Name: צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: חקור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית אוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל באמצעות טכנולוגיית CrystalDirect ותוכנת CRIMS. שיטה זו מאפשרת קביעת מבני חלבונים וגילוי תרופות מרחוק ללא התערבות ידנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לקבוצת הביולוגיה המבנית המשותפת EMBL-ESRF (JSBG) על התמיכה בשימוש ובתפעול של קווי הקרן המקרומולקולריים של ESRF. אנו מודים למת'יו בולר על התמיכה באיסוף נתונים בקו הקרן MASSIF-1 של ESRF ותומאס שניידר וצוות EMBL המבורג על תמיכה מצוינת עם איסוף נתונים ב- P14 של סינכרוטרון פטרהייל (DESY, המבורג, גרמניה). קוצר CrystalDirect פותח בשיתוף עם צוות המכשור ב- EMBL גרנובל. פרויקט זה נתמך במימון תוכנית הקהילה האירופיתH2020 במסגרת הפרויקטים iNEXT (Grant No 653706) ו- iNEXT דיסקברי (Grant No 871037) וכן מתוכנית Région Auvergne-Rhône-Alpes באמצעות תוכנית Booster.

הערה: גישה ממומנת לצינורות אלה עבור מדענים ברחבי העולם נתמכת באמצעות סדרה של תוכניות מימון. ברגע כתיבת כתב יד זה בקשות לגישה מתקבלות באמצעות תוכנית דיסקברי iNEXT (https://inext-discovery.eu), רשת מתקנים אירופית להמרצת ביולוגיה מבנית תרגומית20 במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית או INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). פנה אל המחבר המתאים עבור הדרכים והמסלולים הנוכחיים לקבלת גישה ממומנת בזמן מסוים. פרוטוקול זה מתאר את פעולת צינור החלבון-למבנה וכולל שלבים המשותפים לכל הצינורות שלנו בעוד פרטים עבור שני הצינורות האחרים נדונים בסעיף הבא. ההוראות כאן מתייחסות ל- CRIMS V4.0.
1. מעבדת התגבשות תפוקה גבוהה
<ol><li>לפני שתתחיל, בקש רישום במעבדת HTX באמצעות מערכת CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. אישורי המשתמש מספקים גישה מרחוק לכל ממשקי העיצוב וההערכה הניסיוניים.<ol>
<li>היכנס ל- CRIMS באמצעות נווט אינטרנט (Firefox, Chrome ו- Safari נתמכים). שרת האינטרנט CRIMs מוצפן כדי למנוע מגורמי צד שלישי לגשת לנתונים בזמן שהוא נוסע דרך האינטרנט. פעם אחת ב CRIMS, סדרה של תפריטים משמאל להקרנה לעזור לנהל וליצור דוגמאות, לבקש ניסויים התגבשות, לנהל לדמיין לוחות, וכו '. סדרה של ערכות לימוד בווידאו זמינות ב- https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d. הערה: משתמשים השולחים דגימות באמצעות שליח צריכים לרשום את הדגימות ואת ניסויי ההתגבשות המבוקשים באמצעות CRIMS לפני שליחת המדגם כדי להבטיח שניתן יהיה לעבד אותם ללא דיחוי עם ההגעה. אנא שלחו את פרטי המשלוח htx@embl.fr.</li>
	</ol></li>
	<li>היכנס ל- CRIMS (https://htxlab.embl.fr) באמצעות דפדפן אינטרנט ולחץ על תפריט דוגמאות. פעולה זו תפתח ממשק עם כלי ניהול פרוייקטים ודוגמאות.</li>
	<li>לחץ על לחצן מדגם חדש וספק את המידע המבוקש. CRIMS מאפשר לארגן דוגמאות תחת פרויקטים, יעדים ומבנים שונים. הקצה את המדגם לדגימה קיימת או צור מדגם חדש בשלב זה.</li>
	<li>לאחר הזנת המידע המבוקש לחץ על שמור והגיש בקשה. בחר את פרוטוקול ההתגבשות, את מסכי ההתגבשות שישמשו, את טמפרטורת הדגירה ואת התאריך הרצוי לניסויים.<ol>
<li>השתמש בשדות ההערה כדי לספק אינדיקציות לגבי הדגימות החשובות למפעילי מעבדת HTX לדעת. ניתן גם לבחור מסכים מותאמים אישית (ראה להלן). לאחר הגשת בקשת ההתגבשות היא תאומת על ידי צוות המעבדה של HTX ואישור על תזמון הניסויים יישלח באמצעות דואר אלקטרוני. הקפד לבחור תאריכי ניסוי התואמים לזמנים הנדרשים למשלוח לדוגמה.</li>
	</ol></li>
	<li>ברגע שהדגימות יגיעו למפעילי המתקן במעבדת HTX יבצעו את הניסויים כמבוקש. לאחר הגדרת ניסויי התגבשות, האישור יישלח באמצעות דואר אלקטרוני ומגשי התגבשות יועברו לדימויים האוטומטיים. CRIMS מספקת גישה לכל הפרמטרים הניסיוניים ותעקוב באופן אוטומטי אחר הפעלות הדמיה חדשות. הודעות דואר אלקטרוני יישלחו באופן אוטומטי כאשר תמונות חדשות יהיו זמינות. ניסוי הערכת איכותמדגם המבוסס על תרמופלור המבוסס על פרוטוקול שפותח במתקן25,26 מתבצע עם כל דגימה בשלב זה ויהיה זמין באמצעות CRIMS.</li>
	<li>תמונות של ניסויי ההתגבשות יחד עם תוצאות הערכת איכות המדגם יהיו זמינות ב- CRIMS זמן קצר לאחר הגדרת מגשי ההתגבשות. לחץ על תפריט Thermofluor ולנווט אל המדגם כדי לראות את התוצאות של ניסוי הערכת איכות המדגם.<ol>
<li>לחץ על תפריט צלחות כדי לראות את התמונות מלוחות ההתגבשות. נווט אל המדגם ולחץ על הצג כדי לראות את הפעלת ההדמיה האחרונה או בסימן + (הרחב) כדי לבחור הפעלת הדמיה אחרת. סדרה של כלים מסייעת למצוא ולנווט בקלות בין הדגימות. לדוגמה, לחיצה בתיבת פרוייקט בחלק העליון של המסכים מסננת דוגמאות עבור פרוייקט זה ופונקציות חיפוש זמינות עבור רוב עמודות הטבלה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בממשק תצוגת הצלחת כדי לעזור להעריך ולהבקיע את התוצאות של ניסויי ההתגבשות. הוא מאפשר ניווט דרך בארות שונות של לוחות התגבשות, בחר סוגי תמונות (כלומר, Vis, UV), בחר רזולוציית תמונה או ציוני שיא, למשל. ממשק זה מספק גם את כל הפרמטרים הניסיוניים המשמשים לניסויי ההתגבשות כולל הרכב פתרונות ההתגבשות.</li>
	<li>לחץ על תפריט עידון כדי לעצב מסכי אופטימיזציה קריסטל המבוססים על תנאי פגיעה ראשוניים שזוהו באמצעות ההקרנה הראשונית. תפריט המשנה לכימיקלים ופתרונות מלאי מאפשר להירשם ולנהל את פתרונות מלאי התגבשות. תפריט המשנה מסכים מספק גישה לממשק לעיצוב מיטוב משלך או מסכים מותאמים אישית.<ol>
<li>בחר את סוג הלוח, פתרונות מלאי או תצורות הדרגתיות המתאימות ביותר לעיצוב הניסיוני. ניתן לבקש מ-CRIMS להפיק פלט של קובץ התואם ישירות לרובוט Formulator (Formulatrix) כדי להעביר באופן אוטומטי את המסכים לצלחת או להפיק פלט של מסמך הניתן להדפסה עם אמצעי האחסון לפעולה ידנית.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לחזור על שלבים 1.2-1.8 כדי לבצע ניסויי אופטימיזציה של קריסטל.</li>
	<li>לאחר זיהוי גבישים המתאימים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן, נווטו אל הצלחת הצג ממשק ובחר את התמונה המתאימה לירידה הנכונה בגיבש. ציונים מאוחסנים מראש יעזרו לך לעשות זאת בקלות.<ol>
<li>לחץ על קריסטל קציר כדי להקליט תוכנית קציר קריסטל אוטומטית עבור רובוט קוצר CrystalDirect או על קציר ידני עבור הרכבה קריסטל ידני מסורתי, אם באמצעות CRIMS במתקן שאינו מצויד CrystalDirect. שני הממשקים ינחו את המשתמש בתהליך קצירת הגבישים. CRIMS יתעד באופן אוטומטי ולאחסן את המיקום של גבישים שנקטפו לתוך עמוד השדרה או Unipucks21.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר בתפריט מנהל הגבישים ב- CRIMS. לחץ על תפריט המשנה קריסטלים שנקטפו כדי לבדוק את הדגימות הקפואות. בעת שימוש בקציר CrystalDirect, מוצגות תמונות של תהליך הקציר, כולל תמונות של הסיכות עם הגבישים שנקטפו.</li>
	<li>בחר בתפריט משלוחים כדי להתחבר לסינכרון ESRF או פטרה III וליצור משלוחים לדוגמה עבור ניתוח עקיפה של קרני רנטגן. לחץ על לחצן צור משלוח ובחר את הסינכרוטרון בו ברצונך להשתמש ואת מספר התיק (סיסמת התיק בסינכרוטרון נחוצה כאן). סדרת הממשקים הבאה משמשת לבחירת המחשבים שייכללו במשלוח. המערכת מאפשרת לספק הערות לתמיכה באיסוף נתונים ולקבוע פרמטרים של איסוף נתונים עבור קווי קרן אוטומטיים כמו MASSIF-1.</li>
	<li>אם איסוף הנתונים מתבצע במעבדת ESRF או פטרה III HTX, המפעילים יעבירו את הדגימות לקו הקרן, איסוף נתונים בסינכרוטרונים אחרים ייעשה על חשבון המשתמש עצמו. ניתן לאסוף נתונים על ידי נסיעה לסנכרון, באמצעות פעולת קו קרן מרחוק או ב MASSIF-1. במקרה האחרון, תהליך איסוף הנתונים הוא אוטומטי לחלוטין. בסינכרוטרון, ממשקים ספציפיים ב- ISPyB29 מאפשרים למשתמשים לשחזר את המידע שנשלח על ידי CRIMS ולשייך אליו דיסקיות לדוגמה כך שתוצאות איסוף הנתונים יתקשו באופן אוטומטי. עבור הניסויים המתוארים כאן, איסוף נתונים בסינכרוטרונים בוצע בדרך כלל עם תוכנת MXcube31, בעוד עיבוד נתונים ועידון מבנה בוצע עם atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33, Pipedream32,33 ו Coot35.</li>
	<li>לאחר ביצוע ניסויים באיסוף נתונים CRIMS מאחזר מידע סיכום יחד עם תוצאות של עיבוד נתונים ראשוני בסינכרוטרון ממערכת ISPyB29. עבור לתפריט CRIMS קריסטל מנהל ולחץ על תפריט המשנה נתוני עקיפה קריסטל. כל המידע והמטא-נתונים לגבי איסוף נתוני עקיפה זמינים. ניתן גם להוריד נתונים מעובדים מן synchrotron, כמו גם תמונות עקיפה גלם. הצג אוספי נתונים מרובים או בחר ערכות נתונים ספציפיות. כלי ניהול לדוגמה מאפשרים לנווט ולבחור דוגמאות עבור מבנים ספציפיים של פרוייקטים. הערה: צינור זה מספק פעולה אוטומטית לחלוטין דרך האינטרנט מחלבון טהור לתוצאות עקיפה של קרני רנטגן וניתן להפעילו עם דוגמה אחת או מרובה בו זמנית. זה יכול להיות מיושם על הקשר שונה וסוגי פרויקטים בביולוגיה מבנית.</li>
</ol>

<ol><li>Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automation of X-ray crystallography.</a> Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).</li>
<li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+towards+effective+methods+in+exploiting+high-throughput+technologies+for+the+determination+of+human+protein+structures+of+high+biomedical+value%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).</li>
<li>Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+structural+biology+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Large-scale structural biology of the human proteome.</a> Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).</li>
<li>Rupp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TB+structural+genomics+consortium+crystallization+facility%3A+towards+automation+from+protein+to+electron+density%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).</li>
<li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li>
<li>Cusack, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+is+beautiful%3A+protein+micro-crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small is beautiful: protein micro-crystallography.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).</li>
<li>McCarthy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ID30B+%E2%80%93+a+versatile+beamline+for+macromolecular+crystallography+experiments+at+the+ESRF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASSIF-1%3A+a+beamline+dedicated+to+the+fully+automatic+characterization+and+data+collection+from+crystals+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).</li>
<li>von Stetten, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ID30A-3+%28MASSIF-3%29+%E2%80%93+a+beamline+for+macromolecular+crystallography+at+the+ESRF+with+a+small+intense+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+experiences+with+semi-autonomous+robotic+harvesting+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).</li>
<li>Khajepour, M. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REACH%3A+Robotic+Equipment+for+Automated+Crystal+Harvesting+using+a+six-axis+robot+arm+and+a+micro-gripper%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWagner%2C+A+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22">Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography</a>. 69, 1297-1302 (2006).</li>
<li>Collins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentle%2C+fast+and+effective+crystal+soaking+by+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica%22%5BJournal%5D)">Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing.</a> Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).</li>
<li>Deller, M. C., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+automated+protein+crystal+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica%22%5BJournal%5D)">Approaches to automated protein crystal harvesting.</a> Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).</li>
<li>Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirect%3A+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).</li>
<li>Márquez, J. A., Cipriani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirectTM%3A+A+Novel+Approach+for+Automated+Crystal+Harvesting+Based+on+Photoablation+of+Thin+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Genomics%22%5BJournal%5D)">CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films.</a> Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li>
<li>Cianci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P13%2C+the+EMBL+macromolecular+crystallography+beamline+at+the+low-emittance+PETRA+III+ring+for+high-+and+low-energy+phasing+with+variable+beam+focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li>
<li>iNEXT Consortium . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNEXT%3A+a+European+facility+network+to+stimulate+translational+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology.</a> FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).</li>
<li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li>
<li>Whittle, P. J., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Structure-Based+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Protein Structure-Based drug design.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).</li>
<li>Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallography+for+lead+discovery+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallography for lead discovery in drug design.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).</li>
<li>Krojer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+XChemExplorer+graphical+workflow+tool+for+routine+or+large-scale+protein%E2%80%93ligand+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica%22%5BJournal%5D)">The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination.</a> Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).</li>
<li>Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Crystallization+Likelihood+Through+a+Fluorimetric+Thermal+Stability+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Genomics%22%5BJournal%5D)">Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay.</a> Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).</li>
<li>Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermal+stability+assay+can+help+to+estimate+the+crystallization+likelihood+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).</li>
<li>Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDimasi%2C+N+%22Acta+Crystallographica%22">Acta Crystallographica</a>. F63, 204-208 (2007).</li>
<li>Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiraki%2C+M+%22RFID+tag+system+for+sample+tracking+at+structural+biology+beamlines%22">RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines</a>. , 060074(2019).</li>
<li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB%3A+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>Ericsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MxCuBE%3A+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).</li>
<li>Vonrhein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+and+analysis+with+the+autoPROC+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Data processing and analysis with the autoPROC toolbox.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).</li>
<li>Smart, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+structure+similarity+in+refinement%3A+automated+NCS+and+target-structure+restraints+in+BUSTER%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).</li>
<li>Bezerra, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+protease+uses+distinct+thermodynamic+signatures+for+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2848(2017).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).</li>
<li>Bezerra, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+protease+uses+distinct+thermodynamic+signatures+for+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2848(2017).</li>
<li>Martin-Malpartida, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+genome+wide+recognition+of+5-bp+GC+motifs+by+SMAD+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors.</a> Nature Communications. 8 (1), 2070(2017).</li>
<li>Aragón, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+distinct+roles+of+SMAD2+and+SMAD3+in+FOXH1+pioneer-directed+TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling.</a> Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).</li>
<li>Münzker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment%E2%80%90Based+Discovery+of+Non%E2%80%90bisphosphonate+Binders+of+Trypanosoma+brucei+Farnesyl+Pyrophosphate+Synthase%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase.</a> ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).</li>
</ol>

JAM הוא מחבר שותף של פטנט על מערכת CrystalDirect

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים המתוארים כאן זמינים לחוקרים ברחבי העולם באמצעות תוכניות מימון שונות. נכון לעכשיו, גישה ממומנת לניסויי התגבשות וטכנולוגיית CrystalDirect ניתן להשיג על ידי החלה על תוכנית גילוי iNEXT ו INSTRUCT-ERIC, בעוד גישה לקורות קרן קריסטלוגרפיה מאקרומולקולרית ב- ESRF נתמכת באמצעות תוכנית הגישה למשתמש ESRF. גישה זו ממזערת את העיכוב בין צמיחת הגביש למדידה, מאיצה את התקדמותם של פרויקטים מאתגרים מאוד הדורשים אופטימיזציה מבוססת עקיפה של תנאי ייצור וגיבוש חלבונים ומשחררת מדענים מפעולות מורכבות הקשורות להתגבשות, טיפול בגבישים ותפעול קו קרן, מה שהופך את הקריסטלוגרפיה לנגישת יותר לקבוצות שאינן מומחים. זה יכול לשמש גם לחקירה מהירה של תוספי התגבשות, סוכניphasing או עבור הקרנה מורכבת באמצעות ניסויים התגבשות משותפת. בעוד שרוב פרויקטי הקריסטלוגרפיה עשויים להפיק תועלת מגישה זו, דגימות מסוימות עשויות לדרוש פרוטוקולים מיוחדים שאינם מקובלים על אוטומציה או על הצינורות המוצגים כאן, למשל אלה הדורשים מערכות מיקרופלואידיות או התקני התגבשות מיוחדים מאוד או דגימות שהם מאוד שפתיים ולא יסבלו משלוח.
טכנולוגיית CrystalDirect מאפשרת גם השריית קריסטל אוטומטית17 לאפיון מתחמי מטרות מולקולות קטנות. בשביל זה, צמצם קטן נוצר עם הלייזר לפני תהליך הקציר וטיפה של פתרון המכיל את הכימיקלים הרצויים (כלומר, סוכניphasing או ליגנדים פוטנציאליים) מתווסף על גבי, כך שהוא נכנס במגע עם, ומתפזר לתוך פתרון התגבשות בסופו של דבר להגיע גבישי. פתרונות כימיים יכולים להיות מנוסחים במים, DMSO או ממיסים אורגניים אחרים. לאחר זמן דגירה מסוים ניתן לקצור ולנתח את הגבישים על ידי עקיפה כמתואר לעיל. גישה זו יושמה על אפיון מהיר של מתחמי חלבון ליגנד בהקשר של עיצוב תרופות מבוססות מבנה, כמו גם על הקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול. במקרה האחרון ניתן לנתח במהירות ספריות קטעים עם מאות עד למעלה מאלף שברים. ממשקי CRIMS ספציפיים שאינם מוצגים כאן מאפשרים תכנון ומעקב אוטומטי אחר ניסויי השריית קריסטל, תוך שילוב בין תוכנת CRIMS וחבילת התוכנה Pipedream, שפותחה על ידי Global Phasing Ltd (בריטניה) ומאפשר עיבוד נתונים אוטומטי, פיזות, זיהוי ליגנד ועידון מבנה על פני מאות ערכות נתונים במקביל, ייעול ניתוח נתונים ופרשנות32,33 . לדוגמה, צינור זה הוחל לאחרונה על זיהוי שברים המחייבים הן לאתר הפעיל והן למספר אתרים אלוסטריים של טריפנוסומה ברוסי פרנסיל פירופוספט סינתאז, אנזים מרכזי של הטפיל הגורם טריפנוזומיהזיס אפריקאי אנושי.
הצינורות המוצגים כאן יכולים לתרום להאצת קצב הגילוי בביולוגיה מבנית ולהפוך את הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית לנגישת יותר למספר גדול יותר של קבוצות מחקר. יתר על כן, על ידי הקלת תרכובת בקנה מידה גדול הקרנת שבר הם יכולים לתרום לטפח מחקר תרגום ולהאיץ את תהליך גילוי התרופה, תורם כדי להקל על פיתוח של תרופות טובות ובטוחות יותר נגד מספר גדול יותר של מטרות.

אוטומציה הוצגה בכל השלבים של תהליך הניסוי של קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, החל מהתגבשות וכלה באיסוף ועיבוד נתוני עקיפה1,2,3,4,5,6,7,8,9, כולל מספר טכנולוגיות להרכבה מדגם10,11,12 ,13,14,15,16,17. זה לא רק האיץ את הקצב שבו מבנים קריסטלוגרפיים מתקבלים, אלא תרם לייעל יישומים כמו עיצוב תרופה מונחית מבנה18,19,20,21,22,23,24. בכתב יד זה אנו מתארים כמה מההיבטים של צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים הזמינים במעבדת HTX בגרנובל, כמו גם בטכנולוגיות הבסיסיות.
מעבדת HTX ב- EMBL Grenoble היא אחד המתקנים האקדמיים הגדולים ביותר להקרנת התגבשות באירופה. הוא ממוקם במשותף בקמפוס האירופי פוטון וניוטרון (EPN) יחד עם מתקן הקרינה הסינכרוטרוני האירופי (ESRF), המייצר כמה מקורות הרנטגן המבריקות ביותר בעולם והמכון לאו לנגווין (ILL), המספק קרני נויטרונים בשטף גבוה. מאז תחילת הפעילות בשנת 2003 סיפקה מעבדת HTX שירותים ליותר מ-800 מדענים ומעבדת יותר מ-1,000 דגימות בשנה. למעבדת HTX יש מיקוד חזק בפיתוח שיטות חדשות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, כולל שיטות להערכת מדגם ובקרת איכות25,26 וטכנולוגיית CrystalDirect, המאפשרות הרכבה ועיבוד קריסטל אוטומטיים לחלוטין15,16,17. מעבדת HTX פיתחה גם את מערכת ניהול המידע הקריסטלוגרפית (CRIMS), מערכת מידע מעבדתית מבוססת אינטרנט המספקת תקשורת אוטומטית בין מתקני התגבשות ואיסוף נתונים סינכרוטרון, ומאפשרת זרימת מידע ללא הפרעה לאורך כל מחזור המדגם מחלבון טהור לנתוני עקיפה. באמצעות השילוב של היכולות של מתקן HTX, טכנולוגיית CrystalDirect ותוכנת CRIMS, פיתחנו צינורות אוטומטיים לחלוטין מחלבון למבנה המשלבים סינון התגבשות, אופטימיזציה של קריסטלים, עיבוד אוטומטי של קצירת קריסטלים ואיסוף נתוני קריוקולינג ורנטגן בסינכרוטרונים מרובים לזרימת עבודה אחת ורציפה שניתן להפעיל מרחוק באמצעות דפדפן אינטרנט. צינורות אלה ניתן ליישם כדי לתמוך בקביעה מהירה של מבנים חדשים, אפיון של מתחמי חלבון-ליגנד והקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
מעבדת HTX מצוידת ברובוט התגבשות nonvolume (כולל מודול LCP המאפשר התגבשות של חלבונים מסיסים וממברנה), חוות קריסטל (ב 5 °C (5 °C ו 20 °C), שתי תחנות טיפול נוזלי רובוטי להכנת מסכי התגבשות, ושני קוצרי קריסטל CrystalDirect אוטומטיים עם יכולת לייצר ולאחסן עד 400 סיכות מדגם קפואות לכל מחזור פעולה. מדענים שולחים את הדגימות שלהם למתקן באמצעות שליח אקספרס, אשר מעובדים לאחר מכן על ידי טכנאים ייעודיים במעבדת HTX. מדענים יכולים לתכנן מרחוק סינון התגבשות וניסויי אופטימיזציה באמצעות ממשק אינטרנט המסופק על ידי מערכת CRIMS. באמצעות ממשק זה, הם יכולים לבחור מתוך מגוון רחב של פרמטרים ופרוטוקולים ניסיוניים הזמינים במתקן כדי להתאים לדרישות המדגם הספציפיות שלהם. תוצאות יחד עם כל הפרמטרים הניסיוניים נעשים זמינים למשתמשים בזמן אמת באמצעות CRIMS. כל הדגימות שהתקבלו נמענות בשיטה שפותחה במיוחד המאפשרת להעריך את סבירות ההתגבשות של המדגם25,26,27. בהתבסס על התוצאות של זה בדיקות המלצות ספציפיות נעשות למשתמשים לגבי טמפרטורת הדגירה האופטימלית וניסויי אופטימיזציה מדגם אפשריים. לאחר שנקבעו ניסויי התגבשות, המדען יכול להעריך את התוצאות על ידי התבוננות בתמונות התגבשות שנאספו בנקודות זמן שונות דרך האינטרנט. כאשר מזהים גבישים המתאימים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן, מדענים יכולים להשתמש בממשק ייעודי כדי להקים תוכנית הרכבה גבישית שתבוצע לאחר מכן על ידי הרובוט CrystalDirect.
טכנולוגיית CrystalDirect מבוססת על שימוש במיקרו-לוח התגבשות אדים שונה וקרן לייזר להרכבה ודגימות קריסטל קריו-קרירות לתביעות עקיפה תומכת בסגירת פער האוטומציה הקיים בין התגבשות לאיסוף נתונים15,16,17. בקצרה, גבישים גדלים בלוח דיפוזיה אדים שונה, microplate CrystalDirect. ברגע שהקריסטלים מופיעים רובוט הקציר CrystalDirect מחיל באופן אוטומטי קרן לייזר כדי לחתוך קטע סרט המכיל את הגביש, לחבר אותו סיכת איסוף נתוני עקיפה סטנדרטית, וקורר אותה בזרם גז חנקן (ראה זנדר ואח '2016 ו- https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). לטכנולוגיה זו יש מספר יתרונות נוספים על פני פרוטוקולי הרכבה ידניים או אוטומטיים למחצה של קריסטל. לדוגמה, הגודל והצורה של הגבישים אינם בעיה, מה שהופך אותו קל באותה מידה לקצור גבישים גדולים או microcrystals, לעתים קרובות ניתן להימנע משימוש של קריו-מגן, בשל האופן המיוחד שבו הטכנולוגיה פועלת (ראה התייחסות 17, זנדר ואח '), מה שהופך ניתוח עקיפה רנטגן הרבה יותר פשוט. קרן הלייזר יכולה לשמש גם ככלי כירורגי לבחירת החלקים הטובים ביותר של מדגם כאשר גבישים גדלים על אשכולות או להראות צמיחה אפיטקסית למשל. טכנולוגיית CrystalDirect יכולה לשמש גם לניסויי השריה אוטומטיים17. אספקת פתרונות עם מולקולות קטנות או כימיקלים אחרים לגבישים. ובכך הוא מאפשר לתמוך אוטומטית לחלוטין, בקנה מידה גדול תרכובת הקרנה קטע. לאחר גבישים נקצרים ומוקפאים על ידי הרובוט CrystalDirect, הם מועברים ל- SPINE או דיסקיות Unipuck התואמות לרוב קווי הקרן של הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית הסינכרונית ברחבי העולם. המערכת יכולה לקצור עד 400 פינים (הקיבולת של אחסון קריוגני דיואר) באופן אוטונומי לחלוטין. CRIMS מתקשר עם רובוט הקוצר במהלך התהליך ומספק מעקב אוטומטי אחר דגימות קריסטל (דיסקיות וסיכות). דיסקיות מסומנות הן בברקודים והן בתגי RFID כדי להקל על ניהול מדגם21,28.
CRIMS מספקת ממשק תוכנית יישומים (API) התומך בתקשורת אוטומטית עם מערכת ISPyB התומכת בניהול ועיבוד של איסוף נתונים ברנטגן בסינכרוטרון רבים באירופה ובעולם29. לאחר השלמת קצירת הגבישים האוטומטית, מדענים יכולים לבחור דגימות קריסטל (דיסקיות) וליצור משלוחי מדגם עבור קווי הקרן הקריסטלוגרפיים המקרומולקולריים ב- ESRF (גרנובל, צרפת)7,8,9 אופטרה III סינכרוטרון (המבורג, גרמניה)18,19. CRIMS מעבירים את הנתונים המתאימים לדגימות קו הקרן שנבחרו למערכת המידע של סינכרוטרון יחד עם פרמטרי איסוף נתונים שנבחרו מראש. ברגע שהדגימות מגיעות לקו הקרן הסינכרוטרוני שנבחר, איסוף נתוני רנטגן מתבצע באופן ידני, באמצעות פעולת קו קרן מרחוק או באופן אוטומטי לחלוטין (כלומר, בקו הקרן MASSIF-1 של ESRF8 המופעל על ידי קבוצת הביולוגיה המבנית המשותפת EMBL ESRF (JSBG)). לאחר איסוף נתונים CRIMS מאחזר מידע אוטומטי על תוצאות איסוף הנתונים יחד עם תוצאות עיבוד נתונים ראשוניות המבוצעות על ידי מערכות עיבוד הנתונים של סינכרוטרון ומציג אותו למדען באמצעות ממשק משתמש נוח.
מעבדת HTX מיישמת צינורות אוטומטיים אלה כדי לתמוך בשלושה יישומים שונים, קביעות מהירות של מבנים חדשים, אפיון מהיר של מתחמי ליגנד חלבונים והקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול. להלן אנו מתארים כיצד להשתמש ולהפעיל אותם.

<table><tbody><tr><td>CrystalDirect harvester</td><td>Arinax</td><td></td><td>הרכבה אוטומטית של קריסטל וקירור קריוקיר</td></tr><tr><td>צלחת התגבשות CrystalDirect</td><td>מיטגן</td><td>מק"ט: M-XDIR-96-2</td><td>96-well crytsallization microplate</td></tr><tr><td>Formulator 16</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>להכנה אוטומטית של מסכי התגבשות</td></tr><tr><td>יתושים רובוט</td><td>SPT Labtech</td><td></td><td>להכנת ניסויי התגבשות</td></tr><tr><td>תחנת טיפול בנוזלים Tecan Evo</td><td>Tecan</td><td></td><td>להכנת פתרונות התגבשות</td></tr><tr><td>Spine Pucks</td><td>Mitegen</td><td>מק"ט: M-SP-SC3-1</td><td>פאקים קריוגניים תואמים ל-SPINE למחליפי דגימות סינכרוטרון אוטומטיים</td></tr><tr><td>UniPucks</td><td>Mitegen</td><td>מק"ט: M-CP-111-021</td><td>פאקים קריוגניים אוניברסליים למחליפי דגימות סינכרוטרון אוטומטיים</td></tr></tbody></table>

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן embl htx בגרנובל

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

EMBL Grenoble מפעילה את המעבדה להתגבשות בתפוקה גבוהה (מעבדת HTX), מתקן משתמשים בקנה מידה גדול המציע שירותי קריסטלוגרפיה בתפוקה גבוהה למשתמשים ברחבי העולם. למעבדת HTX יש דגש חזק בפיתוח שיטות חדשות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית. באמצעות השילוב של פלטפורמת התגבשות תפוקה גבוהה, טכנולוגיית CrystalDirect להרכבה והקפאה אוטומטיות לחלוטין ותוכנת CRIMS פיתחנו צינורות אוטומטיים לחלוטין לקריסטלוגרפיה מאקרומולקולרית שניתן להפעיל מרחוק דרך האינטרנט. אלה כוללים צינור חלבון למבנה לקביעת מבנים חדשים, צינור לאפיון מהיר של מתחמי ליגנד חלבונים לתמיכה בכימיה רפואית, וצינור סינון שברים אוטומטי בקנה מידה גדול המאפשר הערכה של ספריות של מעל 1000 שברים. כאן אנו מתארים כיצד לגשת למשאבים אלה ולהשתמש בהם.

צינור הקריסטלוגרפיה האוטומטי שתואר לעיל יושם כדי לתמוך במספר רב של פרויקטים פנימיים וחיצוניים בהצלחה יוצאת דופן. כמה דגשים כוללים את הפרויקט של ג'ינוביץ'-קארוגו ושותפיו למעבדות מקס פרוץ (וינה) המתמקד בניתוח מבני ותפקודי של מפטידג דיפטידיל החיוני לצמיחה של פתוגן חיידקי. הרצף המהיר של הקרנת התגבשות, הערכת עקיפה, אופטימיזציה של קריסטל ומחזורי איסוף נתוני רנטגן (עד 8 איטרציות לפרויקט זה) אפשרו להשיג מודלים מבניים לשלושה מצבים קונפורמציה שונים של החלבון תוך שבועות ספורים, שסיפקו הבנה מכנית מרכזית על הפונקציה של סוג זה של חלבונים36 (ראו איור 1).
דוגמה נוספת היא ממאסיאס ושותפיו לעבודה מהמכון למחקר ביו-רפואי (IRB, ברצלונה) ששילבו כלים ביואינפורמטיים וגישות מבניות לזיהוי מוטיבים חדשים של DNA מחייב עבור גורמי התמלול SMAD3 ו- SMAD4 המעורבים בוויסות גורל התא. עבודה זו הפיקה 6 מבנים ברזולוציה גבוהה של SMAD3 ו -4 מורכבים עם מוטיבים כריכות DNA שונים37,38 חושף יכולת בלתי צפויה עד כה של גורמי שעתוק אלה לזהות ולאגד למגוון רחב של רצפי DNA, שהוא המפתח לפרשנות תפקידם בהקשרים ביולוגיים שונים. טכנולוגיות אלה יושמו גם כדי לתמוך במחקר קנייני בהקשר של פרויקטים של תכנון תרופות מקבוצות מחקר בחברות פארמה וביוטכנולוגיה. לדוגמה, הודות למהירות שתרמה צינורות אלה, ניתן להשיג ניתוח מבני של מתחמי יעד ליגנד מרובים בתוך ימים, וזה בעל ערך רב לתמיכה באופטימיזציה של כימיה רפואית סבבים רצופים בהקשר של פיתוח תרופות. לבסוף יישמנו גם תשתית זו להקרנת קטעים בקנה מידה גדול המבוססת עלקרני רנטגן 39.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62491/62491fig01.jpg"> איור 1: צינור קריסטלוגרפיה אוטומטי. הפעלה משולבת של מעבדת EMBL HTX כולל טכנולוגיית CrystalDirect ותוכנת CRIMS עם קו הקרן MASSIF-1 ב- ESRF ותקשורת אוטומטית בין תוכנת CRIMS ו- ISPyB מאפשרת לתמוך בצינור אוטומטי לחלוטין, נשלט מרחוק של חלבון למבנה המשלב סינון ואופטימיזציה של התגבשות, קצירת קריסטלים אוטומטית וקירור קריו ואיסוף ועיבוד נתונים אוטומטיים. המודלים המבניים תואמים לשלושה מצבים קונפורמציה שונים של פרוטאז מחיידק פתוגניים שזוהה בזמן שיא על ידי יישום צינור36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62491/62491fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בצינורות הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית האוטומטית לניתוח מורכב של חלבון למבנה, ניתוח מורכב מהיר של חלבון ליגנד והקרנת שברים בקנה מידה גדול המבוססת על טכנולוגיית CrystalDirect במעבדת HTX ב- EMBL Grenoble.

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

מעבדת HTX מציעה גישה מקוונת לחלבון אוטומטי לחלוטין לצינורות מובנים שניתן ליישם כדי לפתור מבנים חדשים, ולבצע סינון שברים ולגאני בקנה מידה גדול יותר. באמצעות השילוב של טכנולוגיית CrystalDirect לקצירת קריסטלים אוטומטית וקירור CRI בתוכנת CRIM, שם מדענים יכולים לשלוט בכל תהליך הקריסטלוגרפיה דרך האינטרנט. התחל על-ידי פתיחה וכניסה למערכת ניהול המידע הגרפי של Crystal בדפדפן אינטרנט ולחץ על תפריט דוגמאות כדי לפתוח ממשק עם הפרוייקט בכלי ניהול לדוגמה.לחץ על דוגמה חדשה ובחלון לדוגמה, הזן את המידע המבוקש ולחץ על שמור ובקש. בלוח הבקשות, בחר את פרוטוקול ההתגבשות, את טמפרטורת הדגירה, את מסכי ההתגבשות שישמשו ואת התאריך הרצוי לניסויים שאמורים להיות תואמים לזמן הנדרש למשלוח הדגימה. השתמש בשדות ההערות כדי לספק אינדיקציות לגבי הדגימות החשובות למפעילי מעבדת HDX לדעת.לאחר ההגשה, בקשת ההתגבשות תאומת על ידי צוות מעבדת התגבשות התפוקה הגבוהה. אישור על תזמון הניסוי יישלח בדוא"ל. עם הגעת הדגימה למתקן.אנשי המעבדה יקימו את הניסוי, ישלחו אישור על ההתקנה בדוא"ל ויעבירו את מגשי ההתגבשות לדימויים האוטומטיים. CRIMS יספק גישה לכל הפרמטרים הניסיוניים ויעקוב אחר מפגשי הדמיה חדשים בזמן אמת. כאשר תמונות חדשות יהיו זמינות, התראות בדואר אלקטרוני יישלחו באופן אוטומטי.כדי לראות את התמונות מלוחות ההתגבשות, פתח את תפריט הצלחות ונווט אל המדגם. לחץ על תצוגה כדי לראות את הפעלת ההדמיה האחרונה או לחץ על סימן ההרחבה כדי לבחור הפעלת הדמיה אחרת ולבדוק את היסטוריית השחרור. כדי לסנן דוגמאות עבור פרוייקט נבחר.לחץ על תיבת הפרוייקט הספציפית. פונקציות חיפוש זמינות גם עבור רוב עמודות הטבלה. כדי להעריך ולהבקיע את תוצאות ניסויי ההתגבשות, בחר את ממשק תצוגת הלוח ונווט בין הקירות השונים של לוחות ההתגבשות.בחרו את סוג התמונה ובחרו את איכות התמונה או רשמו את הציונים. ממשק התצוגה מספק גם את כל הפרמטרים הניסיוניים המשמשים לניסויי ההתגבשות, כולל הרכב פתרון ההתגבשות. לעיצוב מסכי מיטוב קריסטל בהתבסס על תנאי הפגיעה העיקריים שזוהו באמצעות ההקרנה הראשונית, פתחו את תפריט עידון ובחרו בתפריט המשנה 'מסכים'.בחר את סוג הלוח, פתרונות מלאי או תצורות הדרגתיות המתאימות ביותר לעיצוב הניסיוני. ניתן לבקש מ-CRIMS להפיק פלט של קובץ התואם ישירות לפורמולה הרובוטית formulator כדי להזרים באופן אוטומטי את המסכים לצלחת או להפיק פלט של מסמך הניתן להדפסה אך את אמצעי האחסון לפעולה ידנית. לאחר שהקריסטל מתאים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן זוהו, נווטו לממשק תצוגת הצלחת והשתמשו בציונים המאוחסנים מראש כדי לבחור את התמונה המתאימה לירידה הנכונה של התגבשות.לחץ על קצירת קריסטל כדי להקליט תוכנית אוטומטית לקצירת קריסטל מרובוט הקוצר הישיר של הקריסטל. CRIMS יתעד באופן אוטומטי ולאחסן את המיקום של הגבישים שנקטפו לתוך עמוד השדרה או דיסקיות יחידה. לאחר מכן, מפעילים שהמתקן שלנו יסיר את הצלחות עם תוכניות הקציר מהדימויים ויעביר אותם לרובוט CrystalDirect.לאחר השלמת קצירת הגבישים, הדיסקיות המכילות את הדגימות ממוקמות לתוך CX 100 Dewar או מועברות לסנכרטרון על פי בחירתך. כדי לבדוק את הדגימות מקוררות ההקפאה, פתחו את תפריט קריסטל מנג'ר ובחרו קריסטלים שנקטפו. התמונות של תהליך הקציר, כולל התמונות של הסיכות עם הגבישים שנקטפו יהיו זמינים שם.כדי ליצור משלוחים לדוגמה עבור ניתוח עקיפה של קרני רנטגן, פתח את תפריט המשלוחים ולחץ על צור משלוח כדי לבחור את סינכרוטרון של עניין ואת מספר התיק. ניתן גם להזין הערות התומכות באיסוף הנתונים וכן פרמטרים מוגדרים מראש לאיסוף נתונים בקווי קרן אוטומטיים לחלוטין. מעבדת HDX מספקת גם גישה להקרנת שברים בקנה מידה גדול אוטומטית לחלוטין.משאבי CRIMS לעיבוד נתונים אוטומטי ולזיהוי כניסות המבוססים על תוכנת ההשתתפות הגלובלית Pipe Dream, מאפשרים להעריך ולתעדף במהירות תוצאות על פני מאות עד אלפי ערכות נתונים בפרויקט אחד. CRIMS מתקשרת עם מערכות ניהול המידע של סינכרוטרון ומאחזרת מידע על ניסויי עקיפה בפועל. פתח את תפריט קריסטל מנהל ובחר נתוני עקיפה מקריסטל כדי להציג מידע סיכום ואת התוצאות של עיבוד הנתונים הראשוני בסינכרוטרון.בניתוח מייצג זה, צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים שימשו כפי שהודגמו, לזיהוי מבני של חלבונים שונים. כפי שנצפו, שלושה מצבי אישור שונים של פרוטאז מחיידק פתוגניים זוהו תוך זמן קצר מאוד, הודות לרצף המהיר של אופטימיזציה של סינון קריסטל ומדידות עקיפה. צינור זה הוחל לאחרונה גם על זיהוי של שברים, מחייב הן פעיל במספר אתרים אלסטריים של טריפנוסומה ברוסי.פרנסיל פירופוספט סינתאז אנזים מפתח של הטפיל הגורם טריפנוזומיה אפריקאית אנושית. תהליך זה ממזער את העיכוב בין צמיחת הגביש למדידה, מאיץ את ההתקדמות. זה גם משחרר מדענים מפעולות מורכבות כמו טיפול בגבישים ותפעול קו קרן עיבוד קריסטלוגרפיה, נגיש יותר ללא מומחים.גישה זו יכולה לתרום לטיפוח מחקר תרגום ולאחר מכן להאיץ את תהליך גילוי הסמים. תרומה לפיתוח תרופות טובות ובטוחות יותר נגד מספר גדול יותר של מטרות.

the-automated-crystallography-pipelines-at-embl-htx-facility

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הפרוטוקול מתאר גישה תפוקה גבוהה לקביעת מבנים של חלבונים בממברנה באמצעות אלקטרונים cryo-3D טומוגרפיה ועיבוד תמונה. זה מכסה את הפרטים של הכנת הדגימה, איסוף נתונים, עיבוד נתונים לפרשנות, מסכם עם ייצור של היעד מייצג את הגישה, HIV-1 גליקופרוטאין מעטפה. נהלים אלה חישובית מעוצבים באופן המאפשר לחוקרים וסטודנטים כדי לעבוד מרחוק לתרום עיבוד וניתוח של נתונים מבניים.

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

קביעת מבנה פתרון של חלבון על ידי פיזור קטן זווית קרני רנטגן (SAXS) דורש דגימות monodisperse. כאן, אנו מציגים שתי אפשרויות על מנת להבטיח עיכובים מינימאליים בין הכנת מדגם ורכישת נתונים: כרומטוגרפיה בגודל הדרה מקוון (SEC) כרומטוגרפיה היון-Exchange Online (IEC).

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לפברק ופועלים microfluidic התקנים עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. בנוסף, הוא מתאר כיצד לפקח התגבשות חלבונים על ידי פיזור אור דינאמי וקיבלתי כיצד לעבד ולנתח נתונים עקיפה.

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

אנו מציגים את השימוש בפרוטוקול MeshAndCollect כדי לקבל ערכת נתונים עקיפה מוחלטת, לשימוש בקביעת מבנה עוקבות, המורכב עקיפה חלקי ערכות נתונים שנאספו מקריסטלים קטנים רבים של החלבון הניאון Cerulean.

מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

מחקרים מבניים של ביומקרומולקולים על ידי קריסטלוגרפיה דורשים גבישים באיכות גבוהה. כאן אנו מדגימים פרוטוקול שיכול לשמש את OptiCrys (מכשיר אוטומטי לחלוטין שפותח במעבדה שלנו) ו/או כפתורי מיקרו-דיאליזה לגידול גבישים גדולים ואיכותיים המבוססים על ידע בדיאגרמת שלב ההתגבשות.

אופטימיזציה של צמיחת קריסטל עבור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית נויטרון

הקרנת שברים קריסטלוגרפיים במלון הלמהולץ-זנטרום ברלין מתבצעת באמצעות זרימת עבודה עם ספריות מורכבות ייעודיות, כלי טיפול בגבישים, מתקני איסוף נתונים מהירים וניתוח נתונים אוטומטי ברובו. הפרוטוקול שהוצג מתכוון למקסם את התפוקה של ניסויים כאלה כדי לספק נקודות התחלה מבטיחות לתכנון ליגנד מבוסס מבנה במורד הזרם.

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

מאמר זה מתאר את תהליך XChem המלא לסינון מקטעים מבוסס גביש, החל מהגשת בקשה לגישה וכל השלבים הבאים להפצת נתונים.

השגת סינון מקטעים יעיל במתקן XChem ב-Diamond Light Source

פרוטוקול זה מפרט סינון התגבשות בתפוקה גבוהה, החל מהכנת 1,536 לוחות מיקרו-אסאי ועד לסוף חלון זמן ניסיוני של 6 שבועות. פרטים כלולים על הגדרת הדגימה, ההדמיה המתקבלת וכיצד משתמשים יכולים לבצע ניתוחים באמצעות ממשק משתמש גרפי התומך בבינה מלאכותית כדי לזהות במהירות וביעילות תנאי התגבשות מקרומולקולרית.

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

חקור קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית אוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל באמצעות טכנולוגיית CrystalDirect ותוכנת CRIMS. שיטה זו מאפשרת קביעת מבני חלבונים וגילוי תרופות מרחוק ללא התערבות ידנית.

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל

גלה סרטונים נוספים