הכוללת ברשתית.

מדידות מיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני של זרימת הדם ברשתית בעכברים

הרשתית המכרסם כבר זמן רב מוכרת כחלון נגיש למוח. במאמר זה טכני אנו מספקים פרוטוקול אשר מעסיק את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן כדי ללמוד את המנגנונים שיובילו לכישלון של התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית, לאחר פגיעה איסכמית. המערכת המתוארת גם ניתן לרתום לבחון אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

מחלות רבות סכנת חזון עינית משויכות לקוי microvessels ברשתית. לכן, המדידה של תגובות arteriole ברשתית הוא חשוב לחקור את המנגנונים הקשורים pathophysiological המשמש כבסיס. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בידוד arteriole רשתית העכבר והכנות כדי להעריך את ההשפעות של חומרים vasoactive על קוטר כלי הדם.

שלבי הכנה מדידה של תגובתיות ב העכבר רבים ברשתית Vivo לשעבר

רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) יכולה לשמש למודל מחלות רשתית איסכמיות כגון רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת ולשמש כמודל למחקרים הוכחת הרעיון בהערכת תרופות אנטי אנגיוגניות למחלות ניאו-שריריות. OIR גורם neovascularization חזק לשחזור ברשתית שניתן לכמת.

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לחסימת ורידים ברשתית באמצעות ורד בנגלי ומערכת מיקרוסקופ הדמיית רשתית מונחה לייזר עם המלצות למקסם את יכולת השחזור שלה בזנים מהונדסים גנטית.

אופטימיזציה של מודל העכבר לחסימת ורידים ברשתית כדי להגביל את השונות

מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.

כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות

כאן אנו מציגים שלושה פרוטוקולי ניתוח נתונים עבור אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT) במחקר של חסימת ורידים ברשתית (RVO).

In vivo קריאות פגיעה בכלי דם ברשתית העכבר כדי לקדם את יכולת השחזור

כלי דם ברשתית עכבר מעניינים במיוחד בהבנת המנגנונים של היווצרות תבניות כלי דם. פרוטוקול זה מודד באופן אוטומטי את הקוטר של כלי הדם ברשתית העכבר מתמונות פונדוס אנגיוגרפיה פלואורסצנטית במרחק קבוע מהדיסק האופטי.

מדידת קוטר כלי הדם ברשתית מתמונות אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של עכבר

בדו"ח זה, אנו מציעים יישום חדש של אור ריפוי שיניים שרפים על בסיס הרכבה של אלקטרודות או בדיקות microdialysis בניסויים כרונית. חומר זה מאפשר התקשרות ישירה הגולגולת.

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

במודלים של בעלי חיים orthotopic של סרטן השחלות לשכפל טוב יותר מחלות אנושיות, ולכן לשפר את ההבנה שלנו של התקדמות סרטן תגובת הגידול לטיפול. מודל העכבר מקבל זריקה intrabursal של בלוציפראז-להביע תאים סרטניים בשחלות. טיפול מנוהל באמצעות gavage הפה. הגידול מנוטרת על...

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

למד שיטת צביעת אימונופלואורסצנציה לניטור דינמי של כלי רשתית בעכברים עם רטינופתיה מושרית חמצן. פרוטוקול זה מאפשר שימור שלמות הרשתית והשוואת תוצאות מדויקת בין עיניים.

ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

גלה סרטונים נוספים