Name: הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: למד הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט. השיטה משווה שלוש טכניקות הומוגניזציה ומאפשרת כימות מדויק של יונים אלו במחקרי מטבוליזם של חנקן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NIDDK פנימי ZIA DK 0251041-14 לאלן נ שכטר, MD.

פרוטוקול בעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIDDK (ASP K049-MMB-20). בעלי חיים טופלו וטופלו על פי המדריך הנוכחי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה הזמין באופן חופשי באתר AAALAC.
1. אוסף שרירי שלד עכברושים
<ol><li>בזמן שחולדה נמצאת תחת הרדמה עמוקה (5% איזופלורן, שאושר על ידי תגובה נעדרת לצביטת זנב/רגל), התחילו זלוף עם מי מלח המכילים הפרין על ידי הכנסת מחט של 19 גרם לתוך קצה של החדר השמאלי ויצירת ניק באטריום הימני. אפשרו למלח עם הפרין לחלחל דרך האיברים הפנימיים עד שלפחות 1.5 ליטר/ק"ג זרמו דרך הרקמה. בשלב זה, בעלי חיים מתים מאקסנגווינציה ופגרים מוכנים לעיבוד לאיסוף דגימות. הערה: השגת זלוף טוב היא קריטית, במיוחד עבור מדידות מדויקות של ניטריט, מכיוון שניטריט מחומצן לחנקות על ידי כל המוגלובין שנותר.</li>
	<li>זהה רקמות שריר מטרה וכרית אותן מהרגליים האחוריות22 באמצעות מכשירי ניתוח נקיים. הסר כמה שיותר שומן ורקמות חיבור מרקמות השריר.</li>
	<li>הכניסו את כמות השרירים הרצויה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן הניחו על קרח יבש. אחסנו את הצינורות המלאים ברקמה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. הערה: במקרה של דגימות ביופסיה אנושיות, יש להכתים אותן ביסודיות מיד עם האיסוף עם גזה נקייה כדי להסיר עודפי דם.</li>
</ol>2. הכנה להומוגניזציה
<ol><li>הכנת תמיסה משמרת ניטריט (תמיסת עצירה)<ol><li>הכינו תמיסה צהובה שקופה המכילה 890 mM אשלגן פריציאניד (K3Fe(CN)6) ו-118 mM NEM (N-ethylmaleimide) במים מזוקקים, כדי להבטיח שלא יהיו גבישים. הוסיפו חומרים פעילי שטח לא יוניים (חומרי ניקוי) ביחס של 1:9 (v/v, Table of Materials), וערבבו בעדינות כדי למנוע הקצפה.</li>
		<li>יש לדלל את תמיסת העצירה ביחס של 1:9 עם מים מזוקקים. מניחים את תמיסת העצירה המדוללת (יחס של 1:5 בין רקמת השריר לתמיסת עצירה מדוללת) בצינור ההומוגניזציה. הערה: עשרים מיליגרם של רקמה ידרשו 100 μL של תמיסת עצירה, ו 200 מ"ג של רקמה ידרוש 1000 μL של תמיסת עצירה בצינור. נוכחות של חומר ניקוי בתמיסה נוספת היא קריטית לשיבוש של קרומי התא. ניתן להשתמש בכל חומר ניקוי שאינו יוני, אך יש להקפיד על כך שהוא אינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת רקמות<ol><li>מוציאים את הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ומפשירים לאט בקרח. הסר את השומן הנותר ורקמת החיבור משרירי השלד. חותכים חתיכות של שרירי השלד וכתם על גזה לייבוש.</li>
		<li>שוקלים את כמות הרקמה (20, 50 ו -200 מ"ג). הניחו את שרירי השלד שנשקלו מראש בתמיסת העצירה בצינורות ההומוגניזציה או הניחו את הרקמה הנשקלת מראש בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הומוגניזציה
<ol><li>הומוגנייזר סיבובי (איור 1)<ol><li>הכניסו למכונה את הצינור מסוג M המכיל את שרירי השלד שנשקלו מראש ותמיסת עצירה שנמדדה מראש. הומוגניזציה של כל דגימה פעמיים (הגדרת מחזור ההומוגניזציה ההרסני ביותר) והנחת הצינור על קרח מיד לאחר כל הומוגניזציה למשך 5 דקות כדי להתקרר.</li>
		<li>צנטריפוגה לזמן קצר ב-2,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור המלא בחזרה על קרח ומוסיפים את הנפח המתאים של מתנול (≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולת ביסודיות במשך 15 שניות. הערה: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול. מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמות ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.</li>
		<li>הומוגני פעם נוספת דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימות במשך 35 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ו 3,500 × גרם. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>הומוגנייזר חרוזים (איור 2)<ol><li>מניחים את רקמת שריר השלד בצינור המכיל חרוזים (יחס של 1:5 לרקמה: תמיסת עצירה מדוללת) והומוגניים פעמיים במשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר בו נעשה שימוש. מניחים את הצינור על קרח מיד לאחר כל הומוגניזציה למשך 5 דקות כדי להתקרר.</li>
		<li>צנטריפוגה לזמן קצר באמצעות צנטריפוגה שולחנית קטנה (2,000 x גרם) למשך 5 שניות. מניחים את הצינור בחזרה על קרח ומוסיפים נפח מתאים של מתנול (טוהר ≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולת ביסודיות במשך 15 שניות. הערה 1: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול. הערה 2: מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמתי ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.</li>
		<li>הומוגניזציה פעם נוספת במשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר שבו נעשה שימוש. דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 17,000 x גרם, 4 °C, 30 דקות. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>פולברייזר (איור 3)<ol><li>הכינו צינורות המכילים תמיסת עצירה מדוללת (פי 5 ממשקל הרקמה) ושקלו אותם. רשום את המשקל (צינור + תמיסת עצירה).</li>
		<li>הניחו את כלי פולברייזר החנקן הנוזלי על קרח יבש והמתינו כ-30 דקות עד שהוא יגיע לטמפרטורה הרצויה.</li>
		<li>באמצעות פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, מעבירים דגימה אחת (משקל הרקמה כבר נמדד) לפולברייזר. הוסיפו כפית קטנה של חנקן נוזלי כדי לוודא שהרקמה נמצאת בטמפרטורת חנקן נוזלי.</li>
		<li>לאחר ש-95% מהחנקן הנוזלי התאדה, הניחו את כלי הריסוק על גבי הרקמה ולחצו בחוזקה. אתה צריך להרגיש את המדגם לרסק. באמצעות mallet, להכות את כלי ריסוק 3-5x.</li>
		<li>בדוק את הדגימה עבור כל הגושים הנותרים באמצעות כף מקורר בחנקן נוזלי. לאחר קירור בחנקן נוזלי, השתמשו בפיסת נייר טישו כדי לנגב מים קפואים לפני שאתם נוגעים ברקמה. אם נתח קיים, להזיז אותו למרכז, ולאחר מכן להכות 5-6 פעמים נוספות עם mallet.</li>
		<li>לאחר שהדגימה כולה נגנזה, השתמש בכף המקוררת בחנקן נוזלי כדי להעביר ישירות את הרקמה המרוסקת לתוך הצינור השקול מראש המכיל את תמיסת העצירה המדוללת (שלב 3.3.1). הקפד לבצע שלב זה במהירות כמו כאשר שריר השלד מרוסק מתחמם, זה נהיה דביק וקשה להעביר.</li>
		<li>וורטקס במשך 15 שניות. בדוק שאף רקמה לא תקועה בחלק העליון של הצינור על ידי פתיחת הצינור. אם יש, נסה להיפטר ממנו ואז מערבולת שוב.</li>
		<li>צנטריפוגה את הדגימה עבור 2-3 שניות באמצעות צנטריפוגה שולחנית קטנה. שוקלים שוב את הצינור. חשב את משקל הרקמה על ידי ניכוי משקל הצינור המקורי (שלב 3.3.1) ממשקל חדש זה. מניחים את הצינור על קרח. הערה: המשקלים המדויקים יעזרו לקבוע את משקל הרקמה המדויק וכמה רקמה אבדה במהלך הפולבריזציה.</li>
		<li>לאחר עיבוד כל הדגימות עד שלב 3.3.8, הוסף נפח מתאים של מתנול (≥ 99.9%, פי 10 ממשקל הרקמה). מערבולות ביסודיות במשך 15 שניות, ודוגרות על קרח במשך 30 דקות. הערה: עבור 20 מ"ג רקמה, יש להשתמש ב-200 μL של מתנול. מתנול משמש לזירוז חלבונים מהומוגנט רקמות ואינו מפריע לשיטת הכימילומינסנציה. אם נעשה שימוש בשיטת משקעי חלבון אחרים, בדוק את תאימותו לכימילומינסנציה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 17,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות. שאפו את הסופר-נטנט ומדדו את רמות הניטריט/ניטראט, או אחסנו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>4. מדידת ניטריט/ניטראט עם אנלייזר תחמוצת החנקן (NOA)
<ol><li>הכינו את כל הדגימות באחת משלוש שיטות הומוגניזציה שונות שתוארו לעיל והזריקו אותן ל-NOA למדידת חנקות וניטריטים. הערה: פרוטוקולים מפורטים לשימוש NOA פורסמו בעבר19.</li>
</ol>

<ol><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+unique+signaling+molecule+in+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).</li>
<li>Moncada, S., Higgs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-arginine-nitric+oxide+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The L-arginine-nitric oxide pathway.</a> New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+plasma+nitrite+after+a+dietary+nitrate+load+is+markedly+attenuated+by+an+antibacterial+mouthwash%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash.</a> Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).</li>
<li>Jansson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+functional+nitrate+reductase+that+regulates+nitrite+and+nitric+oxide+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis.</a> Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+as+a+source+of+nitrite+and+nitric+oxide+during+exercise+hyperemia+in+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle.</a> Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Shiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxymyoglobin+is+a+nitrite+reductase+that+generates+nitric+oxide+and+regulates+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration.</a> Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).</li>
<li>Millar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidoreductase+catalyses+the+reduction+of+nitrates+and+nitrite+to+nitric+oxide+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions.</a> FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).</li>
<li>Benjamin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomach+NO+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomach NO synthesis.</a> Nature. 368 (6471), 502(1994).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+nitric+oxide+production+in+humans%3A+measurements+in+expelled+air%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air.</a> Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).</li>
<li>Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+nitrate+on+blood+pressure+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).</li>
<li>Kapil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+nitrate+supplementation+lowers+blood+pressure+in+humans%3A+role+for+nitrite-derived+NO%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO.</a> Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).</li>
<li>Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+and+exercise+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation and exercise performance.</a> Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).</li>
<li>Piknova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+as+an+endogenous+nitrate+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir.</a> Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).</li>
<li>Wylie, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+nitrate+store%3A+influence+of+dietary+nitrate+supplementation+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise.</a> Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).</li>
<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrite+in+blood+samples+using+the+ferricyanide-based+hemoglobin+oxidation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay.</a> Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Nitrite+and+Nitrate%2C+Metabolites+in+the+Nitric+Oxide+Pathway%2C+in+Biological+Materials+using+the+Chemiluminescence+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54879(2016).</li>
<li>Nyakayiru, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitrate+ingestion+increases+skeletal+muscle+nitrate+content+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans.</a> Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).</li>
<li>Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitrate+and+nitrite+in+biopsy-sized+muscle+samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC.</a> Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).</li>
<li>Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+DNA-strand+co-segregation+and+asymmetric+cell+division+in+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).</li>
<li>Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type+differences+in+nitrate+and+nitrite+storage+and+nitric+oxide+signaling+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ohtake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrite+supplementation+improves+insulin+resistance+in+type+2+diabetic+KKA%28y%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice.</a> Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים. אלן נ 'שכטר רשום כממציא שותף על מספר פטנטים שהונפקו למכונים הלאומיים לבריאות לשימוש במלחי ניטריט לטיפול במחלות לב וכלי דם. הוא מקבל תמלוגים המבוססים על רישוי NIH של פטנטים אלה לפיתוח קליני אך ללא פיצוי אחר. הסדרים אלה אינם משפיעים על דבקותו במדיניות כתב העת JoVE.

כדי לעקוב אחר שינויים במטבוליטים NO, חנקות וניטריט, כפונקציה של התערבויות פיזיולוגיות, זה הכרחי כדי למדוד את רמות יונים אלה באיברים השונים כי הם קריטיים בחילוף החומרים שלהם. כמו המוגלובין בדם יגיב עם NO ואת המטבוליטים שלה, חשוב גם להסיר את הדם במהירות מדגימות רקמות ככל האפשר. לפיכך, בעלי חיים הוזלו במי מלח לפני שאספו רקמות שריר שלד (גלוטאוס, TA, EDL, שריר גסטרוקנמיוס), ורקמות חיבור ושומן סביב שריר המטרה הוסרו מיד. עבור תמיסת ההומוגניזציה, 'תמיסת עצירה' פותחה במיוחד עם פריקיאניד, NEM וחומרים פעילי שטח לא יוניים כדי לשמר נ...

תחמוצת החנקן (NO), מולקולת איתות גזית קטנה, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים1. לא ניתן לייצר NO מ-L-ארגינין על-ידי אנזימים אנדוגניים ממשפחת הסינתאז של תחמוצת החנקן (NOS) לפני שהוא עובר חמצון מהיר לחנקות (NO 3-) וייתכן שגם ניטריט (NO 2-) בדם וברקמות 2,3. לאחרונה הוכח כי אניונים אלה מופחתים בחזרה ל-NO במערכות יונקים4. חנקה מומרת לניטריט, בעיקר על ידי רדוקטזות של חיידקים חנקתיים בחלל הפה הפועלות על יונים המופרשים על ידי בלוטות הרוק ונבלעים ישירות 5, ובמידה מסוימת, על ידי אנזימים של יונקים כגון קסנטין אוקסידורדוקטאז 6,7. ניטריט יכול להיות מופחת עוד יותר ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל דאוקסיהמוגלובין8, דאוקסימיוגלובין9, אנזימים המכילים מוליבדן 10, והפחתה לא אנזימטית בנוכחות פרוטונים11,12.
מסלול ניטריט-ניטריט-NO זה משופר בתנאים היפוקסיים שבהם פעילות ה-NOS פוחתת מכיוון ש-NOS דורש חמצן עבור NO דור4. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה דיווחו על השפעות מועילות של חנקות תזונתיות על ויסות לחץ הדם ועל הביצועים הגופניים, מה שמצביע על כך שמסלולי הפחתת חנקות תורמים להגברת האיתות NO13,14,15. מחקרים קודמים הראו כי חלק משרירי השלד הם ככל הנראה מקומות אחסון החנקות העיקריים בגוף16. בהשוואה לדם או לאיברים פנימיים אחרים כגון כבד, שרירי השלד (gluteus maximus) מכילים רמות גבוהות משמעותית של חנקות ויש להם מסה משמעותית בגוף היונקים. הודגם כי תרגיל הליכון משפר את הפחתת החנקות לניטריט ול-NO בגלוטאוס בחולדה מדגם7. תוצאות אלה מרמזות על כך ששרירי שלד מסוימים עשויים להיות מקורות חשובים ל-NO באמצעות מסלולי הפחתת חנקות במצבים פיזיולוגיים. מחקרים עדכניים יותר מצביעים על כך שממצאים אלה, כולל שינויים ברמות החנקות בשרירים במהלך פעילות גופנית, מתרחשים גם בבני אדם17.
שניים מהמחברים הנוכחיים ביססו בעבר שיטה למדידת רמות חנקות וניטריט בדם ובדגימות נוזליות אחרות18. עם זאת, כאשר הרמות של אניונים אלה בהומוגנטים רקמה נותחו בתחילה, פרוטוקולים מפורטים לא היו זמינים. כדי להבין את הדינמיקה של ניטרט-ניטריט-NO בכמה איברים שונים, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה מדויקת ויעילה למדידת רמות החנקות והניטריטים ברקמות יונקים, כולל שרירי השלד. במחקרים קודמים, רקמות מכרסמים שימשו לפיתוח תהליכי הומוגניזציה אמינים ולאחר מכן לניתוח תכולת חנקות וניטריטים באותם הומוגנטים 7,16,19. השימוש בשיטת הומוגניזציה זו הורחב לדגימות ביופסיה של שרירי שלד אנושיים, לפיהן אושרו הערכים, וחשוב מכך, הערכים שנצפו עבור שריר בהשוואה לדם/פלזמה היו בטווחים ויחסים דומים לאלה שנצפו במכרסמים17. בשנים האחרונות, גם קבוצות אחרות החלו למדוד את רמות החנקות והניטריטים אצל הומוגנאטים בשרירי השלד, ודיווחו על ערכים דומים לאלה שדווחו על ידי הקבוצה שלנו20,21.
מטרת מאמר פרוטוקול זה היא לתאר בפירוט את הכנת הומוגנאטים בשרירי השלד באמצעות שלוש שיטות הומוגניזציה שונות למדידה עוקבת של רמות חנקות וניטריטים. בנוסף, נבדקו ההשפעות של משקל הרקמה המשמש להומוגניזציה על ערכים של חנקות וניטריט בדגימות שרירי השלד. אנו מאמינים כי ניתן ליישם שיטות אלה בקלות על סוגים אחרים של רקמות יונקים. לאחרונה, במיוחד בתחום הפיזיולוגיה של האימון, הוקדשה תשומת לב להבדלים האפשריים בפיזיולוגיה של ניטריט/ניטריט/NO בהתאם לקבוצות שרירים. אנו מדווחים גם על כמויות הניטראט והניטריט בארבעה שרירי מכרסמים שונים ומוצאים התפלגות לא אחידה של שני היונים בין השרירים השונים האלה; תצפית הדורשת מחקר נוסף.

<table><tbody><tr><td>דיסוציאטור עדין</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>צינור MACS M עדין</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td>אורך: 87 מ"מ; קוטר: 30 מ"מ</td></tr><tr><td>הפרין נתרן</td><td>הוספירה</td><td>NDC-0409-7620-13</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td>NDC-10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>646377</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר חרוזי מיניליס</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>מנתח תחמוצת החנקן</td><td>GE</td><td>Sievers NOA 280i</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-נונילפנילפוליאתילן גליקול</td><td>סיגמא</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פריציאניד; K3Fe (CN) 6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Precellys ערכת ליסינג</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td>מכילה 2 צינורות מ"ל עם חרוזי קרמיקה 2.8 מ"מ (תחמוצת זירקוניום) להומוגניזציה</td></tr><tr><td>ערכת ריסוק Cellcrusher ערכת</td><td></td><td></td> <td>Cellcrusher</td></tr></tbody></table>

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

יונים חנקתיים (NO3-) נחשבו בעבר לתוצרים סופיים אינרטיים של חילוף החומרים של תחמוצת החנקן (NO). עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי יונים חנקתיים יכולים להיות מומרים בחזרה ל-NO ביונקים באמצעות מנגנון הפחתה דו-שלבי: ניטרט מופחת לניטריט (NO2-) בעיקר על ידי חיידקי קומנסל דרך הפה, ואז ניטריט מופחת ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל באמצעות חלבונים המכילים הם או מוליבדן. מסלול חנקתי רדוקטיבי זה תורם לשיפור מסלולי איתות ללא תיווך, במיוחד במערכת הלב וכלי הדם ובמהלך פעילות גופנית. רמות החנקות בגוף לפני ניצול כזה נקבעות על ידי שני מקורות שונים: חמצון NO אנדוגני וצריכת חנקות תזונתית, בעיקר מצמחים. כדי להבהיר את מחזור ה-NO המורכב בנסיבות פיזיולוגיות, בחנו עוד יותר את הדינמיקה של המטבוליטים, יוני החנקות והניטריטים שלו, שהם יציבים יחסית בהשוואה ל-NO. במחקרים קודמים זוהה שריר השלד כאיבר אחסון מרכזי ליוני חנקות ביונקים, וכן כמקור ישיר של NO במהלך פעילות גופנית. לכן, קביעת מתודולוגיה אמינה למדידת רמות החנקות והניטריטים בשרירי השלד חשובה ואמורה לסייע בהרחבת יישומה לדגימות רקמות אחרות. מאמר זה מסביר בפירוט את הכנת דגימות שרירי השלד, תוך שימוש בשלוש שיטות הומוגניות שונות, למדידות ניטראט וניטריט ודן בנושאים חשובים הקשורים לתהליכי הומוגניזציה, כולל גודל הדגימות. ריכוזי ניטראט וניטריט הושוו גם בארבע קבוצות שרירים שונות.

כדי להשיג תוצאות מייצגות, רקמות שריר השלד מ 8 חולדות Wistar (זכרים ונקבות, משקל 250 ± 50 גרם) שימשו. הומוגנאטים של שרירי שלד חולדה (50 מ"ג של שריר גלוטאוס מקסימוס לכל שיטה) הוכנו על ידי שלושה כלי הומוגניזציה שונים (הומוגנייזר סיבובי, הומוגנייזר חרוזים ופולברייזר). לאחר מכן, תכולת החנקות והניטריטים של ההומוגנטים האלה נקבעה באמצעות מנתח תחמוצת החנקן (NOA) (איור 4). רמות החנקות (איור 4A) בשלוש הדגימות ההומוגניות האלה היו דומות מאוד זו לזו, ונעו בין 39.6 ל-45.2 ננומ...

אנו מציגים פרוטוקולים לשלוש שיטות שונות להומוגניזציה של ארבע קבוצות שרירים שונות של רקמת שריר שלד חולדה כדי למדוד ולהשוות את רמות החנקות והניטריט. יתר על כן, אנו משווים משקלים שונים של דגימות כדי לחקור אם גודל דגימת הרקמה משפיע על תוצאות ההומוגניזציה.

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

שרירי השלד משמשים כמאגר מרכזי של חנקות אשר, לאחר הפיכתו לניטריט, משמש כמקור של NO במהלך פעילות גופנית. כאן אנו מציגים מתודולוגיה למדידת יונים אלה בשרירים וברקמות אחרות. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת שימור החנקות או עצרו אותה על ידי שילוב של 890 מילימולאר אשלגן פריציאניד ו-118 מילימולאר n-מתיל-מאלימיד במים מזוקקים, כדי להבטיח שלא יישארו גבישים בתמיסה, ואז הוסיפו חומר פעיל שטח לא יוני ביחס של 1 ל-9 וערבבו בעדינות כדי למנוע קצף.דלל את תמיסת העצירה ביחס של 1 ל-9 עם מים מזוקקים והוסף את תמיסת העצירה המדוללת לצינור ההומוגניזציה. לאחר מכן, הפשירו את רקמת השריר הקודמת של החולדה המבודדת והקפואה על הקרח. לאחר שהרקמה הפשירה, הסר את השומן ורקמת החיבור הנותרים משרירי השלד.חותכים חתיכות של שריר השלד ומכתימים אותם על גזה לייבוש. שקלו את הכמות המתאימה של רקמת שריר השלד, ולאחר מכן הניחו את הרקמה שלפני המשקל בצינורות ההומוגניזציה המכילים את תמיסת העצירה. עבור הומוגניזציה בהומוגנייזר סיבובי, הנח את הצינור מסוג M המכיל את שריר השלד שנשקל מראש ותמיסת עצירה שנמדדה מראש לתוך המכונה.הומוגניות כל דגימה פעמיים, ולאחר כל הומוגניזציה, מניחים את הצינור על הקרח מיד למשך 5 דקות כדי להתקרר. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר. החזירו את הצינור לקרח והוסיפו את הנפח המתאים של מתנול לפני המערבולת במשך 15 שניות.הומוגניזציה של הדגימה שוב ודגירה שלה על קרח במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה של הדגימה, לשאוף את supernatant, ולהמשיך למדוד את רמות ניטריט וניטרט. עבור הומוגניזציה של חרוזים, מניחים את רקמת שריר השלד בצינור המכיל חרוזים והומוגניים פעמיים למשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר. לאחר כל הומוגניזציה, מיד להניח את הצינור על קרח במשך 5 דקות כדי להתקרר, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור, להניח את הצינור בחזרה על קרח, ולהוסיף את הנפח המתאים של מתנול לפני מערבולת במשך 15 שניות.הומוגניזציה של הדגימה שוב למשך 45 שניות ואז דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה של הדגימה, לשאוף את supernatant, ולהמשיך למדוד את רמות ניטריט וניטרט. עבור הומוגניזציה מבוססת pulverizer, להכין צינורות המכילים את תמיסת עצירה מדולל, ולאחר מכן לשקול ולרשום את המשקל של הצינורות.לאחר קירור כלי הפולברייזר על קרח יבש למשך 30 דקות, באמצעות פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, מעבירים את דגימת הרקמה שנשקלה מראש לפולברייזר, ואז מוסיפים כמות קטנה של חנקן נוזלי כדי להבטיח שהרקמה נמצאת בטמפרטורת חנקן נוזלי. לאחר ש-95% מהחנקן הנוזלי התאדה, הניחו את כלי הריסוק על גבי הרקמה ולחצו בחוזקה כדי להרגיש את ריסוק הדגימה, ואז באמצעות מאלט, היכו בכלי הריסוק 3 עד 5 פעמים. כאשר כל הדגימה כבר pulverized, באמצעות כף נוזלית מקורר חנקן פינצטה, ישירות להעביר את הרקמה המרוסקת לתוך צינור ששקל מראש המכיל את תמיסת עצירה מדולל.לאחר מכן, מערבל את הצינור במשך 15 שניות, ולאחר מכן לפתוח את הצינור כדי לבדוק אם כל רקמה תקועה במכסה. אם יש, נסה להיפטר ממנו, ואז מערבולת שוב. צנטריפוגה קצרה של הדגימה למשך 2 עד 3 שניות.שקלו שוב את הצינור וחשבו את משקל הרקמה על ידי ניכוי משקל הצינור המקורי ממשקל חדש זה. מניחים את הצינור על קרח. הוסיפו נפח מתאים של מתנול לצינור ומערבבים את הצינור ביסודיות למשך 15 שניות לפני הדגירה שלו על קרח למשך 30 דקות, ואז עשו צנטריפוגה לדגימה, שאפו את הסופר-נטנט והמשיכו למדידת רמות הניטריט והחנקה.רמות החנקות וההומוגנטים בשרירי השלד של חולדות שהוכנו באמצעות הומוגנייזר סיבובי, הומוגנייזר חרוזים ופולברייזר היו דומים. באופן מעניין, עבור רמות ניטריט, הדגימה ההומוגנית שהוכנה על ידי pulverizer הראתה את הערך הגבוה ביותר, שהיה שונה סטטיסטית משני ערכי המדגם האחרים. השוואה של רמות ניטריט וניטרט בהומוגנטים של גלוטאוס שהוכנו מ-20, 50 ו-200 מיליגרם של רקמה באמצעות הומוגנייזר חרוזים הראתה כי רמות הניטראט או הניטריט לא היו שונות באופן משמעותי בין גודל דגימת השריר.השוואת רמות החנקות ברקמות שונות של שרירי שלד ברגליים של מכרסמים גילתה כי בשריר הגלוטאוס היו רמות חנקה גבוהות בערך פי שניים משלוש רקמות השריר האחרות. עם זאת, הבדלים אלה לא הגיעו למובהקות סטטיסטית. בדומה לרמות החנקות, גם ריכוז החנקות בשריר הגלוטאוס היה גבוה מזה שבשלוש רקמות השריר האחרות והיה גבוה משמעותית מזה שבדגימה של גסטרוקנמיוס.השיטה שלנו פשוטה יחסית ומתאימה לדגימות קטנות תוך שמירה על ניטראט וניטריט במהלך הכנת הדגימה.

preparation-rat-skeletal-muscle-homogenates-for-nitrate-nitrite

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הנה, אנחנו מדגימים ייצור של קולגן מבוסס, רקמה בונה המכיל myoblasts השלד. 3-D אלה בונה מהונדסים עשויים לשמש כדי להחליף או לתקן...

המצאה של Myogenic בונה רקמות מהונדסות

אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ"א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ...

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

סרטון זה מדגים את ההכנה וההליכים דרושים כדי ללמוד את תגובות ההתכווצות של שריר הכנת הגסטרוקנמיוס המדיאלי החולדה...

נהלים לעכברוש<em&gt; באתר</em&gt; מאפייני התכווצות שרירי שלד

ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

תחמוצת החנקן (NO) היא מולקולת איתות חשובה בהומאוסטזיס של כלי הדם. אין ייצור in vivo נמוך מדי למדידה ישירה. כימילומינסנציה מספקת תובנה שימושית לגבי מחזור NO באמצעות מדידת קודמיו ותוצרי החמצון, ניטריט וחנקה. מוסברת קביעת ניטריט / ניטראט ברקמות הגוף ובנוזלים.

מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סיב שריר מהיר מנתח, המאפשר איכות מכתים משופרת, ובכך רכישה אוטומטית וכימות של אוכלוסיות סיבים באמצעות ImageJ התוכנה הזמין באופן חופשי.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

ויסות שלם של ספיגת גלוקוז בשרירים חשוב לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף. פרוטוקול זה מציג הערכה של ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ודגירה כאשר הם מתארים את ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות על חילוף החומרים של גלוקוז בכל הגוף.

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

למד הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט. השיטה משווה שלוש טכניקות הומוגניזציה ומאפשרת כימות מדויק של יונים אלו במחקרי מטבוליזם של חנקן.

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

גלה סרטונים נוספים