Name: ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: חקור ייצור אורגנוידים תלת-ממדיים של ריאות מ-totipotent stem cells מושרים לצורך מידול ביולוגיה התפתחותית של הריאה ומחלות. שיטה זו מאפשרת חקר מורכבות תאית ותהליכי התפתחות בצלחת פטרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של תוכנית הגנות המחקר האנושי של UCSD (181180).
1. אינדוקציה אנדודרמית מוחלטת מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (יום 1 - 3)
<ol><li>לאט לאט להפשיר גורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף ממברנה (BM) מטריצה בינונית על קרח 30 דקות לפני השימוש. ב DMEM / F12 קר, תערובת, לדלל את מטריצת GFR BM בינוני 1:1, כך שהוא מהווה 50% של מדיום זה. מכניסים טיפים לפיפטה P1000 למקפיא לצינון לפני השימוש.</li>
	<li>יש לכסות כל באר של צלחת 12 בארות עם 500 μL של מטריצת ממברנה 50% GFR-מרתף מוכן DMEM / F12 קר כקרח. לאחר מספר הבארות הרצוי מצופים, להסיר כל תערובת בינונית עודף ו / או בועות מבארות ומניחים את הצלחת על קרח או מקרר ב 4 °C (75 °F) במשך 20 דקות להגדיר. לאחר מכן, להעביר את הצלחת לאינקובטור ב 37 °C (50 °F) לילה כדי ג'ל ויבש.</li>
	<li>ברגע hiPSCs להגיע 70-90% השפעה, להוסיף 10 מיקרומטר של מעכב קינאז הקשורים Rho (ROCK) מעכב Y-27632 שעה לפני הניתוק. שאפו את התקשורת ולשטוף פעם אחת עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). נתק hiPSCs על ידי הוספת בינוני ניתוק תאים (0.5 מ"ל / באר של צלחת 12 טוב) ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C בחממה CO2 5%.</li>
	<li>הסר צלחות מן החממה ולהוסיף 0.5 מ"ל / 12-באר של תאי גזע עובר בינוני (טבלה 1) לבארות; תצמצם בעדינות תאים באמצעות קצה P1000 כדי להשיג השעיה של תא בודד. העבר תאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל; צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.</li>
	<li>לשאוף את המדיום resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של mTeSR פלוס מדיה בתוספת עם 10 מעכב רוק מיקרומטר (Y-27632). בצע ספירת תאים. הוסף 2.0 x 105 hiPSCs ב 1 מ"ל של mTeSR בתוספת מעכב ROCK Y-27632 לבאר של 12-באר GFR-מרתף קרום בינוני מצופה צלחת. דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה. הערה: יש למטב את מספר זריעת התא לכל שורת תא. 24 שעות לאחר ה ציפוי, בארות צריך להיות 50%-70% מפגש.</li>
	<li>ביום 1, שאפו את mTeSR פלוס ולהוסיף סופי אנדודרם (DE) אינדוקציה מדיה (טבלה 1) בתוספת 100 ננוגרם / מ"ל של activin אנושי A ו 5 מיקרומטר של מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021. הערה: DE מדיה עם מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021 יש להסיר בתוך 20-24 שעות של יום 1 דה אינדוקציה לבידול מוצלח.</li>
	<li>ביום 2 ויום 3, שינוי למדיית אינדוקציה DE בתוספת 100 ננוגרם / מ"ל של activin A בלבד. הערה: דיפרנציה של DE לא תעלה על סך של 72 שעות, או שהיעילות תרד. ביום 4, אם צופים תמותה של תאים גדולים, צמצם את זמן החשיפה הכולל למדיה של DE ב-6-12 שעות.</li>
	<li>כדי לנתח את יעילות DE, אשר יותר מ- 90% CXCR4 ו/או ביטוי cKit באמצעות ציטומטריית זרימה או ניתוח אימונופלואורסצנטיות של FOXA2 ו/או SOX17 (איור 2a).</li>
</ol>2. אינדוקציה של אנדודרם חיצוני (AFE) (יום 4 – 6)
<ol><li>ביום 4, לשנות מדיה כדי סרום בינוני בזאלי חינם (SFBM) (טבלה 1) בתוספת 10 μM SB431542 ו 2 μM דורסומורפין עבור אינדוקציה AFE. שנה את מדיה של AFE מדי יום למשך 3 ימים (יום 4, יום 5 ויום 6).</li>
	<li>כדי לנתח את יעילות AFE, אשר ביטוי חזק של SOX2, TBX1 ו-FOXA2 באמצעות כתמי אימונופלואורסצנטיות (איור 2b).</li>
</ol>3. בידול תא אבות ריאות (LPC) (יום 7 - 16)
<ol><li>ביום 7, להפשיר GFR-מרתף מטריצת ממברנה מדיום על קרח. שאפו את מדיה AFE לשטוף היטב עם PBS 1x. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא ודגרה במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של בינוני מרווה (2% FBS ב- DMEM/F12) לבארות המכילות פתרון ניתוק תאים. שמור על התאים כצברגים על-ידי צנרת למעלה ולמטה בעדינות. ודא שכל התאים מפורקים ומועברים לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.</li>
	<li>הסר את supernatant ו resuspend גלולה התא במדיום מרווה בתוספת 10 ng/mL של חלבון מורפוגני עצם רקומביננטי אנושי-4 (BMP4), 0.1 מיקרומטר של חומצה ראטינואית כל טרנס (RA), 3 מיקרומטר של מעכב GSK3β מעכב / Wnt activator CHIR99021, ו 10 מיקרומטר של מעכב סלע Y-27632.</li>
	<li>בצע ספירת תאים. הוסיפו 2.5 x 105 תאים ל-100 מיקרו-ל' של מטריצת ממברנה קרה במרתף GFR, ערבבו היטב והכניסו טיפה לבאר של צלחת של 12 בארות. לדגור על הצלחת ב 37 °C (30°F) במשך 30-60 דקות כדי לאפשר בינוני כדי פולימר. הוסף 1 מ"ל של מדיה LPC בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632 לכל טוב להבטיח את הירידה הבינונית הוא שקוע לחלוטין דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה.</li>
	<li>ביום 8, 24 שעות לאחר אינדוקציה LPC, לשנות LPC בינוני כדי להסיר מעכב רוק Y-27632. שנה את מדיום LPC כל יומיים במשך סך של 9-11 ימים. הערה: אם המדיום הופך לצהוב בתוך 24 שעות, החלף מדיום מדי יום.</li>
	<li>כדי לנתח את יעילות LPC, אשר ביטוי חזק של גורם התמלול התאי NKX2-1 או בצע ציטומטריית זרימה עבור סמני שטח CD47hi / CD26low15 או CPM18 (איור 2c). באופן גס, כדורי LPC צריכים להיות עגולים ושקופים (איור 2c). הערה: אין להמשיך עם בידול organoid ריאות אם היעילות של NKX2-1 הוא מתחת 30%.</li>
</ol>4.3D אינדוקציה אורנואיד ריאות (יום 16 - 22)
<ol><li>ביום ה-17, מפשירים מטריצת ממברנה במרתף GFR על קרח. שאפו את מדיום האינדוקציה LPC. לאחר מכן להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל של dispase (1 מ"ל) לבאר resuspend תערובת בינונית / dispase עם פיפטה P1000. דגירה ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות. טריטוריאטים שוב את התערובת ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות נוספות.</li>
	<li>מעבירים את הדיספאז והתאים לצינור צנטריפוגה חרוט של 15 מ"ל. השתמש PBS צונן (2-3 מ"ל) כדי לשטוף את הבאר resuspend תערובת dispase / תא. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם. הסר באופן ידני את supernatant, נזהר לא לדחס את שכבת גלולה בינונית / תא. חזור על שטיפת PBS צוננת, וצנטריפוגה צינור צנטריפוגה חרוטית עוד 5 דקות ב 400 x גרם.</li>
	<li>הסר באופן ידני את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של פתרון דיסוציאציה מבוסס טריפסין לצינור צנטריפוגה חרוט. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 12 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, resuspend תאים עם קצה פיפטה P1000. לאחר מכן להוסיף נפח שווה של מדיה מרווה לצינור צנטריפוגה חרוט ולסובב למטה ב 400 x g במשך 5 דקות. שאפו את תאי supernatant ו resuspend במדיום מרווה + 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632. הערה: אינדוקציה אורגנויד ריאות מוצלחת מתרחשת כאשר תאים מוטבעים כצברגים, לא תאים בודדים, להתאים pipetting בהתאם.</li>
	<li>בצע ספירת תאים. חשב את אמצעי האחסון הדרוש כדי להשיג 5.0-8.0 x 104 תאים לבאר. Aliquot תא LPC מצטבר לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x g. הסר עודף supernatant, נזהר לא להתסיס את גלולה התא. השאירו רק 10 μL של מדיה שיורית.</li>
	<li>להשעות מחדש את גלולה התא ב 200 μL של מטריצת ממברנה GFR-מרתף קר ולהוסיף מוסיף קרום תרבית התא (קוטר 6.5 מ"מ, 0.4 מיקרומטר נקבובית, קרום פוליאסטר). לדגור על הצלחת ב 37 °C (30-60 דקות) כדי לאפשר מטריצת ממברנה GFR-מרתף בינוני כדי פולימר.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מדיום אינדוקציה אורגנויד 3D (טבלה 1) בתוספת גורם גדילה פיברובלסט-7 (FGF7) (10 ננוגרם / מ"ל), FGF10 (10 ng/ mL), מעכב GSK3β / Wnt activator CHIR (3 מיקרומטר), גורם גדילה אפידרמלי (EGF) (10 ננוגרם / מ"ל), ו 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632 לתא basolateral של תוספת הממברנה. לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים.</li>
</ol>5.3D הסתעפות אורנואיד ריאות (יום 23 - 28)
<ol><li>ביום 23 שינוי בינוני הסתעפות 3D (טבלה 1) בתוספת FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), מעכב GSK3β / מפעיל Wnt CHIR99021 (3 מיקרומטר), RA (0.1 μM), EGF (10 ננוגרם / מ"ל), ומקדם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) / גורם גדילה שלייתי (PlGF) (10 ננוגרם / מ"ל). לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים. הערה: ביום 6 של בידול הסתעפות תלת-ממדית, אמורים להיות מספר אורגניואידים מסועפים (איור 2).</li>
</ol>6.3D התבגרות אורגנויד ריאות (יום 29 - 34)
<ol><li>ביום 29, לשנות למדיום התבגרות 3D (טבלה 1), אשר זהה 3D הסתעפות בינוני אבל עם תוספת של dexamethasone (50 ננומטר), cAMP (100 מיקרומטר) ו 3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין (IBMX), מעכב פוספודיסטראז המכונה גם איזובוטילקסנתין (100 מיקרומטר). לשנות את המדיום כל יומיים במשך 6 ימים. הערה: בתוך 24 שעות לאחר ההתבגרות 3D, organoids המסתעף צריך להרחיב ולשנות לספירות שקופות.</li>
</ol>7.3D אימונוציטוכימיה של אורגנואיד ריאות
<ol><li>לניתוח אורגנויד ריאות שלם תלת-ממדי, תקן מטריצת ממברנה במרתף GFR בתוספת הממברנה עם 4% paraformaldehyde (PFA) עבור 1 שעות ב 4 °C (7 °F). הטמע בשעווה פרפין והרכב על שקופיות לפי פרוטוקולים סטנדרטיים שפורסמו.</li>
	<li>בצע אחזור אנטיגן לפני הכתם. סמני דרכי הנשימה כוללים KRT5, MUC5AC ו- SCGB3A2. סמנים משועים כוללים SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 ו-HOPX (איור 3).</li>
</ol>8. הסרת אורגנוידים שלמים של ריאות ממטריצת ממברנה במרתף GFR למדיום למעבר, FACS או cryopreservation
<ol><li>כדי לנתק את האורגנוידים ממדיום מטריצת הממברנה במרתף GFR, הסר מדיה מתא הבזל והוסף 2 מיקרוגרם /מ"ל של dispase (1 מ"ל) בתא האפיטל.</li>
	<li>טריטוריאטים בעדינות את התערובת הבינונית/דיספאזה עם פיפטה P1000 ומניחים באינקובטור למשך 15 דקות. טריטוריה בעדינות את התערובת שוב ודגרה במשך 15 דקות נוספות.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של PBS צונן (4 °C) והעבירו אורגנוידים עם המדיום של המטריצה לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. ספין ב 400 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant בזהירות, לא להפריע גלולה התא.</li>
	<li>לשטוף שוב עם 1 מ"ל מצונן PBS ולסובב למטה ב 400 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant בזהירות, לא להפריע תערובת בינוני / תא.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לצינור הצנטריפוגה החרוט, תמזגו בעדינות את מטריצת הממברנה GFR-Basement בתערובת בינונית/תאים. מניחים באינקובטור למשך 12 דקות עבור העברת תאים כצבירים או עבור שימור קריופאורציה), או 20 דקות עבור השעיית תא בודד.</li>
	<li>הוסף נפח שווה של מדיה מרווה וסיבוב כלפי מטה ב- 400 x g למשך 5 דקות. Resuspend בינוני מרווה + 10 מיקרומטר של מעכב רוק Y-27632. הערה: בשלב זה, אין מדיום קרום מרתף שיורית צריך להיראות בצינור. אם נשאר מדיום שיורית, חזור על שלבים 8.5 ו- 8.6.</li>
	<li>בצע ספירת תאים. חשב את אמצעי האחסון הדרוש עבור יישומים במורד הזרם.</li>
</ol>

<ol><li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li>
<li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li>
<li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+and+exogenous+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).</li>
<li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+crosstalk+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li>
<li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li>
<li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+10+%28FGF10%29+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li>
<li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Sonic+hedgehog+%28Shh%29+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li>
<li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal%2C+spatial%2C+and+phenotypical+changes+of+PDGFR%CE%B1+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li>
<li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+on+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li>
<li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li>
<li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li>
<li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2%2B+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li>
<li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).</li>
<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההבחנה המוצלחת של אורגנוידים של ריאות שלמים תלת-ממדיים (WLO) מסתמכת על פרוטוקול רב-שלבי בן 6 שבועות עם תשומת לב לפרטים, כולל זמן חשיפה לגורמי גדילה ומולקולות קטנות, צפיפות תאית לאחר המעבר ואיכות hiPSCs. לפתרון בעיות, ראה טבלה 2. hiPSCs צריך להיות כ 70%-80% confluent, עם פחות מ 5% בידול ספונטני לפני ניתוק. פרוטוקול זה קורא למדיום "mTeSR plus"; עם זאת, מדיום "mTeSR" רגיל שימש גם עם תוצאות דומות והוא פחות יקר. עבור המטריצה החוץ-תאית, אנו משתמשים במדיום מטריצת הממברנה במרתף GFR. אנו מעבר hiPSCs באמצעות ReLes...

הריאה היא איבר מסובך, הטרוגני ודינמי המתפתח בשישה שלבים נפרדים - התבגרות עוברית, פסאודו-לנדולרית, תעלה, סקוקולרית, מכתשית ומיקרו-וסקולרית1,2. שני השלבים האחרונים מתרחשים לפני ולאחר הלידה בהתפתחות האנושית בעוד ארבעת השלבים הראשונים מתרחשים אך ורק במהלך התפתחות העובר אלא אם כן מתרחשת לידה מוקדמת3. השלב העוברי מתחיל בשכבת הנבט האנדיודרמלי ומסתיים עם ניצני קנה הנשימה וניצני הריאות. התפתחות הריאות מתרחשת בחלקה באמצעות איתות בין התאים האפיתל והמנשימלי4. אינטראקציות אלה גורמות להסתעפות ריאות, התפשטות, קביעת גורל תאי ובידול תאי של הריאה המתפתחת. הריאה מחולקת לאזורי ניצוח (קנה הנשימה לספונכיולים סופניים) ולאזורי נשימה (ברונכיולים נשימתיים אל הנפתים). כל אזור מכיל סוגי תאי אפיתל ייחודיים; כולל תאי בסיס, הפרשה, סילציה, מברשת, נוירואנדוקרינית, ויונוציטים בדרכי הנשימה מוליך5, ואחריו תאי I ו- II מכתשיים באפיתל הנשימה6. הרבה עדיין לא ידוע על ההתפתחות והתגובה לפגיעה של סוגי התאים השונים. מודלים אורגנויד ריאות נגזר iPSC לאפשר מחקר של מנגנונים המניעים את התפתחות הריאות האנושיות, את ההשפעות של מוטציות גנטיות על תפקוד הריאות, ואת התגובה של האפיתל ואת mesenchyme לסוכנים זיהומיים ללא צורך ברקמת ריאה אנושית ראשונית.
סמנים המתאימים לשלבים השונים של בידול עוברי כוללים CXCR4, cKit, FOXA2 ו- SOX17 עבור אנדודרם סופי (DE)7, FOXA2, TBX1 ו- SOX2 עבור אנדודרם נוקב מראש (AFE)8, ו- NKX2-1 עבור תאי אב ריאה מוקדמים9. בהתפתחות הריאות העובריות, הניטור מתחלק לוושט הגחון ולקמה הגחוני. ניצני הריאות הימניות והשמאליות מופיעים כשתי ריאות עצמאיות סביב ניצן קנה הנשימה10. במהלך הסתעפות מורפוגנזה, mesenchyme המקיף את האפיתל מייצר רקמה אלסטית, שריר חלק, סחוס, vasculature11. האינטראקציה בין האפיתל למנשים חיונית להתפתחות תקינה של הריאות. זה כולל את הפרשת FGF1012 על ידי mesenchyme ו SHH13 המיוצר על ידי האפיתל.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידול מכוון של hiPSCs לאורגנואידים תלת ממדיים (3D) ריאות שלמות (WLO). אמנם ישנן גישות דומות המשלבות בידוד של תאי אב ריאה באמצעות מיון בשלב LPC כדי להפוך אורגנוידים דמויי כתשית 14,15 (דיסטליים) או אורגנוידים (פרוקסימליים), או ליצור פרונואידים foregut גחוני-קדמוני כדי להפוך אורגנוידים ריאות אנושיים מבטאים תאי מצוחקים וסמנים mesenchymal ו organoids אב ניצן קצה17 כוחה של שיטה זו הוא הכללת סוגי תאי אפיתל ריאות ומזנכימליים לתבנית ולתזמר מורפוגנזה מסועפת ריאות, התבגרות והתרחבות במבחנה.,
פרוטוקול זה משתמש במולקולות קטנות וגורמי גדילה כדי לכוון את ההבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות אנדודרם מוחלט, אנדודרם חיצוני, ותאי צאצא ריאות. תאים אלה מושרים לאחר מכן לתוך אורגנוידים ריאות שלמות 3D באמצעות צעדים התפתחותיים חשובים, כולל הסתעפות והתבגרות. סיכום פרוטוקול הבידול מוצג באיור 1a עם תמונות ייצוגיות של בידול אנדודרמלי ואורגנויד המוצג באיור 1b. איור 1c,d להראות את פרטי ביטוי הגן של בידול אנדודרמלי, כמו גם את ביטוי הגן של אוכלוסיות פרוקסימליות ודיסטליות של תאי אפיתל ריאות לאחר השלמת ההבחנה.

<table><tbody><tr><td><תרבית תאים חזקה></חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 צלחות באר</td><td>קורנינג</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>תוספות 12 בארות, 0.4um, שקוף</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 ללא חומצה רטינואית</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA) Fraction V, תמיסה 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>חזיר' s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/מארז)Stem</td> <td>Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (מעכב סלעים)</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factors/Small Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית All-trans (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R& די סיסטמס</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>מו"פ D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>מו"פ D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>מו"פ D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>מו"פ D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>מו"פ D Systems</td><td>297-VP/CF</td><td></td></tr><<tr><td>strong>נוגדנים ראשוניים</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>קצב דילול</חזק></td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (בוגר)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (mature)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

התפתחות ריאות אנושיות ומחלות כבר קשה ללמוד בשל היעדר רלוונטי ביולוגית במערכות מודל במבחנה . תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs) ניתן להבדיל צעד לתוך organoids ריאות רב תאיים 3D, עשוי הן אוכלוסיות אפיתל ותאים mesenchymal. אנו מסכמים רמזים התפתחותיים עובריים על ידי החדרה זמנית של מגוון גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי ליצור ביעילות אנדודרם סופי, אנדודרם חותם מראש, ולאחר מכן תאי אב ריאה. תאים אלה מוטמעים לאחר מכן בגורם גדילה מופחת (GFR)-מרתף מטריצת ממברנה מדיום, המאפשר להם להתפתח באופן ספונטני לתוך organoids ריאות 3D בתגובה לגורמי גדילה חיצוניים. אלה אורגנוידים ריאות שלם (WLO) לעבור שלבים התפתחותיים ריאות מוקדם כולל מורפוגנזה המסתעפת והתבגרות לאחר חשיפה דקסמתזון, AMP מחזורי ואיזובוטילקסנתין. WLOs מחזיקים בתאי אפיתל דרכי הנשימה המבטאים את הסמנים KRT5 (בזאל), SCGB3A2 (מועדון) ו- MUC5AC (גביע) כמו גם תאי אפיתל מכתשיים המבטאים HOPX (סוג מכתשי I) ו- SP-C (סוג מכתשי II). תאים mesenchymal נוכחים גם, כולל אקטין שריר חלק (SMA), קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם A (PDGFRα). ניתן לשמור על WLOs נגזר iPSC בתנאי תרבות תלת-ממדית במשך חודשים רבים וניתן למיין עבור סמני שטח כדי לטהר אוכלוסיית תאים ספציפית. ניתן להשתמש ב-WLOs שמקורם ב-iPSC גם כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות, כולל איתות בין אפיתל הריאות למזנשים, כדי לדגמן מוטציות גנטיות על תפקוד והתפתחות תאי הריאה האנושיים, ולקבוע את הציטוקסיות של חומרים מדביקים.

24 שעות לאחר ה ציפוי, יום 1, iPSCs צריך להיות 50%-90% מפגש. ביום 2, DE צריך להיות 90%-95% confluent. במהלך אינדוקציה של DE, מקובל לצפות במוות תאים משמעותי ביום 4, אך תאים מחוברים ישמרו על מורפולוגיה קומפקטית מרוצפת אבן (איור 2b). הפסק את הבידול אם רוב התאים החסידים מתנתקים ושוקל לקצר את החשיפה למדיית DE באמצעות activin A ב-6-12 שעות. במהלך אינדוקציה AFE, מוות תאים הוא מינימלי, ותאים להישאר דבקים, אבל ייראה קטן יותר והטרוגני יותר. העברת התאים ביום 7 חייבת להיעשות רק אם התשואה של SOX2 חיובי כפ...

המאמר מתאר הבחנה מכוונת צעד של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים לאורגנואידים תלת ממדיים שלמים של ריאות המכילים תאי ריאה אפיתל פרוקסימליים ודיסטליים יחד עם מזנכיים.

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

פרוטוקול זה משתמש בתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים כדי להבדיל אותם לתאי ריאה על מנת לדגמן מחלת ריאות אנושית והתפתחות בצלחת. פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה קשה להשיג ותרבות רקמת ריאה אנושית ראשונית. היתרונות העיקריים של הבחנה בין תאי ריאה מתאי גזע פלוריפוטנטים הוא אספקה מתמדת של תאי ריאה ספציפיים כדי לחקור את התפתחות הריאות האנושיות ומחלות.תאים אלה יכולים להישמר בתרבית התאים לפרקי זמן ארוכים, ניתן להקריע עבור יישומים עתידיים, וניתן לתמרן אותם גנטית כדי לחקור מוטציות גנטיות. תוכיח את ההליך תהיה רייצ'ל מקוויקר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. לפני תחילת הניסוי, להפשיר לאט גורם גדילה מופחת, או GFR, מטריצת קרום מרתף מדיום על קרח, לדלל אותו בנפח שווה של DMEM F12 קר.מכניסים טיפים P1000 למקפיא לצינון לפני השימוש. לאחר מכן, מצפים כל באר של צלחת 12 באר עם 500 microliters של 50% GFR מטריצת ממברנה מרתף מדיום, ולהסיר כל תערובת בינונית עודף בועות מן הבארות. מניחים את צלחות הבאר על גבי קרח רטוב או מקרר בארבע מעלות צלזיוס כדי להגדיר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את הצלחת לחממה 37 מעלות צלזיוס לילה.כאשר PSEs גבוה להגיע 70% השפעה, להוסיף 10 מעכבי סלע micromolar Y27632 לתאי גזע פלוריפוטנטים המושרה אנושי, ולחכות שעה לפני הניתוק. שאף את המדיה, ולשטוף את התאים פעם אחת עם PVS. נתק IPSCs על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של ניתוק תאים בינוני לבאר, ודגר במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה, להוסיף 500 microliters של תאי גזע עובר מדיום לבאר. צנרת בעדינות תאים באמצעות קצה P1000 כדי לקבל השעיה תא אחד. לאחר מכן להעביר את התאים מנותקים לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.Following צנטריפוגה, לשאוף את המדיום, ולנצל מחדש את גלולה התא עם מיליליטר אחד של mTeSR פלוס מדיה בתוספת עם 10 מעכבי ROCK micromolar.לאחר ספירת התאים, הוסף פעמיים 10 ל- IPSCs החמישי לכל באר של צלחת מצופה בינונית GFR 12 היטב, ודגרה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שאף את mTeSR פלוס לפני הוספת אנדודרם מוחלט, או DE, אינדוקציה מדיה. בימים שניים ושלוש, לשנות את התקשורת אינדוקציה DE.ביום הרביעי, התחילו באינדוקציה של AFE על ידי החלפת מדיית אינדוקציה של DE במדיום בזאלי נטול סרום. שנה את AFE מדיום מדי יום למשך שלושה ימים לפני ניתוח יעילות AFE בסוף היום השישי. ביום השביעי, להפשיר מטריצת קרום מרתף GFR בינוני על קרח לשימוש מאוחר יותר.בו זמנית, להמשיך עם בידול תא ריאות על ידי שאיפה של מדיה AFE ושטיפת בארות עם PVS. מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון ניתוק התא לבאר ודגר במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של מדיה מרווה לבארות המכילות פתרון ניתוק תאים.שמור על התאים כצברגים על-ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. ודא שכל התאים מנותקים, אבל להעברתם לצינור חרוטי 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. הסר supernatant ו resuspend גלולה התא במדיה אינדוקציה LPC.לספור את התאים, ולהוסיף 2.5 כפול 10 לתאים החמישיים ל 100 microliters של מטריצת מרתף GFR קר מדיום, ולערבב היטב. מניחים טיפה לתוך באר של צלחת 12 טוב ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה LPC לכל טוב, להבטיח כי הירידה הבינונית הוא שקוע לחלוטין דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.ביום השמיני, לשנות LPC בינוני כדי להסיר מעכב רוק Y27632. המשך לשנות את המדיה כל יומיים ולנתח את יעילות LPC בסוף היום ה-16. ביום 17, לשטוף בארות ולהוסיף 500 microliters של שני מיקרוגרם למיליליטר dispase.פיפטה את תערובת dispase עם פיפטה P1000 ודגרה במשך 15 דקות, ולאחר מכן pipette את התערובת ודגורה במשך 15 דקות נוספות. לאחר הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של מדיה מרווה ל dispase המכיל בארות, ולהעביר את התאים לתוך צינורות חרוט. צנטריפוגה ו resuspend הכדור במיליליטר אחד של PVS צונן, ולאחר מכן לחזור על הצנטריפוגה.ואז resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיום ניתוק התא. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של מדיה מרווה צנטריפוגה שוב. Resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיה מרווה ומעכב 10 מיקרומולר רוק Y27632.בצע ספירת תאים כדי לחשב את אמצעי האחסון הדרוש כדי להשיג שמונה כפול 10 לתאים הרביעיים בכל באר. ואז aliquot נדרש נפח של אגרגטים תא LPC לתוך 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגות מיקרו, וצנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G.הסר עודף supernatant מבלי להסעיר את גלולה התא, משאיר 10 microliters של מדיה שיורית. resuspend גלולה התא ב 200 microliters של מטריצת קרום מרתף GFR קר מדיום ולהעביר את התאים לתוספות קרום תרבית התא.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה אורגנויד תלת-ממדי לתא הבסולטרלי של ההוספה, והחליפו אותו במדיום טרי כל יומיים במשך שישה ימים. ביום 23, לעבור את המדיום להסתעפות 3D, ולאחר מכן לשנות את המדיום כל יומיים במשך שישה ימים.ביום 29, עבור למדיום התבגרות תלת-ממדי, והמשיך להחליף את המדיום כל יומיים במשך ששת הימים הבאים. ביום הרביעי של אינדוקציה DE, תאים מחוברים להציג מורפולוגיה מרוצפת אבן קומפקטית. סמני אנדודרם סופיים CXCR4 ו SOX17 מצופה גרעין התבטא, המאשר בידול אנדודרמלי.אינדוקציה מראש מראש אושרה ביום השביעי עם המורפולוגיה מראה תאים דחוסים יותר, ואת הסמנים FOXA2 ו SOX2 על גבי גרעינים. הדור של תאי ריאה תלת-ממדיים אושר עם כדורי תלת-ממד, והביטוי האנדוגני של NKX2-1 GFP בקו תא עיתונאי. לאחר שלושה שבועות של בידול לאורגנואידים של ריאות שלמות, סמני הריאות נותחו על ידי אימונוציטוכימיה.סמנים עבור הסתעפות morphogenesis SOX2 ו SOX9 על גבי גרעינים נצפתה באורגנוידים. סמני ריאות פרוקסימליים P63 ו KRT5, שניהם סמנים של תאי בזאלי, זוהו בהצלחה יחד עם SCGB3A2, המהווה סמן לתאי מועדון. סמני ריאות דיסטליים המושרה סמני Pro SPC ו- SPB עבור תאי סוג II של כיפתנים.וסמני HOPX של תאי סוג משופת I. בנוסף, NKX2-1 ו- ZO1 התבטאו בגרעין. סמני תאי הריאה של Mesenchyme PGFR Alpha, סמן לפיברובלסטים, שבא לידי ביטוי בשיתוף עם SOX9, ייצגו מזנשים דיסטליים.וימנטין התבטא גם הוא ופוזר בכל הריאה. לאחר הליך זה, אורגנוידים ריאות ניתן להשקיע עם תאי גזע פלוריפוטנט המושרה המושרה אנדותל ותאי מערכת החיסון. התפתחות ריאות ומחלות מתרחשות על ידי איתות בין אוכלוסיות התאים האפיתל והמנשימאלי, אך גם מתאי אנדותל ומקרופות.מערכת מודל רקמת ריאה תלת-ממדית רלוונטית קלינית לחקר מחלות האדם וטיפולים.

generation-3d-whole-lung-organoids-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מפנה ביעילות עכבר גזע עוברי תא נגזרות האנדודרם סופי להבשיל דרכי נשימה תא אפיתל. טכניקת בידול זה משתמשת 3 ממדי פיגומי ריאות decellularized לכוון מפרט שושלת ריאות, באווירת התרבות מוגדרת, סרום ללא.

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות מלא agarose דיוק-קאט אמבריולוגיה מרקמות החולה resected המתאימים ליצירת ריאות 3D בתרביות רקמה למחלות ריאה אנושיים מודל במחקרים ביולוגי וביו.

דור של תרבויות רקמות אמבריולוגיה תלת-ממד (3D-LTCs) עבור מידול המחלה

פרוטוקול זה מאפשר התמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידי מעיים. הפרוטוקול מחקה התפתחות אנושית תקינה על ידי התמיינות תאים לאוכלוסייה של אנדודרם סופי, אנדודרם של המעי האחורי ולאחר מכן אפיתל מעיים. זה הופך את הפרוטוקול למתאים לחקר התפתחות מעיים כמו גם יישומי מידול מחלות.

יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגישות דיסוציאציה של רקמות ופירוק תאי, המאפשרות העשרה של תאי אפיתל בני קיימא מאזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה האנושית. כאן גישות אלה מיושמות לניתוח פונקציונלי של תאי אב אפיתל ריאה באמצעות שימוש במודלים של תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים לב אנושי רלוונטיים להתפתחות (hHOs) ביעילות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים על ידי ארגון עצמי. הפרוטוקול מסתמך על הפעלה רציפה של רמזים התפתחותיים ומייצר רקמות לב אנושיות מורכבות ורלוונטיות מאוד מבחינה תפקודית.

יצירת אורגנוידים של לב אנושי המורכבים בעצמם המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

הפרוטוקול מציג שיטה להפקת אורגנואידים של ריאה אנושית מרקמות ריאה ראשוניות, הרחבת האורגנואידים של הריאה וגרימת התמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ודו-ממדיים של דרכי הנשימה, המנצלים בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות.

ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים ליצירה ולאפיון אורגנואידים תלת-ממדיים אוראליים-ושטיים המייצגים נגעים נורמליים, פרה-נאופלסטיים ונגעי קרצינומה של תאי קשקש הנגרמים באמצעות קרצינוגנזה כימית.

מידול קרצינומה של תאי קשקש אוראליים-ושטיים באורגנואידים תלת-ממדיים

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים נגרם אדם מן synoviocytes חולה נגזרת כמו-פיברובלסטים, באמצעות מערכת lentiviral ללא תאים מזינים.

הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את הפרוטוקול לתכנות מחדש של לימפוציטים חודרים לגידול מלנומה לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

חקור ייצור אורגנוידים תלת-ממדיים של ריאות מ-totipotent stem cells מושרים לצורך מידול ביולוגיה התפתחותית של הריאה ומחלות. שיטה זו מאפשרת חקר מורכבות תאית ותהליכי התפתחות בצלחת פטרי.

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

גלה סרטונים נוספים