באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר
7 במאי 2021
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר התחרותיות הזדווגות של Aedes aegypti זכר באמצעות צבע פלואורסצנטי כסמן. נקבות היתושים חשופות הן לזכרים מסומנים והן לזכרים לא מסומנים להזדווגות. לאחר ההזדווגות, הזרע שלהם נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את בן זוגם להזדווגות.
פרוטוקול זה מודד את התחרותיות של הזדווגות יתושים זכרים, המהווה תנאי מוקדם לתוכניות לדיכוי אוכלוסיית יתושים המבוססות על שחרור גברים. קריטריון כושר זה מוערך כחלק מהערכת בקרת איכות ומתיחה. שיטה זו מפחיתה את זמן הניסוי ב -90% ומאפשרת השוואה ישירה של תחרותיות ההזדווגות בין שני קווים סטריליים או נגועים בוולבאצ'יה.
ביצוע הליך זה יהיה איירין לי וקנג וואי מק. בתור התחלה, סקס יתושים זכר ונקבה בשלב הגועל, על פי הבדלי הגודל שלהם. עבור כל קבוצה של יתושים, להעביר 100 גלמים זכרים לתוך כלוב מסומן מראש עבור האכלת סוכרוז או רודמין B סוכרוז האכלה.
מניחים את הגולם הנשי בקבוצות קטנות של 40 עד 50 לכלוב. עם הופעתם של האימאגוס, בדוק את הכלובים לנוכחות של יתושים זכרים. כדי להכין את פתרון סוכרוז 0.2%רודמין B, להמיס 200 מיליגרם של אבקת רודמין B עבור כל 100 מיליליטר של 10% תמיסת סוכרוז.
מערבבים היטב כדי להבטיח שכל האבקה מומסת. הכן 20 בקבוקי מאכיל סוכר עם פתיל. הוסף 10 מיליליטר של 10% סוכרוז ל -10 בקבוקי מאכילים ו -10 מיליליטר של 0.2%Rhodamine B סוכרוז פתרון עבור 10 בקבוקי מאכיל האחרים.
הניחו חמישה בקבוקי מאכילים בכל כלוב זכר מוכן ואפשרו ליתושים הזכרים לאכול במשך שלושה ימים לפני ניסוי ההזדווגות. תדליק את מנורת מבער הכספית ואת המיקרוסקופ הסטריאו. אפשר למקור האור למנורת מבער הכספית להתייצב במשך 10 דקות.
ואז להגדיר את מסנני פלואורסצנטיות עבור חלבון פלואורסצנטי אדום אחד. שאפו מספר קטן של יתושים בכל פעם לתוך צינור הזכוכית של השאיפה האוראלית. דרך צינור הזכוכית, התבונן בגופם של היתושים הזכרים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו הפלואורסצנטי.
השתמש רק יתושים זכר מסומן עם רודמין B לניסוי. העבר להגדיר יתושים זכרים לתוך 12 כוסות נייר מאובטח עם רשת. מניחים 10 סוכרוז מאכילים יתושים זכרים לכוס לשש כוסות, ו-10 סוכרוז של רודמין B האכיל יתושים זכרים בכוס בשש הכוסות האחרות.
חזור על שלב זה עבור יתושים זכרים להגדיר B. תקימו 12 כלובים לבדיקת ההזדווגות. בכל אחד מששת הכלובים, כלולים 10 סט יתושים זכרים שהם רודמין B מסומן, 10 יתושים זכרים B לא מסומנים, ו -10 יתושים נקבות בתולה מסוג בר.
בששת הכלובים האחרים, כלולים 10 יתושים זכרים לא מסומנים, 10 רודמין B מסומן סט יתושים זכרים B, ו -10 יתושים נקבות בתולה מסוג בר. תייג את הכלובים האלה כדי להבחין בבירור בין שני שילובי ההזדווגות. מניחים את כוסות הזכרים המתאימות בכלובי ההזדווגות בהתאם לתוויות.
מוציאים את הרשת ומקישים בעדינות על הכוס כדי לדחוף את הזכרים מהכוס. הסר בזהירות את הנייר והרשת מהכלוב כדי להבטיח שאף יתוש לא יברח מהכלוב. אפשר ליתושים הזכרים להתאקלם בכלוב ההזדווגות לפחות שעה.
באמצעות שאיפה אוראלית, העבירו יתושים נשיים בתוליים מסוג בר ל-12 כוסות נייר, כל המכילה 10 יתושים. לאחר תקופת ההתאקלמות של היתושים הזכרים, מעבירים אחת של נקבות לכל כלוב הזדווגות ומסירים את הרשת. דוחפים בעדינות את הכוס כדי לעודד את כל היתושות שנותרו מהכוס, ואז מסירים בזהירות את הנייר והרשת מהכלוב כדי להבטיח שאף יתוש לא יברח מהכלוב.
אפשר להזדווגות במשך שלוש שעות, ולאחר מכן לסיים את ניסוי ההזדווגות על ידי הסרת כל היתושים מכל כלוב עם שאיפה מכנית. קר-ירדים את היתושים על קרח לפחות חמש דקות. כאשר היתושים הם מרדים לחלוטין, בעדינות להרים את היתושים הנשי ולשכן אותם בכוס נייר נפרדת מאובטחת עם רשת.
תייג את הנייר על ידי העברת התווית המתאימה מכלוב ההזדווגות על הכוס. כדי להבקיע זרע נשי, קר-יראתי את היתושים הנשיים על הקרח לפחות חמש דקות לפני הניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו. לנתח את היתוש הנשי מתחת למיקרוסקופ הסטריאו.
בדוק את הזרע מתחת למיקרוסקופ. אם הנקבה אינה מופרית, כל שלושת הזרעים יהיו ריקים, ואם מופרות, שניים או שלושה מהזרע יהיו מלאים בזרע רוטילי. עבור אנשים מופרים, לקבוע אם זרע מכילים רודמין B מסומן נוזל הזרע על ידי בדיקת אותם תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי מצויד במסנן RFP1.
אם הזרע מלא בנוזל הזרע שאינו מסומן ברודמין B, לא נצפתה פלואורסצנטיות. מצד שני, אם הזרע מכיל רודמין B מסומן נוזל הזרע, זה יהיה פלואורסצ'ה כתום. מטרת התחרותיות בהזדווגות זו הייתה לקבוע אם יכול להיות אובדן כושר הזדווגות גברי לאחר מספר דורות של הזדווגות.
טריפליקטים ניסיוניים של בדיקות התחרותיות של ההזדווגות נערכו, ונתוני ההפריה מוצגים כאן. נקבות פראיות הופרו על ידי הזכרים ההולכים או החיצוניים, עם סימון הדדי. התוצאות מראות כי שיעור הנקבות המופרות על ידי הזכרים ההולכים או החיצוניים לא הושפעו מסימון רודמין B.
אחוז גבוה משמעותית של נקבות הזדווגו עם הזכרים החיצוניים מאשר עם הזכרים מלידה בכל שלושת המשכפלים, מה שמצביע על כך שהזדווגות עלולה להוביל לאובדן כושר ההזדווגות. חשוב להכין כלובים נוספים של יתושים נקבות. אין להשתמש יתושים נקבות מכלוב כי כבר מזוהם על ידי יתושים זכרים, כמו נקבות הפריה מראש יהפוך את כל הנתונים לא חוקיים.
מלבד מעבדה מבוססי הזדווגות assay, הליך זה יכול לשמש בניסויים שחרור-recapture סימן לחקר ביולוגיה של הזדווגות חרקים, דינמיקה של האוכלוסייה, ופיזור שלה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להערכת תחרותיות ההזדווגות אצל זכרי יתושים מסוג Aedes aegypti, שיקול חשוב באסטרטגיות לבקרת אוכלוסיית היתושים. על ידי שימוש ב-Rhodamine B כסמן פלואורסצנטי, חוקרים יכולים להשוות ישירות את הצלחת ההזדווגות של זכרים מסומנים מול זכרים לא מסומנים לאחר חשיפה לנקבות יתושים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- תחרותיות ההזדווגות של יתושים
- אסטרטגיות לדיכוי אוכלוסייה
- התנהגות וביולוגיה של חרקים
רקע
- הצורך בבקרת אוכלוסיית יתושים יעילה עקב תפקידם בהעברת מחלות.
- חשיבות הערכת כושר ההזדווגות הגברי לבקרת איכות בתוכניות טכניקת חרקים סטריליים.
- שימוש בסמנים פלואורסצנטיים לשיפור הדיוק והיעילות הניסויית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקות הזדווגות מבוקרות המשתמשות בזכרים מסומנים ולא מסומנים.
- Aedes aegypti כאורגניזם המודל.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לניתוח תוצאות ההזדווגות ונוכחות זרע.
תוצאות עיקריות
- גידול פנימי מפחית את כושר ההזדווגות הגברי, כפי שמוכח על ידי שיעורי הפריה נמוכים יותר בזכרים מגודלים פנימית בהשוואה לזכרים מגודלים חיצונית.
- סימון פלואורסצנטי לא השפיע על שיעור הנקבות שהפרו.
- שיטה יעילה מאפשרת הערכה מהירה של תחרותיות ההזדווגות.
מסקנות
- מחקר זה מדגיש את ההשפעה של גורמים גנטיים על הצלחת ההזדווגות ב-Aedes aegypti.
- הממצאים רלוונטיים למחקר עתידי בתחום הבקרה על יתושים ודינמיקת האוכלוסייה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
