לכידת תרכובות אורגניות נדיפות מיקרוביאליות המיוצרות באופן פעיל מדגימות הקשורות לבני אדם עם מיצוי סורבנט בסיוע ואקום

פרוטוקול זה מאפשר לנו להתרכז ולזהות בקלות מטבוליטים נדיפים ונדיפים המיוצרים באופן פעיל מאורגניזמים מיקרוביאליים במגוון דגימות ביולוגיות. VASE היא שיטה ידידותית יותר למשתמש לריכוז נדיפים בעלי שפע נמוך. כל מה שאתם צריכים זה דגימה תחת כמעט ואקום, ולתת לפיזיקה לעשות את השאר.

לגישה לניתוח נדיף של דגימות קליניות יש השלכות חשובות על גילוי סמנים ביולוגיים מטבוליים במספר מצבי מחלה שונים. לדוגמה, ניתן לזהות את הפתוגן המניע והזיהום או את הצלחת הטיפול האנטיבקטריאלי באמצעות ניתוח נדיף של דגימות רוק, כיח או נשימה. כדי להכין דגימות צואה, הוסיפו מיליליטר אחד של מים שעברו דה-יוניזציה ל-100 מיליגרם של צואה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ובמערבולת למשך שלוש דקות.

שמור את הדגימות על קרח כאשר אינן בשימוש. הוסף 485 מיליליטרים של מדיום BHI עם גלוקוז 20 מילימולרי 13C או BHI עם 30% דאוטריום עד 15 מיקרוליטרים של תערובת צואה ומים, כדי להבטיח כי הנפח הסופי של הדגימה הוא 500 microliters. הכן דוגמאות במשולש טכני.

כדי להכין דגימות ביוב, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של ביוב ל-500 מיקרוליטרים של מדיום BHI עם גלוקוז של 13C או 30% דאוטריום בנפח כולל של מיליליטר אחד. הכינו דגימות בטריפליקטים והשאירו אותן על קרח. כדי להכין דגימות רוק, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של רוק ל-500 מיקרוליטרים של מדיום BHI עם גלוקוז 13C או 30% דאוטריום בנפח כולל של 550 מיקרוליטרים.

הכינו דגימות בטריפליקטים והשאירו אותן על קרח. כדי להכין דגימות כיח, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של כיח לבקבוקון. הכינו דגימות במשולש והשאירו אותן על קרח.

הניחו בקבוקוני VOA ריקים על הצלחת הקרה והניחו את הצלחת הקרה על הקרח במכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית. הפעילו את ה-5600 SPEU והתאימו אותו לטמפרטורה הנדרשת. סמן בקבוקוני VOA של 20 מיליליטר על פי דגימות, שכפולים ומזהי HSP באמצעות סמן עמיד במים המתנגד למים במקרה שנוצר עיבוי בחלק החיצוני של הבקבוקון בזמן שהוא על קרח.

בתוך מכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית, פתחו את הכובע הלבן על הבקבוקון, פיפטו במהירות דגימה לתוך הבקבוקון, והרכיבו את תוחם המכסה, הכובע השחור וה-HSP. הניחו את הבקבוקון המכיל את הדגימה ואת HSP בחזרה על הצלחת הקרה. לאחר שכל הדגימות הוכנו בבקבוקוני הזכוכית, הפעילו את משאבת הוואקום, הניחו את הבקבוקונים תחת ואקום והסירו את מקור הוואקום.

בדוק שוב את הלחץ לאחר הצבת כל הדגימות תחת ואקום באמצעות מד הלחץ. אם בקבוקון דולף, יש לוודא שהפקק מוברג בחוזקה ושטבעות ה-O הלבנות של תוחמי ה-HSP והמכסה נמצאים במקומם כראוי. מקם בקבוקונים ב- SPEU לזמן ולטמפרטורה הממוטבים עם תסיסה ב- 200 סל"ד.

לחלץ תרביות למשך שעה אחת ב-70 מעלות צלזיוס ולהוציא ניסויי איזוטיפ יציבים בבדיקת צואה, ביוב, רוק וכיח במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מניחים את הצלחת הקרה על מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר השלמת תקופת החילוץ. כאשר המיצוי הושלם, הניחו דגימות על הצלחת הקרה למשך 15 דקות כדי לשאוב אדי מים מה-HSP וממרחב הראש של הבקבוקון, ואז העבירו את ה-HSPs לשרוולים שלהם.

הגדר את רצף הדוגמאות בתוכנת Entech. פתח את התוכנית ובחר 5800 ו- רצף באפשרויות שמימין לתפריט הנפתח Instrument. שמור את טבלת הרצף, בחר הפעל בצד שמאל ולאחר מכן התחל עם ריק ב- Desorber אם ה- HSP הריק אינו desorber.

שים לב ש- HSPs יטופלו על ידי ה- SPR עבור כל דגימה ברצף. תנו ל-SPR להתחמם. אפשר ל- SPR להפעיל את כל הדוגמאות באופן אוטומטי.

הרצף בצד GC-MS יתעד באופן אוטומטי את הנתונים בקבצים נפרדים. הוסף שיא לשיטת העיבוד על-ידי בחירה באפשרות כיול ואחריו ערוך תרכובת, שם והוספה של תרכובת תחת תרכובת סטנדרטית חיצונית. הוסף את שם התרכובות, זמן השמירה ויון היעד של האות קוונטי.

הוסף את שלוש הפסגות הגדולות ביותר, הכוללות תרכובות עם הסתברות של יותר מ-75%, כדי להבטיח שהיישור של כל יון מזהה של התרכובת נמצא במרכז השיא. שמור אותו על-ידי בחירה בסדר, ואחריו שיטה ושמירה. לאחר הגדרת שיטת התהליך, המשך אל Quantitate ו- Computate ולאחר מכן הצג ו- QEDIT Quant Result כדי להגדיל את כמות הנתונים.

כאן, מיצוי סורבנט בסיוע ואקום לווה בספיגה תרמית ב-GC-MS כדי לסקור את הפרופילים הנדיפים של תרביות חד-תאיות חיידקיות ו-co-תרביות, ולזהות נדיפים המיוצרים באופן פעיל עם בדיקה איזוטופית יציבה מצואה אנושית, רוק, ביוב ודגימות כיח. התרביות המונו-ותרביות המשותף כללו את מיני החיידקים staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa ו-acinetobacter baumannii. 43 מולקולות נדיפות מבוארות זוהו מהתרביות המונו-ותרביות המשותפות בנקודות זמן של 24 ו-48 שעות.

היה יותר שילוב של 13C במולקולות נדיפות עם תווית מלאה בהשוואה לדאוטריום. 13C שולב ב-2-בוטאנון, 3-הידרוקסי, 2, 3-בוטנדיון דיאצטיל, חומצה אצטית ופנול עבור כל דגימות הצואה, הביוב והרוק. אצטון, חומצה בוטנואית וחומצה פרופנואית זוהו כמסומנים ברוק ובביוב.

ואילו דימתיל טריסולפיד ודיסולפיד די-מתיל הועשרו הן בדגימות צואה והן בדגימות רוק. הנדיפים 1-פרופנול, 2-בוטנון, בנזופנון, אתנול ומתילתיול אצטט הועשרו רק בביוב ו-2, 3-פנטנדיון ברוק. דאוטריום שולב בחומצה אצטית נדיפה, בנזאלדהיד, 4-מתיל-דימתיל טריסולפיד ופנול מדגימות רוק או ביוב.

חומצה אצטית, דימתיל טריסולפיד, אצטון ופרופנול 2-מתיל היו נפוצים יותר בדגימות כיח מתורבתות מאשר דגימות כיח לא תרבותיות. ניתוח רב-משתני של וריאנטים, PERMANOVA, בוצע על מטריצת מרחק של בריי-קרטיס של השפע הנדיף מדגימות כיח סיסטיק פיברוזיס. מצאנו שהנבדק שתרם את המדגם מסביר 51% מהשונות בכיח מתורבת עם תווית של 13C ו-33% מהשונות בכיח לא תרבותי.

כאן מוצגת ההצלחה של תיוג איזוטופים יציב עם גלוקוז 13C בתנודתיות מדגימות כיח בתרבית שנאספו משבעה אנשים עם סיסטיק פיברוזיס. נדיפים בעלי התאגדות גבוהה יותר של 13C עבור רוב הדגימות מוצגים בלוח 5A, אלה עם התאגדות של 13C באחוזים נמוכים יותר ברוב דגימות הכיח נמצאות בפאנל 5B, ומולקולות עם המרה נמוכה יותר של 13C אחוזים במיעוט מדגימות כיח מוצגות בלוח 5C. בדקו תמיד שוב את לחצי הבקבוקון לאחר כדקה.

ואקום שבור מביס את הרגישות והמהירות של שיטת VASE. בעקבות הליך זה, אם בוצעה בדיקת איזוטופים יציבה, ניתן לחלץ את הדנ"א מהחומר הנותר כדי לזהות אורגניזמים או מינים מיקרוביאליים שייתכן שתרמו לייצור המולקולות הנדיפות. שיטה זו שימושית גם באיתור נדיפים מכל סוג דגימה ללא בדיקת איזוטופים.

עם יתרונות של רגישות ונפח דגימה נמוך, יישומים רבים יכולים להפיק תועלת מטכניקה זו.