הקמת תרבויות בינאריות יציבות של סקרייבקטריה סימביוטית מחלל הפה

Saccharibacteria מחויבים טפילים הדורשים תרבות משותפת עם חיידקים מארחים מתאימים. כמו saccharibacteria אוראלי אנושי ניתן לבודד בקלות עבור רוב האנשים באמצעות מינים חיידקיים מארחים ידועים. פרוטוקול זה יאפשר לכל חוקר או מעבדה לבודד את הזנים שלהם בתרבות הבינארית המשותפת.

טכניקה זו משתמשת במכשירים פשוטים וציוד הנמצאים ברוב המעבדות המיקרוביולוגיות ומשמשת בהצלחה לתרבות מעל 30 מבודדים המייצגים שישה מינים של סכריבקטריה. פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי עבור בידוד של מיני קרינה אחרים המועמד ואחריו, כמו גם saccharibacteria מסביבות שונות ויונקים אחרים אם המארחים actinobacterial המתאים ניתן לזהות ולבודד. מי שידגים את ההליך יהיה אנדרו קולינס, פוסט דוקטורנט לשעבר במעבדה שלי.

כדי להתחיל, להתחיל תרבויות של חיידקים מארחים כגון propionica arachnia, עם מספיק זמן להם לגדול לשלב נייח מוקדם. כדי ליזום את התרבות, לחסן שניים עד חמישה מיליליטר של מרק סויה טריפטי המכיל 0.1% תמצית שמרים עם propionica arachnia, ולהדגיר אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר מכן, להרכיב מחזיקי מסנן עם מסלול חרוט 0.2 ממברנות מסנן מיקרומטר.

לעטוף אותם בנייר כסף לעקר על ידי autoclaving, יחד עם צינורות צנטריפוגה ומכלולים כובע. לעקר אספקה נוספת במקרה של מגע מקרי עם משטחים לא סטריליים. לאסוף רובד שיניים על ידי גירוד לאורך קו החניכיים, באמצעות נקודת נייר סטרילית, קורטה חסד, או קיסם סטרילי או קצה פיפטה, ולהעביר אותו חיץ מתאים כגון MRD או PBS.

שמור את הדגימה על הקרח עד מוכן להמשיך הלאה. לשים מחדש את רובד השיניים במרץ באמצעות שילוב של מערבולת צינור עם קצה פיפטה קטן, ולאחר מכן להוסיף את מדגם פלאק בשימוש חוזר לצינור המכיל תשעה מיליליטר של חיץ MRD. בטלו בזהירות את ההרכבה של מסנן סטרילי בטכניקה אספטית.

בטל את ההפעלה של רבע סיבוב והדק מחדש את מחזיק המסנן כדי לוודא שהשרשורים מופעלים כראוי, והמנגנון סגור כראוי. לשטוף את הממברנה על ידי העברת 10 מיליליטר של חיץ MRD דרך המנגנון, באמצעות מזרק. כדי להחיל את הדגימה על המסנן שטוף, להסיר את הוכנה ממזרק ולחבר אותו למנגנון המסנן.

מניחים צינור צנטריפוגה סטרילי מתחת למנגנון הסינון כדי לתפוס את הסינון, ואז יוצקים את דגימת השיניים המפוזרת לתוך המזרק ומעמיסים אותה על המסנן. לאחר מכן להחיל לחץ אור על הכוכנה כדי לדחוף את המדגם דרך המסנן. לשטוף את הממברנה עם עוד 10 מיליליטר של חיץ MRD, ולאסוף את הזרימה דרך באותו צינור כמו מדגם מסונן.

ואז לכסות את הצינור באופן אפטי, ולשמור על קרח. הזן סימן כיוון על הצינור והמכסה כדי לזהות את המיקום של גלולת התא לאחר צנטריפוגה. מניחים את הצינור בצנטריפוגה במהירות גבוהה עם הסימן בצד העליון וצנטריפוגה הדגימות ב 60, 000 G במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, בזהירות לשפוך את supernatant, שמירה על גלולה בצד העליון של הצינור. ואז resuspend גלולה באחד עד שני מיליליטרים של חיץ MRD על ידי מערבולת נמרצת. הכן צינורות תרבות על ידי aliquoting שני מיליליטר של מדיה צמיחה מתאימה לתוך הצינורות.

לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תרבות הלילה של אורגניזמים מארחים ו-100 עד 200 מיקרוליטרים של מדגם מסונן לשימוש חוזר לכל צינור. דגירה את הדגימות המשולבות בתנאים המתאימים לאורגניזם המארח. להעביר את התאים כל יומיים עד שלושה ימים על ידי העברת 200 מיקרוליטרים של התרבות הבינארית לשני מיליליטר של מדיום צמיחה טרי בצינור חדש.

אם התרבויות העוברות אינן מראות צמיחה ב-200 מיקרוליטרים של תרבות מארחת לא מושפעת, כאשר מעבירים את התאים, מחזירים צינורות מחוסנים לחממה. Aliquote 24 מיקרוליטרים של תערובת PCR הורים לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר. במיקרוליטר אחד של תרבות נגועה saccharibacteria, למקם את הצינור ברוכב אופניים תרמו.

הגדר את תוכנית PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט. טען והפעל את מוצרי PCR על ג'ל 1%אגרוס. להקה של כ-600 בסיסים תאשר את נוכחותם של סכריבקטריה.

כדי לאשר את הטוהר של תרבויות חיוביות, לבצע דילול סדרתי פי 10 של התרבות המשותפת של saccharibacteria במאגר סטרילי, ולהפיץ 100 microliters על צלחת אגר. דגירה התרבות בתנאי צמיחה מתאימים להתבונן אורגניזמים מזהמים. להקה של כ-600 בסיסים תאשר את נוכחותם של סכריבקטריה.

זיהוי PCR עשוי להיראות שלילי בתרבויות זיהום ראשוניות עקב מספר נמוך של symbionts saccharibacteria. עם זאת, לאחר כמה קטעים, מוצר PCR חזק צריך להופיע, המציין כי זיהום יציב התרחשה. בדיקת מספר מינים מארחים עם אותו סינון saccharibacteria בדרך כלל יהיה שיעור הצלחה נמוך.

כמו האינטראקציה המארח symbiont הוא מאוד ספציפי. ככל שהתרבויות הנגועות גדלות, צמיחה עכור נורמלי צריך להופיע. ככל שהסימביוזה מבססת את עצמה, תרבויות נגועות ייראו פחות עכורות מתרבויות של אורגניזמים מארחים לא נגועים.

תרבות מזוהמת יכולה להיות מטוהרת על ידי קטיף מושבות נגועות לאחר ציפוי. מושבות נגועות יכולות לפעמים להיות מזוהות על ידי צורת מושבה לא סדירה בהשוואה למושבות לא נגועות. חלקן של מושבות רגילות תלוי בטיטר של סכריבקטריה בתרבות הבינארית.

אם הטיטר נמוך, פחות מושבות ייראו לא סדירות, מה שיקל על בחירת המושבות הנגועות ולהתחיל תרבות בינארית טהורה. תרבויות לא יכולות להיראות חיוביות עבור מספר קטעים. אז יהיה צורך בחלק מהחולים.

כמו כן יש צורך לבדוק באופן קבוע זיהום של תרבויות בינאריות, כמו זה יכול לערער את התרבות ולהוביל למותו של saccharibacteria. התרבות הבינארית יכולה לשמש לכל מיני ניסויי מעבדה. DNA ו- RNA ניתן לחלץ עבור רצף הגנום וניתוח שעתוק, בהתאמה.

פתוגניות יכולה להיחקר גם באמצעות מודלים של בעלי חיים.