Name: מכתים את הציטופלסמי Ca2+ עם פלואו-4/AM בעיסת תפוחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למדו לבודד פרוטופלסטים חיים מעיסת תפוחים ולצבוע Ca²⁺ ציטופלסמי באמצעות Fluo-4/AM. שיטה זו מאפשרת הדמיית סידן מהירה ולא פולשנית בתאי צמחים לחקר פיתוח פירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט שיפור המגוון החקלאי של מחוז שאנדונג (2019LZGC007) וצוות החדשנות של עץ הפירות של מערכת הטכנולוגיה המודרנית של התעשייה החקלאית בשאנדונג (SDAIT-06-05).

1. מיצוי פרוטופלסט
<ol><li>הכן את הפתרון הבסיסי: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנולפונית, ו 0.4 M D-סורביטול. הערה: ה- pH של הפתרון הבסיסי הותאם ל- 5.8 עם חיץ טריס של 0.1 M, סונן באמצעות מסננים מסיסים במים בגודל 0.22 מיקרומטר ואוחסנו ב- 4 °C (70 °F).</li>
	<li>הכן את הפתרון אנזימטי: לערבב 0.3%(w/v) Macerozyme R-10 ו 0.5%(w/v) cellulase R-10 עם הפתרון הבסיסי.</li>
	<li>הוסף 0.5 מ"ל של פתרון אנזימטי לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. בחר תפוח בריא ובשלות. לאחר מכן פורסים את עיסת 10 x 5 x 1 מ"מ3 גודל(איור 1A-1C).</li>
	<li>מניחים את חתיכות עיסת פירות התפוח לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל פתרון אנזימטי ולאחר מכן לסגור את הצינור(איור 1D).</li>
	<li>לדגור על הצינור ב 28 °C (50 °F) במשך 1 שעות, רועד ב 70 סל"ד / דקה בשייקר בחושך.</li>
	<li>לשטוף את חתיכות עיסת. שאף את כל הפתרון אנזימטי ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון הבסיסי.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-300 על גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כדי להשיג השעיה protoplast, לשאוף את הפתרון מתחתית צינור הצנטריפוגה(איור 1E).</li>
</ol>2. כתמי פלואורסצנטיות של יון סידן במולקולה קטנה
<ol><li>הכן את פתרון הטעינה פלו-4/AM עם 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127, 10x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS:80 mM Na2HPO4, 1.36 M NaCI, 20 mM KH2PO4ו 26 מ"מ KCI) ביחס של 1:1:2.</li>
	<li>הוסף 1 μL של פתרון טעינה Fluo-4/AM 99 μL של השעיית protoplast הנוכחי בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. ודא כי הריכוז הסופי של צבע פלואורסצנטי הוא 5 מיקרומטר. לערבב את הפתרון ולאחר מכן לסגור את הצינור.</li>
	<li>La3+ טיפול: הכן פתרון 100 μM La3+ עם 98 μL של ההשעיה protoplast, 1 μL של 10 mM La3 +, ו 1 μL של פתרון טעינה Fluo-4/AM. מערבבים את הפתרון וסוגר את הצינור.</li>
	<li>דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F) בחושך.</li>
	<li>לשטוף את הפרוטופלסטים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף 70 μL של הפתרון ולהוסיף 70 μL של הפתרון הבסיסי.</li>
	<li>לדגור על השעיית protoplast ב 37 °C (37 °F) במשך 30 דקות כדי לבטל לחלוטין את esterify.</li>
	<li>שאפו 15 μL של השעיית protoplast ולטפטף על שקופית.</li>
	<li>שימו לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי(איור משלים S1). הערה: השתמש במצלמת צבע עם רגישות גבוהה, כלומר חיישן CMOS של 3.2 מגה-פיקסל (2048 x 1536) עם רזולוציה של 3.45 מיקרומטר פיקסלים.</li>
	<li>בחר את ערוץ GFP להדמיה (20x). הגדר את הבהירות ל- 0.5. הערה: תאורה היא קוביות תאורת LED בעוצמה מתכווננת עם ערכת מסננים משולבת בציפוי קשיח. אורך גל העירור של פלואו-4/AM הוא 490 ננומטר.</li>
</ol>3. בחן הכדאיות של הפרוטופלסט
<ol><li>הכן את פתרון מלאי פלואורסין דיקטאט (FDA): להמיס את ה-FDA אצטון עד הריכוז הסופי הוא 1 מ"ג/ מ"ל.</li>
	<li>הכן את פתרון העבודה של ה-FDA עם 1 μL של פתרון המלאי ו 99 μL של אצטון.</li>
	<li>הוסף 1 μL של פתרון עבודה ה-FDA 99 μL של השעיית protoplast. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאחר מכן לסגור את הצינור. הערה: הריכוז הסופי של ה-FDA הוא 100 מיקרוגרם / L.</li>
	<li>כתם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך.</li>
	<li>הכן את השקופיות והתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>בחר בערוץ GFP להדמיה (איור 1F).</li>
</ol>4. ניתוח תמונה
<ol><li>נתח את התמונות שנרכשו באמצעות ניתוח תמונות ותוכנות גיליון אלקטרוני (למשל, Image-Pro Plus ו- Excel 2010).</li>
	<li>בחר שני קטרים אנכיים מהפרוטופלסטים כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות(איור משלים S2). מדד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל הפרוטופלסטים תחת טיפולים שונים נמדד. לעיבוד סופי, השתמש בתוכנת עריכת תמונות.</li>
</ol>5. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית (איור משלים S3). הנתונים מוצגים ב- Mean ± SD. מבחן ה-tשל התלמיד שימש לניתוח ההבדלים בין קבוצות הניסוי.</li>
</ol>

<ol><li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+calcium%3A+Transport+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).</li>
<li>Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Sciences+in+China%22%5BJournal%5D)">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li>
<li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li>
<li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color%2C+flavor%2C+texture%2C+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables%3A+desirable+levels%2C+instrumental+and+sensory+measurement%2C+and+the+effects+of+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li>
<li>Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+apple+fruit+firmness--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal-+American+Pomological+Society%22%5BJournal%5D)">Factors affecting apple fruit firmness--a review.</a> Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).</li>
<li>Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+softening+of+apple+%28Malus+domestica%29+fruit%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Experimental+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review.</a> New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).</li>
<li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+across+plant+membranes%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li>
<li>Miqueloto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+fruit+calcium+content+and+susceptibility+to+bitter+pit+in+cultivars+of+apple%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+horticulturae%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple.</a> Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).</li>
<li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+%27Huangguan%27+pears+during+cold+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li>
<li>Vinh, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+on+blossom-end+rot+incidence+in+two+tomato+cultivars+in+relation+to+calcium+nutrition+and+fruit+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Horticulture+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth.</a> The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).</li>
<li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Agricultural+Research+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).</li>
<li>Hirabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+practical+red+fluorescent+probe+for+cytoplasmic+calcium+ions+with+greatly+improved+cell-membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability.</a> Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca%282%29%28%2B%29+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics.</a> Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca%282%29%28%2B%29+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators.</a> Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2%2B-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+inexpensive+method+of+loading+fluorescent+dye+into+pollen+tubes+and+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs.</a> PLoS One. 11, 0152320(2016).</li>
<li>Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calreticulin+is+required+for+calcium+homeostasis+and+proper+pollen+tube+tip+growth+in+Petunia%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia.</a> Planta. 245 (5), 909-926 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADK2+positively+modulates+abscisic+acid-induced+stomatal+closure+by+affecting+accumulation+of+H2O2%2C+Ca2%2B+and+nitric+oxide+in+Arabidopsis+guard+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells.</a> Plant Science. 262, 81-90 (2017).</li>
<li>Niu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+availability+regulates+the+development+of+root+hairs+in+Arabidopsis+thaliana+%28L.%29+Heynh%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.</a> Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).</li>
<li>Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading+calcium+fluorescent+probes+into+protoplasts+to+detect+calcium+in+the+flesh+tissue+cells+of+Malus+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica.</a> Horticulture Research. 7, 91(2020).</li>
<li>Boyer, J., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+phytochemicals+and+their+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Journal%22%5BJournal%5D)">Apple phytochemicals and their health benefits.</a> Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li>
<li>Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hyperpolarization-activated+calcium+channels+in+apical+pollen+tubes+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia.</a> New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx6+regulates+left%2Fright+patterning+in+mouse+embryos+through+effects+on+nodal+cilia+and+perinodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling.</a> PLoS One. 3 (6), 2511(2008).</li>
<li>DeSimone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+taste+receptor+cell+%5BCa2%2B%5Di+modulate+chorda+tympani+responses+to+salty+and+sour+taste+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).</li>
<li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).</li>
<li>Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluo-3+to+measure+cytosolic+Ca2%2B+in+platelets+and+neutrophils.+Loading+cells+with+the+dye%2C+calibration+of+traces%2C+measurements+in+the+presence+of+plasma%2C+and+buffering+of+cytosolic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2.</a> Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+Ca+content+and+distribution+in+two+Gesneriaceae+species+reveals+distinctive+mechanisms+to+cope+with+high+rhizospheric+soluble+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).</li>
<li>Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+Ca2%2B+in+cells+of+intact+wheat+roots%3A+loading+of+acetoxymethyl+ester+of+Fluo-3+under+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature.</a> Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).</li>
<li>Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+loading+ester+fluorescent+Ca2%2B+and+pH+indicators+into+pollen+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia.</a> Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+actin+filaments+induces+mitochondrial+Ca2%2B+release+to+the+cytoplasm+and+%5BCa2%2B%5Dc+changes+in+Arabidopsis.+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs.</a> BMC Plant Biology. 10, 53(2010).</li>
<li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים עם תוכן מאמר זה.

במחקר זה, פרוטופלסטים קיימא התקבלו על ידי הידרוליזה אנזימטית. שימו לב כי שיטה זו דורשת תפוחים טריים. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר בידוד מהיר של מספר רב של פרוטופלסטים מעיסת פירות לשימוש במחקרים. תחולתה של שיטה זו אינה מוגבלת ל'פוג'י'; את הפרוטופלסטים של עיסת התפוחים של 'Dounan' ו'דבש קריספ' ניתן לחלץ גם באמצעות אותו פרוטוקול (איור משלים S4). הפתרון protoplast לאחר אנזימוליזיס מכיל פסולת תאים, אשר שופרה במקצת בהשוואה לשיטות קודמות. כחומר תאי חיוני, פרוטופלסטים עיסת תפוח יכול לשמש עבור טכנולוגיית ביטוי חלבון התא...

Ca2 + ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות צמחים ומטבוליזם1,2. כמו כן, הוא מסדיר תכונות איכות פירות3,4 , כוללקשיות,תכולת הסוכר, ורגישות להפרעות פיזיולוגיות במהלך אחסון5,6. ציטופלסמי Ca2+ ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות ומווסת את צמיחת הצמח ופיתוח7. הפרעה של הומאוסטזיס סידן הסלולר יכול לגרום לבור מר בתפוחים8, מחלת כתם חום באגסים9, וריקבון טבור בעגבניות10, המשפיעים על איכות הפרי וגורמים להפסדים כלכליים חמורים3,11. להדמיית סידן יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית מספקת והיא שיטה חשובה להתבוננות בדינמיקה Ca2+ בתאים חיים12,13.
נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות עיקריות להדמיית סידן תאי בתאים חיים: האחת משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות קטנות-מולקולריות כימיות14, והשנייה היא חיישן קידוד הגנים (GECI)15,16. בהתחשב בקושי להקים מערכת מהונדסת יציבה בעצי פרי ופיתוח פירות ארוך יותר, GECIS אינו מתאים להדמיית פלואורסצנטיות של פירות Ca2+ .
למולקולות פלואורסצנטיות קטנות כגון Fluo-4/AM יש יתרון מסוים: צורת אסתר AM שלהן (נגזרת אסתר אצטוקסימתיל חדיר לתא) יכולה להיות נטענת בקלות בתפזורת לתאים חיים ללא צורך בהדבקה, מה שהופך אותה לגמישה, מהירה ולא ציטוקסית17. Fluo-4/AM יכול להיות טעון בהצלחה לתוך צינור האבקה של Pyrus pyrifolia18 ו Petunia,19, כמו גם לתוך תאי שמירה20 ושיער שורש של Arabidopsis21.
נכון לעכשיו, ישנם דיווחים מעטים על הכתמת פלואורסצנטיות סידן של תאי עיסת22. כאלמנט מינרלי חשוב, סידן ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה ובקרת האיכות של פירות עץ כגון תפוחים. עצי תפוח מוכרים ברחבי העולם כמין כלכלי חשוב, ותפוחים נחשבים למזון בריא23. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא מעיסת פירות תפוחים דרך הידרוליזה אנזימטית ולאחר מכן העמסנו ריאגנטים פלואורסצנטיים של מולקולות קטנות לתוך הציטופלסמה כדי לזהות Ca2 +.

<table><tbody><tr><td>10&times; מי מלח עם חוצץ פוספט</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS (תמיסת חוצץ פוספט) היא תמיסת חיץ פוספט, שיכולה לספק סביבה יונית יציבה יחסית ויכולת חציצה של pH. זוהי תמיסת מלח חיץ המשמשת לעתים קרובות בביולוגיה לשיבוט מולקולרי ותרבית תאים. ה-pH הוא 7.4.&nbsp;</td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)חומצה אתנסולפונית</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>בופר ביולוגי</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>סידן כלוריד דיהידרט הוא כימיקל לבן או אפור, לרוב בצורה גרגירית.</td></tr><tr><td>צלולאז R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7352</td><td>משפיל את דפנות תאי הצמח.</td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>Solarbio</td><td>S8090</td><td>יש לו תכונות לחות טובות, מונע התייבשות ומונע התגבשות סוכר, מלח וכו'.</td></tr><tr><td>F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6867</td><td>Pluronic F-127 הוא פוליאול פעילי שטח לא יוני (משקל מולקולרי של כ-12500 דלטונים), שנמצא כמועיל לקידום המסה של צבעים בלתי מסיסים במים וחומרים אחרים במדיה פיזיולוגית.</td></tr><tr><td>FDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td>FDA הוא מצע אסטראז מתאים לתא שיכול לשמש כבדיקת כדאיות המודדת הן את הפעילות האנזימטית, הנדרשת להפעלת הקרינה שלו, והן את שלמות קרום התא, הנדרשת לשמירה תוך-תאית של המוצר הפלואורסצנטי שלהם.</td></tr><tr><td>Fluo-4 / AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>מחוון הסידן הפלואורסצנטי הירוק Fluo-4 / AM הוא גרסה משופרת של מחוון הסידן Fluo-3 / AM. ה-Fluo-4/AM נטען מהר יותר ובהיר יותר באותו ריכוז. זה יכול להיות מרגש היטב עם לייזר יונים ארגון 488 ננומטר.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>התבונן בתמונת הקרינה.</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Honsha</td><td>MX7351</td><td>מפרק רקמת צמח כדי להפריד תאים בודדים.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td>הוא נמצא בשימוש נרחב בהכנת מאגרים בניסויים בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית.</td></tr></tbody></table>

מכתים את הציטופלסמי ca2+ עם פלואו-4/am בעיסת תפוחים

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

Cytosolic Ca2 + ממלא תפקיד מפתח בפיתוח הצמח. הדמיית סידן היא השיטה המגוונת ביותר לזיהוי שינויים דינמיים ב- Ca2+ בציטופלסמה. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא של תאי עיסת על ידי הידרוליזה אנזימטית. פרוטופלסטים מבודדים דוגרו עם ריאגנט פלואורסצנטי מולקולה קטנה (פלואו-4/AM) במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). הבדיקות הפלואורסצנטיות הכתימו בהצלחה את Ca2+ הציטוזולי, אך לא הצטברו בווליות. La3+, חוסם ערוץ Ca2+ , ירד עוצמת פלואורסצנטיות ציטופלסמית. תוצאות אלה מציעות כי Fluo-4/AM ניתן להשתמש כדי לזהות שינויים Ca ציטוטוסולי2 + בבשר הפרי. לסיכום, אנו מציגים שיטה לבודד ביעילות פרוטופלסטים מתאי בשר של הפרי ולזהות Ca2+ על ידי טעינת ריאגנט סידן פלואורסצנטי במולקולה קטנה בציטופלסמה של תאי עיסת.

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו בשיטה אנזימטית כדי להשיג פרוטופלסטים ברי קיימא מהעיסה (איור 1). לחלק מהנורות היו חלילות, בעוד שאחרים לא. בעוד הפרוטופלסטים לא הראו פלואורסצנטיות כאשר מחוון הפלואורסצנטי Ca2 + לא נטען לתוכם. כאשר פלואו-4/AM הועמס לתוך הפרוטופלסטים, הציטופלסמה, אך לא החלול, הפכה לפליאואורסצנטית(איור 2). תוצאה זו הצביעה על כך Fluo-4/AM בהצלחה מוכתם Ca2 + בציטופלסמה וכי לא נצפתה מידור24. פרוטופלסטים ...

פרוטופלסטים מבודדים של תאי עיסת תפוחים היו טעונים עם ריאגנט פלואורסצנטי סידן כדי לזהות ריכוז ציטופלסמי Ca2 + .

מכתים את הציטופלסמי Ca2+ עם פלואו-4/AM בעיסת תפוחים

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

כאלמנט מינרלי חשוב, סידן ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה ובקרת האיכות של פירות עץ כגון תפוח, הוא יכול לווסת את הקשיות, תכולת הסוכר, תקופת האחסון וההפרעה הפיזיולוגית במהלך האחסון. הדמיית סידן היא השיטה המערבית ביותר לזיהוי שינויים דינמיים ביוני הסידן בציטופלסמה. אינדיקטורים פלואורסצנטיים מולקולה קטנה, כגון פלואו-4/AM יש סלקטיביות ספציפית סידן יון והוא יכול להיות טעון באופן לא פולשני על ידי דגירה אסטריפיקציה, שהיא גמישה, מהירה, ולא ציטוטוקסית.פרוטוקול זה יציג שיטה לטעינת פלואו פלואורסצנטי פלואורסצנטי כימי מולקולה קטנה לתוך פרוטופלסטים צמחיים. מיצוי פרוטופלסט להוסיף 0.5 מיליליטר של פתרון אנזימים לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. בחר תפוח בריא ובשלים, ולאחר מכן לפרוס את עיסת לתוך 10 פעמים 5 כפול 1 מיליליטר מעוקב גודל.מניחים את חתיכות עיסת לתוך פתרון אנזימטי, ולאחר מכן לסגור את הצינור. צינור דגירה ב-28 מעלות לשעה אחת. כבול ב-70 סל"ד בחושך.לאחר מכן, לשטוף את חתיכות עיסת, לשאוף את כל הפתרון אנזימטי ולאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר פתרון בסיסי. צנטריפוגה במהירות של 300 גרם במשך 2 דקות. השעיית פרוטופלסטס ניתן להשיג על ידי שאיפה הפתרון התחתון.כתמי פלואורסצנטיות כימית של מולקולה קטנה. הכן את פתרון הטעינה פלו-4/AM עם פלואו-4/AM 2 מילימולרים, 20%אתיל127, ואת תמיסת מלח 10X פוספט חוצץ ביחס אחד עד שניים. הוסף פתרון טעינת מיקרוליטר אחד של מתלה פרוטופלסט פלואו-4/AM ל-99 מיקרו-ליטר.הריכוז הסופי של צבעי פלואורסצנטי הוא 5 מיקרומולר. מערבבים את הפתרון ואז סוגרים את הצינור. במקביל, לנתנום מגהץ את הסידן או הייחודיות של חומר הפלואורסצנטי הכימי המולקולרי הקטן.הוסף מיקרוליטר אחד או 10 מיקרוליטר ברזל לנתנום יותר ולאחר מכן פתרון טעינה מיקרוליטר אחד של פלואו-4/AM ל 98 השעיית פרוטופלסטות מיקרוליטר. הריכוז הסופי של ברזל לנתנום הוא 100 מיקרומולר. מערבבים את הפתרון ואז סוגרים את הצינור.דגירה ב-37 מעלות במשך 30 דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגה במהירות של 300 G במשך שתי דקות. שאפו לפתרון 17 מיקרוליטרים והוסיפו פתרון בסיסי של 17 מיקרוליטרים.לדגור על ההשעיה protoplast ב 37 מעלות במשך 30 דקות כדי לחלוטין לאחר מכן, לשאוף 50 השעיית פרוטופלסט מיקרוליטר לטפטף על שקופית. שימו לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. בחר את ה- 20x את ההגדלה ואת ערוץ GFP לצפייה.כוונן באופן אחיד את הבהירות ל- 0.5. צעד קריטי בשיטה המוצעת היא לשטוף את הכתם בפרוטופלסטים ולדגירה אותם במשך 30 דקות. כביסה לא מספקת גורמת לגיבוי מוגזם על הפלואורסצנטיות במהלך התצפית והדגירה מאפשרת טעינה טובה יותר או בדיקה לתוך הציטופלסמה.Protoplasts קיימא Assay קח 99 מיקרוליטר protoplasts השעיה לאחר דגירה ב 37 מעלות במשך 30 דקות. יש להוסיף 1 מ"ל בפתרון ה-FD להשעיית פרוטופלסטס. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים ולאחר מכן לסגור את הצינור.הישאר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות בחושך. הכן את השקופיות והתבונן בהן במיקרוסקופ הפלואורסצנטי עם ערוץ GFP. אנו מציגים בפניכם תוצאות בהתאם לאיור הראשון.אנו משתמשים בשיטה אנזימטית כל קבלת פרוטופלסטים מן העיסה. לחלק מהנורות היה חלול בעוד שאחרים לא. הפרוטופלסטים היו מוכתמים ב- FD במשך חמש דקות ומראים את פלורסנט בציטופלסמה המציינת כי טמפרטורה גבוהה, 37 מעלות אינה משפיעה על הכדאיות או הפרוטופלסטים איור 2.הפרוטופלסטים לא הראו שום פלואורסצנטיות באחד ממחווני הפלואורסצנטיות של ברזלי הסידן או שהוא לא טעון לתוכם. מאשר בפלואו-4/AM הועמס לתוך הפרוטופלסט, הציטופלסט, אבל לא חלול הפך לפלורסנט. מגהצי לנתנום אשר חוסמים ביעילות תעלות סידן הם קרום התא נוספו לטעינת פלואו-4/AM Protoplast.בריכוז הסופי של 100 מגהצי לנתנום מיקרומולרים מפחיתים באופן משמעותי את עוצמת הפלואורסצנטיות של הסידן. התוצאה הזו הראתה עוד כי פלואו-4/AM נשארים ביעילות בברזלי הסידן בציטופלסט והוא מראה שינויים דינמיים בתכולת ברזלי הסידן. איור 3 תוצאות פלואו-4/AM נותחו באמצעות IMH שאושר בתוספת 6.0 תוכנה fluo-4/AM מכתים עם תוספת של מגהצי לנתנום הפחית באופן משמעותי את ערך פלורסנס של מגהצי סידן ציטופלסמיים.בסרטון זה, היו כל הפרוטופלסטים הושגו על ידי הידרוליזה אנזימטית. העמסנו בהצלחה את הבדיקות הפלואורסצנטיות לפרוטופלסטים ב-37 מעלות. יתר על כן, השיטה לא השפיעה על הכדאיות של protoplasts.לסיכום, השיטה המתוארת כאן בפירוט רב. השינויים הדינמיים ביוני סידן ציטופלסמיים בתאי עיסת התפוחים ובכך מספקים 10 תומכים שווים למטרה נוספת של מחקרים הקשורים לסידן.

staining-the-cytoplasmic-ca2-with-fluo-4am-in-apple-pulp

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

פעילות ספונטנית של פיתוח רשתות נוירונים ניתן למדוד באמצעות AM-אסתר צורות של סידן רגיש צבעים אינדיקטור. שינויים סידן תוך תאי, המציין ההפעלה העצבית, מזוהים כמו שינויים חולפות הקרינה אינדיקטור עם אחד או שני פוטונים הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור מגוון של רשתות נוירונים התפתחותית...

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

בסרטון זה, אנו מתארים הליך צביעה כדי לדמיין שקיעת תאית בתוך דפנות התא של Arabidopsis thaliana, צמח דיקוט, באמצעות calcofluor לבן, אשר נקשר במיוחד גלוקנים הקשורים β, מציג פלואורסצנטיות תחת אור UV.

צביעה לבנה Calcofluor: שיטה פשוטה להדמיית פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי UV של משקעי תאית בדפנות התא של קטעי גזע צמח דיקוט

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

הרכב דופן התא של הצמח משתנה בין סוגי הרקמות ויכול לכלול ליגנין, תאית, המיצלולוז ופקטין. טכניקות צביעה שונות פותחו כדי להמחיש הבדלים ברמת סוג התא. מאמר זה הוא אוסף של טכניקות צביעת דופן תאים נפוצות.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

נכון לעכשיו, רוב מדדי הסידן הזמינים משמשים לכימות מעברי סידן ציטופלזמיים כמדדים עקיפים של סידן המשתחרר מהרטיקולום הסרקופלזמי בתאי שריר חלק מתורבתים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באינדיקטור ספציפי מבוסס FRET המאפשר מדידה ישירה של אותות סידן בתוך לומן הרטיקולום הסרקופלזמי.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

כאן, מתוארת שיטה להפיכת רקמות הצמח לשקופות תוך שמירה על יציבות חלבונים פלואורסצנטיים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה עמוקה של רקמות צמחים מנוקות ללא חתך פיזי.

ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

למדו לבודד פרוטופלסטים חיים מעיסת תפוחים ולצבוע Ca²⁺ ציטופלסמי באמצעות Fluo-4/AM. שיטה זו מאפשרת הדמיית סידן מהירה ולא פולשנית בתאי צמחים לחקר פיתוח פירות.

מכתים את הציטופלסמי Ca²⁺ עם פלואו-4/AM בעיסת תפוחים

גלה סרטונים נוספים