ניסויי מעבדה בכלוב קטן של יתושי אנופלין מהונדסים גנטית

הפרוטוקול המתואר כאן מתאים להעריך את ביצועי יתושים מהונדסים והשוואות עם עמיתים סוג בר בניסויים כלוב מעבדה קטנה. ניסויי הכלוב הקטן חשובים כדי לספק ערכים אמפיריים שיסייעו למלא יישום של טכנולוגיות חדשות לחיסול מלריה. ניסויי הכלוב יכולים להיות מותאמים לעיצובים ניסיוניים אחרים והם מתאימים להערכת הדינמיקה של איום של גן טרנס-גן תשוקה.

בעקבות ההקדמה אנשים מהונדסים. התחל את השלב הראשוני של הניסוי על ידי הקמת שלושה כלובים 0.216 מטר מעוקב במשולשים. והוספת 60 זחלי בר שניים לכל כלוב במשך שלושה שבועות רצופים.

בכל שבוע, ספק לנקבות בוגרות בכל כלוב עכברים מרדים כמקור לארוחות דם. ומיכל אופוזיציה שלושה ימים לאחר ארוחת הדם. ביצי צוהר מכל כלוב מדי שבוע.

משבוע רביעי עד שמונה, בחר 60 זחלי L2 השני באקראי כדי לחזור לכלובים שלהם בהתאמה. בשבוע התשיעי, הקצה באופן אקראי קבוצה אחת של כלובים משולשים כפקדים וקצת אחד עבור כל יחס שחרור רצוי. הוסף 60 גלמים מסוג בר עם 30 זכרים ו -30 נקבות לכלובי הבקרה בכל שבוע.

לשמור על יחס אחד לאחד בכל כלוב בהתאמה על ידי הוספת 30 גלמים זכר מהונדסים יחד עם 60 גלמים סוג בר. עבור יחס של 0.1-0.1, הוסיפו 300 גלמים זכרים מהונדסים מדי שבוע לכל כלוב בהתאמה יחד עם 60 גלמים מסוג בר. חוזרים על הוספת גלמים נגד יתושים בכלוב, ומספקים ארוחת דם וביצים בוקעות מדי שבוע.

בחר בסך הכל 300 זחלים מכל כלוב באקראי להקרנה. מסך הזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מסנני פלואורסצנטיות לביטוי של הסמן הדומיננטי הפלואורסצנטי בשלבי זחל וגפול. ציון המין של הגולם המתקבל.

בניסוי הנעת הגנים, השתמש באסטרטגיית מחסום על ידי שמירה על יתושים בחרק מאובטח ופעולה סטנדרטית עם ניטור קבוע. הכן כלוב שהוקם עם שני סטים של כלובי מטר מעוקב משולשים עבור כל יחס שחרור גברי מהונדס עד פראי. כדי להשיג יחס שחרור זכרי של אחד לאחד, הוסף 120 זכרים מהונדסים, 120 זכרים ונקבות מסוג בר בשלב הגולם לכל כלוב לשכפל.

ספק ארוחת דם באמצעות עכברים מרדים לארבעה עד שבעה ימים נקבות בכל כלוב. לאחר שבקיעו ביצים במגש זחלים, בחרו כ-240 זחלי L1 ראשונים באקראי מכל כלוב וגידרו אותם לגולם לפני החזרה לכלובים שלהם. בחר ומסך זחלים עבור סמן העין פנוטיפ סקס כמתואר קודם.

להרכיב כלוב התקנה של כלובים משולשים 0.005 מטר מעוקב עם מספר שווה של זכרים ונקבות עבור כל יחס שחרור ספציפי של טרנסגניות לזכרים מסוג בר. באמצעות מנגנון האכלה מלאכותי, לספק ארוחות דם לנקבות בנות ארבע עד שבעה ימים בכל כלוב ביומיים רצופים. שלושה ימים לאחר ארוחת הדם השנייה, מוסיפים מיכל oviposition ולהסיר את המיכלים לאחר שלושה ימים.

לאחר שהבקיעו את כל המתים ואת המבוגרים החיים שנותרו בכלוב על ידי סקס, לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח מולקולרי. צוהר ביצים ולהפעיל בחר 200 זחלי L1 ולהניח את הזחלים בצד כדי לאכלס כלובים חדשים עבור הדור הבא. לאחר מכן בחר באקראי עוד 500 זחלים מכל כלוב שהוקצה להקרנה.

החזירו את 200 הזחלים הנבחרים לגולם ו-500 זחלים לשלב ה-L4 instar. החזר גולם מ 200 מגשים כדי לאכלס כלוב חדש. מסך שנבחר באקראי זחלים עבור סמן העין פנוטיפ סקס כמו קודם.

בניתוח הייצוגי, הדינמיקה הפנוטיפ הצפויה של המשכפלים בעלי הביצועים הטובים ביותר מוצגים עבור פרוטוקולי ניסויי כלוב החלפת אוכלוסין שונים. התוצאות הראו את שיעור גדל ליניארי של זחלים עם פנוטיפ סמן DsRed במשך שבעה דורות. שחרור אחד לאחד שאינו כונן הגיע קצת יותר מ 80% מבוא transgene בתוך שבעה דורות.

פרוטוקולי כונן הגנים השיגו זאת בתוך שלושה עד ארבעה דורות. לכן אימות כי שחרור יחיד של מערכת כונן גנים יכול להיות יעיל יותר עבור מבוא transgene. בסוף התצפית, התפשטות הטרנסג'ן הגיעה להקדמה כמעט מוחלטת במערכות הנעת גנים.

פרמטרים חשובים, כגון מבנה גיל האוכלוסייה יחס שחרור, גודל הכלוב, ואחרים ישתנו בהתאם למטרת הניסוי ומטרות ספציפיות. ניסויים להערכת פרמטרי כושר כגון פוריות ופוריות ניתן לעשות. נתונים אמפיריים נוספים מניסויי הכלוב יכולים לשמש כדי לפרמטרים של מודלים מתמטיים של דינמיקת אוכלוסין.