Name: שיטת מיקרו-גק-קציה לעוברי אנופלס גמביה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: למד שיטת מיקרו-הזרקה לעוברי Anopheles gambiae ליצירת יתושים טרנסגניים. פרוטוקול זה מאפשר הנדסה גנטית אמינה לבקרת מלריה ודיכוי אוכלוסיות יתושים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לדרוסילה סטילינג'ר, קיונה פרקר, פאריש פאוול ומדלין נוטולי על גידול יתושים. המימון ניתן על ידי אוניברסיטת קליפורניה, יוזמת מלריה אירוויין. AAJ הוא פרופסור דונלד ברן באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.

1. הכנת יתושים למיקרו-ינון
<ol><li>זרע כלוב13 (~ 5000 ס"מ3) עם ~ 100 זכר ו 200-300 נקבה 1-2 יום מבוגר יתושים לאחר אקסלציה ולאפשר להם להזדווג במשך 2 ימים.</li>
	<li>לאחר תקופת ההזדווגות, לספק יתושים ארוחת דם באמצעות 2 מ"ל של דם עם מכשיר האכלה מלאכותי או בעלי חיים חיים מרדים בהתאם לשיטות חרקים14. למחרת לספק יתושים ארוחת דם שנייה כדי להבטיח כי כל הנקבות המזדויפות היו הזדמנות להאכיל וכי יתושים האכלה חלקית הפכו שקועים לחלוטין.</li>
	<li>השתמש יתושים עבור אוספי עוברים 2-4 ימים לאחר ארוחת הדם השנייה. הערה: תזונה זחלית חשובה לחוסן למבוגרים וכושר הרבייה. ראה בנדיקט ואח ' (2020) לקבלת מידע על איך לגדל חרקים בריאים14. לא נצפו הבדלים משמעותיים בהטלת ביצים כאשר יתושים ניזונים ממאכיל מלאכותי או מאכילים חיים של חיות מרדים. השתמש בשיטה שבה נעשה שימוש שגרתי עבור אנופלס גמביה בחרקים.</li>
</ol>2. הכנת עוברים
<ol><li>השתמש בשאיפה למקם 20-30 נקבות בצינור חרוט שקוף 50 מ"ל שנחתך (עם מסור להקה) כדי להיות פתוח בשני קצות ומכוסה בסרט שיניים לטקס בקצה אחד ורשת ניילון ונייר סינון בקצה השני(איור 1). הערה: היתושים יפקידו את ביציהם על נייר המסנן ורשת הניילון תשמור על נייר המסנן במקומו. ביצי יתושים הן גליליות בצורתן, באורך של כ-500 מיקרומטר, בקוטר של כ-200 מיקרומטר בנקודה הרחבה ביותר שלהן, ומתחדדות בקצוות הקדמיים והאחוריים(איור 2).</li>
	<li>מניחים את הצינור מלא יתושים בצלחת פטרי קטנה (60 מ"מ x 15 מ"מ) מלאה במים מזוקקים כפולים (ddH2O). מניחים את הצינור ואת המנה באינקובטור ב 28 °C (איור3).</li>
	<li>הסר את הצינור מן האינקובטור ולהכניס את הצינור לתוך כלוב ריק. הקש בעדינות על הצינור כדי לאפשר ליתושים לעוף החוצה ולהסיר את הצינור מהכלוב ברגע שכל היתושים עפו החוצה.</li>
	<li>כאשר הצינור הוא ללא יתושים, לפתוח את הטבעת התחתונה, להסיר את הניילון, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את נייר המסנן עם הביצים מן הצינור. מניחים את נייר הסינון בצלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ x 15 מ"מ) המכילה שכבה של נייר סינון לח עם ddH2O.</li>
	<li>שים לב לביצים. ביצים שהזדקנו עד לנקודה שבה הן בצבע אפור בהיר(איור 4)מוכנות ליישור.<ol>
<li>אם הביצים עדיין לבנות, החזירו אותן לאינקובטור ובדקו את הצבע כל 5 דקות. ביצים לבנות שבירות, נקרעות בקלות, ואינן שורדות היטב לאחר תהליך ההזרקה וכתוצאה מכך בקיעה נמוכה.</li>
		<li>ביצים אפורות או שחורות כהות הזדקנו יותר מדי. אל תשתמש בהם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. יישור עובר
<ol><li>חותכים חתיכת קרום ניילון (2 ס"מ על 1 ס"מ) עם סכין גילוח, מוודאים שהקצה נחתך בצורה מסודרת. הערה: אם הקצה אינו ישר, הביצים לא יישארו מודבקות על הממברנה כראוי במהלך תהליך ההזרקה.</li>
	<li>שים קרום על שקופית זכוכית לכסות את הממברנה עם פיסת נייר מסנן (2 ס"מ x 2 ס"מ), משאיר ~ 1 מ"מ של מסנן הממברנה חשוף (איור 5). הערה: ודאו כי שקופיות מיקרוסקופ נקיות לפני השימוש והשתמשו במלקחיים נקיים כדי לתפעל את מסנן הממברנה.</li>
	<li>הרטיבו את נייר המסנן עם H2O דה-או דה-יונים, שכן הביצים ימותו אם יתייבשו לפרקי זמן ממושכים. הערה: אל תשימו יותר מדי מים על הנייר מכיוון שהעוברים יזוזו במהלך תהליך ההזרקה, אך ודאו שיש מספיק כדי למנוע מהעובר להתייבש (איור 6A, B). מים עודפים ניתן להסיר על ידי ספיגת אותו עם פיסת נייר מסנן.
</li>
	<li>מעבירים בעדינות 30-50 עוברים לקצה הממברנה בעזרת מברשת צבע (מידה מס' 0). השתמש במברשת כדי ליישר את הביצים אנכית לאורך הממברנה על ידי גלגול עדין עליהם על השקופית, כך שהצד הגחוני (קמור) פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>כוון את כל הביצים באותו כיוון כך שכאשר הביצים נצפות תחת מיקרוסקופ microinjection, הקצה האחורי (מחודד יותר, איור 6A, B) נמצא במצב למטה ויוצר זווית של ~ 15° עם המחט ( איור6C). מרפדים את כל הקצה של הממברנה בביצים (30-50) ומניחים את השקופית מתחת למיקרוסקופ להזרקה. הערה: בחר את הביצים בקפידה. השליכו את הלבנים (צעירים מדי או לא מפותחים) או אפור כהה (זקנים מדי וישברו את המחט), ואת האבנורמלים(איור 7). ודא שנייר הסינון נשאר לח בכל עת.
</li>
</ol>4. הכנת DNA
<ol><li>טהרו DNAs פלסמיד להזרקה, לכל הפחות, עם ערכת MAXIprep DNA נטולת אנדוטוקסין בעקבות פרוטוקולי היצרן.</li>
	<li>resuspend ה- DNA במים באיכות PCR וצנטריפוגה ב 17,100 x גרם בצנטריפוגה בקירור במשך 30 דקות ב 4 °C (7 °F). לאחר מכן, להעביר את supernatant חדש, נקי 1.5 mL צינור חרוט. בזהירות מיקרו-pipette כדי למנוע העברת חומר חלקיקי לא רצוי מהעמודה.</li>
	<li>בצע משקעים שניים של DNA באמצעות נפח עשירית של 3M נתרן אצטט ונפח כפול של 100% אתנול.</li>
	<li>Resuspend ה- DNA ב 300-500 μL של מים כיתה PCR לריכוז פלסמיד סופי של 1000 ng / μL. לערבב את קוקטייל plasmid במאגר ההזרקה לריכוז פלסמיד סופי של 300-400 ng / μL ולעשות 10-20 עליקות μL. הערה: DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 °C. aliquots מיקרו-ערך DNA ניתן לאחסן ב -20 °C (50 °F), או ב -80 °C (80 °F) אם משתמשים ברכיבי RNA. אין לחרוג מ- 800 ננוגרם/ μL של DNA בתערובת ההזרקה מכיוון שצמיגות תגרום למחטים לסתום.</li>
</ol>5. הכנת מחט
<ol><li>הפוך את המחטים על ידי משיכת נימי קוורץ 10 ס"מ באמצעות משיכת מיקרופיט לתכנות.</li>
	<li>בדוק את המחט מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי הקצה נוצר היטב. ודאו שהגדרת המחט במשיכה הניתנת לתכנות מניבה קצה שמתחיל להתחדד ~ 0.5 מ"מ מקצה המסוף ומסתיים בנקודה עדינה (ראו איור 6). מחטים שנשברות בקלות בדרך כלל יש יותר מדי זמן של מתחדד. הערה: התנאים עשויים להשתנות בהתאם למשיכת המחט (המחברים יהיו זמינים על פי בקשה את ההגדרות עבור מושך לתכנות הם משתמשים. הגבלות יומן מונעות מאיתנו לצטט מותג מסוים). מחטים ניתן למשוך ביד, אבל זה דורש מיומנות להגדיר לא זמין ברוב המעבדות.</li>
</ol>6. מיקרו-נסיגה עוברית
<ol><li>השתמש קצה מיקרו-מטעין כדי למלא את המחטים עם 2 μL של תערובת DNA. הכנס את המחט למחזיק המחט וחבר את צינורות משאבת הלחץ האוטומטיים(איור 8).</li>
	<li>חשוב: יישר את המחט כך שהיא תגיע לזווית של 15° עם מישור השקופית (איור 8).</li>
	<li>פתח את קצה המחט על ידי נגיעה בזהירות בביצה הראשונה והזריק אותה על ידי החדרת קצה המחט ≤ 10 מיקרומטר בקוטב האחורי. זריקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלסמה בתוך הביצה.</li>
	<li>השתמש בפקדי השלב הקואקסיאלי של המיקרוסקופ כדי לעבור לביצה הבאה כדי להמשיך בהזרקה.<ol>
<li>כדי להבטיח כי קצה המחט נשאר פתוח ולא סתום, לחץ על כפתור הזרק לפני הכניסה לעובר אחר לדמיין את טיפה קטנה בפתח המחט.</li>
		<li>אם המחט נסתמת, לחץ על כפתור נקה כדי לנקות את המחט ולחזור על בדיקת ההדמיה טיפה. התאם את הלחץ לפי הצורך אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן.</li>
		<li>להזריק ~ 40-50 ביצים עם מחט אחת. הערה: ודאו שנייר הסינון נשאר לח בכל עת. שמור מספיק לחץ גב על המחט כדי לשמור אותו פינה. מחט שלא ניתן לפתוח חייבת להיות מוחלפת במחט חדשה. מיקום העובר, החדרת המחט והזרקה נעשים קלים יותר עם מיקרוסקופים בעלי פקדים קואקסיאליים לתנועה אופקית של השלב (איור 9).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר השלמת הזריקות, יש לשטוף את הביצים במיכל זכוכית מרופד בנייר פילטר ומלא ב-50 מ"ל של H2O(איור 10). הערה: עוברים יתחילו לבקוע יומיים לאחר ההזרקה ועשויים להימשך עד 3-5 ימים. יש להעביר זחלי instar הראשונים בקעה מיד (בדוק 2 פעמים ביום) למיכל נקי עם מים ומזון.</li>
</ol>

<ol><li>Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeramisco%2C+J+%22Microinjection.+Methods+and+Tools+in+Biosciences+and+Medicine%22">Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine</a>. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Meredith, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+expression+of+an+anti-malarial+gene+in+transgenic+Anopheles+gambiae+significantly+reduces+Plasmodium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections.</a> PLoS One. 6 (1), 14587(2011).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Carballar-Lejarazu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li>
<li>Simões, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anopheles+FBN9+immune+factor+mediates+Plasmodium+species-specific+defense+through+transgenic+fat+body+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Develomental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression.</a> Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).</li>
<li>Arik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Akt+signaling+in+the+mosquito+fat+body+increases+adult+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship.</a> FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).</li>
<li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+olfactory+centres+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature Communications. 7, 13010(2016).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+transgenic+multistage+effector-gene+combinations+for+Plasmodium+falciparum+suppression+in+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles.</a> Science Advances. 6 (20), (2020).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Anopheles+research.+Chapter+3%3A+Specific+Anopheles+techniques.+3.1+Embryonic+Techniques.+3.1.1+Microinjection+methods+for+Anopheles+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BEI+resources%22%5BJournal%5D)">Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos.</a> BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).</li>
<li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLoS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).</li>
<li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pragmatic+selection+of+larval+mosquito+diets+for+insectary+rearing+of+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> PLoS One. 15 (3), 0221838(2020).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עם הזמינות המוגברת של טכנולוגיות הנדסה גנטית מדויקות וגמישות כגון CRISPR/Cas9, ניתן לפתח אורגניזמים מהונדסים בצורה פשוטה ויציבה יותר ממה שאפשר בעבר. כלים אלה אפשרו לחוקרים ליצור זנים מהונדסים של וקטורים יתושים שקרובים מאוד להשגת התכונות הרצויות של השחלה לפתוגנים (שינוי אוכלוסין) או סטריליות תורשתית (דיכוי האוכלוסייה). עם זאת, כדי לפתח את היתושים הבטוחים והיציבים ביותר האפשריים, יש ליצור ולהעריך קווים מהונדסים נוספים כך שייבחרו קווים אופטימליים למחקרי שטח. הפרוטוקול המתואר יכול להגביר את היעילות של יצירת מהונדסים אנופ...

טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה שימשו לתפעול ניסיוני של אורגניזמים מאז תחילת המאהה-20 . Microinjection שימש כדי ללמוד הן פונקציות ביולוגיות בסיסיות ו /או להציג שינויים חשובים בביולוגיה של אורגניזם הרצוי. טכניקת המיקרו-שיתוף הייתה מעניינת במיוחד ביולוגים וקטורים, והיא נמצאת בשימוש נרחב לתפעול גנומים וקטוריים2-11. ניסויי Transgenesis בווקטורים פרוקי רגליים לעתים קרובות שואפים להפוך וקטורים פחות יעילים בהעברת פתוגנים על ידי חקיקת שינויים שמקטינים את הכושר של וקטור או מגבירים את השחלה לפתוגנים שהם משדרים. יתושים מעבירים מגוון פתוגנים אנושיים ויש להם השפעה משמעותית על התחלואה והתמותה ברחבי העולם. סוג אנופלס של יתושים מעביר את הפתוגנים טפילים מלריה האנושית, פלסמודיום spp. ניסויים בהנדסה גנטית עם אנופלים נועדו להבין טוב יותר את הביולוגיה ולהפחית את היכולת הווקטורית של יתושים אלה במאמצים לפתח אסטרטגיות לחיסול מלריה חדשניות.
וקטורים יתושים התורמים ביותר זיהומים מלריה ברחבי העולם הם במתחם מינים אנופלס גמביה. עם זאת, רוב הניסויים הטרנסגנזה המוצלחים בוצעו על וקטור המלריה של תת היבשת ההודית, אנופלס סטיבנסי. בעוד שפע של זני אנופלס גמביה מותאמי מעבדה קיימים, מספר הקווים המהותניים של אנופלס גמביה spp. שדווחו בספרות אינו משתווה לזה של אנופלס סטיבנסי. הוא חשב כי אנופלס גמביה עובר קשה יותר להזריק ולהשיג טרנסגנזה מוצלחת מאשר אנופלס stephensi, אם כי הסיבות להבדלים אלה אינם ידועים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוכח כי היא מצליחה בעקביות בהשגת טרנסגנזה של עוברים אנופלס גמביה באמצעות מיקרו-ינון. הפרוטוקול מבוסס על שיטה שפותחה בעבר על ידי הרה בוסין ומארק בנדיקט12 עם כמה פרטים נוספים ושינויים שנוספו שנמצאו כמגבירים את היעילות של transgenesis.

<table><tbody><tr><td>10x מאגר מיקרו-הזרקה</td> <td>-</td><td></td> <td>1 מ"מ NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 מ"מ KCl</td></tr><tr><td>ממברנת ספיגה (Zeta-Probe GT Genomic Blotting Membrane)</td> <td>Bio-Rad</td><td></td><td>חתוך בצורה מסודרת וישרה לחתיכה בגודל 2x1 ס"מ</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל (צינור צנטריפוגה חד פעמי, פוליפרופילן)</td> <td>Fisher</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Brand Endsמים נטולי יונים או מזוקקים כפולים (ddH20)&nbsp;</td><td>מילי-קיו</td><td></td><td>בבקבוק כביסה&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח&nbsp;</td><td>לייקה&nbsp;</td><td>Leica MZ12</td><td>ליישור עוברים</td></tr><tr><td>מלקחיים&nbsp;</td><td></td><td></td><td>מידה מס' 5&nbsp;</td></tr><tr><td>מיכל זכוכית&nbsp;</td><td>פיירקס</td><td>מס' 3140</td><td>125 x 65</td></tr><tr><td>שקופית זכוכית&nbsp;</td><td>מותג פישר</td><td>מס' 12-549-3</td><td>75x26 מ"מ</td></tr><tr><td>חממה</td><td>Barnsted Lab-line</td><td>דגם מס' 150</td><td>28 &deg; C</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>50 מ"מ</td></tr><tr><td>סרט שיניים לטקס&nbsp;</td><td>Crosstex International</td><td>מס' 19302</td><td></td></tr><tr>מכשיר <td>סאטר</td><td></td><td>מיקרו-מזרק</td><td>XenoWorks מיקרו-מזרק דיגיטלי</td></tr><tr><td>מיקרו-מעמיס קצות פיפטה&nbsp;</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td></td><td>20 ומיקרו; L microloader epT.I.P.S.</td></tr><tr><td>מכשיר מיקרומניפולטור</td><td>סאטר</td><td></td><td>XenoWorks מיקרומניפולטור</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה&nbsp;</td><td>ריינין&nbsp;</td><td></td><td>20 ומיקרו; </td></tr><tr><td>L חולץ מיקרופיפטה&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>Sutter P-2000 חולץ</td><td></td>מיקרופיפטה</tr><tr><td>מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>Leica</td><td>DM 1000 LED או M165 FC</td><td>עבור מיקרו הזרקה</td></tr><tr><td>מינימום סיבים סינון נייר&nbsp;</td><td>מותג פישר</td><td>מס' 05-714-4</td><td>נייר כרומטוגרפיה, עבה&nbsp;</td></tr><tr><td>יתושים&nbsp;</td><td>MR4, BEI Resources</td><td></td><td>Anopheles gambiae, נקבות בוגרות מזווגות, מוזנות בדם 4-5 ימים לאחר האקלוזיה</td></tr><tr><td>NaHPO4 buffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1 מ"מ, pH 6.8</td></tr><tr>רשת <td></td><td></td><td></td><td>ניילון</td></tr><tr><td>מברשת צבע</td><td>בליק</td><td>, מס' 05831-7040</td><td>עדין, גודל 4/0</td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> פטרי <td>פלסטיק, (60x15 מ"מ, 90x15 מ"מ)</td></tr> <tr><td>נתרן אצטט</td><td></td><td></td><td>&nbsp; 3M</td></tr><tr><td>נימי זכוכית קוורץ&nbsp;</td><td>מכשיר סאטר</td><td>מס' QF100-70-10</td><td>עם נימה, 1 מ"מ OD, &nbsp; מזהה 0.7 אורך 10 ס"מ</td></tr><tr><td>דרגת PCR מים&nbsp;</td><td>רוש</td><td>מס' 03315843001</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

טכניקות מיקרו-הנדסה עובריות חיוניות למחקרים מולקולריים וגנטיים רבים של מיני חרקים. הם מספקים אמצעי להכניס שברי DNA אקסוגניים קידוד גנים של עניין, כמו גם תכונות חיוביות לתוך נבט חרקים בצורה יציבה תורשתית. זנים מהונדסים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד עבור שינויים פנוטיפיים הנובעים הביטוי של ה- DNA המשולב כדי לענות על שאלות בסיסיות או בשימוש ביישומים מעשיים. למרות שהטכנולוגיה פשוטה, היא דורשת מהחוקר סבלנות ותרגול כדי להשיג רמה של מיומנות שממקסמת את היעילות. מוצג כאן שיטה למיקרו-ג'ק-קציה של עוברים של יתוש המלריה האפריקאי, אנופלס גמביה. המטרה היא לספק על ידי DNA אקסוגניים מיקרו-אינטג'ק לעובר, כך שניתן יהיה לקחת אותו בתאי הנבט המתפתחים (מוט). ביטוי מהדנ"א המוזרק של טרנספוזות, integrases, רקומבינות או גרעינים אחרים (לדוגמה חלבונים הקשורים CRISPR, Cas) יכול לעורר אירועים שמובילים להכנסה קוולנטית שלה לכרומוזומים. גמביה מהונדסת שנוצרה מטכנולוגיות אלה שימשה למחקרים בסיסיים של רכיבי מערכת החיסון, גנים המעורבים בהאכלת דם ואלמנטים של מערכת הריח. בנוסף, טכניקות אלה שימשו לייצור זני An. gambiae עם תכונות שעשויות לעזור לשלוט בהעברת טפילים מלריה.

דוגמה מייצגת ליישום פרוטוקול המיקרו-בייג'ן המתואר ניתן למצוא ב Carballar-Lejarazú et al5. הכוונה כאן הייתה להכניס מערכת הנעת גנים אוטונומית לתוך הנבט של זן מעבדה, G3, של An. gambiae. המערכת תוכננה למקד את הלוקוס האורתולוגי הקרדינל (Agcd)על הכרומוזום השלישי במין זה, המקודד heme peroxidase המזרז את ההמרה של 3-הידרוקסיקינורנין לקסנתוממטין, השלב האחרון בביוסינתזה של אומוכרום(איור 11). יתושים המכילים כונן גנים הומוזיגוס הם מוטנטים קרדינל </em...

טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג'יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מספק שיטת מיקרו-הנדסה ספציפית עבור אנופלס גמביה, אשר היה קשה מבחינה היסטורית לשנות באמצעות טכניקות הנדסה גנטית נפוצות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת באופן אמין אנופלס גמביה מהונדסת. היישומים של טכניקה זו להרחיב לקראת אסטרטגיות חדשניות לחיסול מלריה על ידי להקל על יצירת יתושים המתאימים לדיכוי האוכלוסייה או שינוי של אוכלוסיות סוג בר Anopheles גמביה.מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למינים שונים של יתושים. טכנולוגיית המיקרו-תרגול שלנו לוקחת סבלנות ותרגול. יש עקומת למידה.כדי להתחיל, השתמש בשאיפה למקם 20 עד 30 נקבות בצינור חרוט שקוף 50 מיליליטר. ודאו שהצינור נחתך בשני קצותיו ומכוסה בסרט שיניים לטקס בקצה אחד ורשת ניילון ונייר סינון בקצה השני, שם יתושים יטילו את ביציהם. מניחים את הצינור מלא יתושים בצלחת פטרי קטנה מלאה במים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן מניחים את הצינור ואת המנה באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.הסר את הצינור מן האינקובטור ולהכניס את הצינור לתוך כלוב ריק. הקש בעדינות על הצינור כדי לאפשר ליתושים לעוף החוצה. הסר את הצינור מהכלוב ברגע שכל היתושים עפו החוצה.כאשר הצינור הוא ללא יתושים, לפתוח את הטבעת התחתונה, להסיר את הניילון, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את נייר המסנן עם הביצים מן הצינור. מניחים את נייר הפילטר עמוס הביצים בצלחת פטרי מפלסטיק המכילה שכבה של נייר סינון לח במים. שים קרום על שקופית זכוכית נקייה ולהשתמש מלקחיים נקיים כדי לכסות את הממברנה עם פיסת נייר מסנן, משאיר כמילימטר אחד של מסנן הממברנה חשוף.הרטיבו את נייר המסנן במים דה-יונים, ואז השתמשו במברשת כדי להעביר בעדינות 30 עד 50 עוברים לקצה הממברנה וליישר את הביצים אנכית לאורך הממברנה. כוון את הביצים באותו כיוון, כך שכאשר ביצים נצפות תחת מיקרוסקופ microinjection, הקצה האחורי נמצא במצב למטה ויוצר זווית של 15 מעלות עם המחט. מרפדים את כל קצה הממברנה בביצים.השתמש קצה microloader כדי למלא את המחטים עם שני microliters של תערובת DNA. הכנס את המחט למחזיק המחט וחבר את צינורות משאבת הלחץ האוטומטית. יישר את המחט כך שהיא עושה זווית של 15 מעלות עם המישור של השקופית.פתח את קצה המחט על ידי נגיעה זהירה בביצה הראשונה, ולאחר מכן הכנס את קצה המחט לכ -10 מיקרומטרים בקוטב האחורי. זריקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלסמה בתוך הביצה. השתמש בפקדי השלב הקואקסיאלי של המיקרוסקופ כדי לעבור לביצה הבאה כדי להמשיך בהזרקה.כדי להבטיח כי קצה המחט נשאר פתוח ולא היה סתום, לחץ על כפתור הזרק לפני הכניסה לעובר אחר לדמיין את טיפה קטנה בפתח המחט. אם המחט נסתמת, לחץ על כפתור נקה כדי לנקות את המחט ולחזור על בדיקת ההדמיה טיפה. התאם את הלחץ לפי הצורך אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן.להזריק על 40 עד 50 ביצים עם מחט אחת. לאחר השלמת הזריקות, לשטוף את הביצים לתוך מיכל זכוכית מרופד בנייר מסנן ומלא 50 מיליליטר של מים deionized. באמצעות פרוטוקול זה, מערכת מונחה גנים אוטונומית הוכנסה לתוך הנבט של זן מעבדה G3 של אנופלס גמביה.המערכת תוכננה למקד את האורתולוגיה הקרדינל, או Agcd, על הכרומוזום השלישי במין זה. pCO37 plasmid מוצג. הוא מכיל סטרפטוקוקוס פיוגנס Cas9 אנדונוקלאז תחת שליטה של האלמנטים הרגולטוריים של אורתולוגית הגן ננו.בנוסף, יש לו RNA מדריך תחת שליטתו של מקדם גנים U6 ואת קלטת הסמן הדומיננטית 3XP3 CFP המבטאת את חלבון הפלואורסצנטי ציאן. גישות מולקולריות אימתו החדרה מדויקת של כ -10 ק"ג זוגות בסיס של DNA, אשר הוגדר AgNosCd-1. ניתוחי מעקב מקיפים הראו כי AgNosCd-1 היה יעיל מאוד בכונן, יצר אללים עמידים מעטים, ולא היה עומס גנטי גדול בשל שילוב וביטוי של מערכת כונן הגנים.כונן גנים הומוזיגוס המכיל יתושים היו מוטנטים אובדן תפקוד, עם זחלים, גלמים, ומבוגרים שזה עתה הופיעו שיש פנוטיפ עיניים אדומות. כאשר מנסים פרוטוקול זה, שמירה על 88 הוא חיוני עבור בקיעה טובה כדי ביצה אפורה בהירה ולהימנע ביצים לבנות.

microinjection-method-for-anopheles-gambiae-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אנופלס יתושים stephensi הם וקטורים עבור מלריה בהודו המאכלסים וברחבי אסיה. וידאו זה מדגים את הטכניקה לביצוע microinjections של מין זה עם transgenes כי יעניק התנגדות מלריה אל היתוש. הרבה המתודולוגיה הפגינו וידאו זה הוא ישים טכניקות microinjection של מינים יתושים אחרים.

הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

בסרטון זה, אנו מדגימים שילוב טרנסגנים ספציפיים לאתר בתיווך phiC31 בעובר אנופלס באמצעות מיקרו-הזרקה. שיטה זו מסייעת להחדיר גנים רצויים למערכת מארחת למחקר וליישומים תעשייתיים.

phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: טכניקת מיקרו-הזרקה לשילוב טרנסגנים ספציפיים לאתר לווקטור אנופלס

בסרטון זה, אנו מדגימים את העברת מבנה כונן הגן לעובר של יתוש אנופלס גמביה באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה עוברית. הליך זה מאפשר שילוב של מבנה DNA מועבר, באמצעות רקומבינציה הומולוגית, לתוך תאי הנבט כדי ליצור אוכלוסיית יתושים מותמרת.

מיקרו-הזרקה של עובר יתוש: טכניקה להעברת DNA אקסוגני לחלמון עובר של אנופלס גמביה ליצירת מוטציות בקו הנבט

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

למד שיטת מיקרו-הזרקה לעוברי Anopheles gambiae ליצירת יתושים טרנסגניים. פרוטוקול זה מאפשר הנדסה גנטית אמינה לבקרת מלריה ודיכוי אוכלוסיות יתושים.

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

גלה סרטונים נוספים