שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה
7 ביולי 2021
טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג'יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.
פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מספק שיטת מיקרו-הנדסה ספציפית עבור אנופלס גמביה, אשר היה קשה מבחינה היסטורית לשנות באמצעות טכניקות הנדסה גנטית נפוצות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת באופן אמין אנופלס גמביה מהונדסת. היישומים של טכניקה זו להרחיב לקראת אסטרטגיות חדשניות לחיסול מלריה על ידי להקל על יצירת יתושים המתאימים לדיכוי האוכלוסייה או שינוי של אוכלוסיות סוג בר Anopheles גמביה.
מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למינים שונים של יתושים. טכנולוגיית המיקרו-תרגול שלנו לוקחת סבלנות ותרגול. יש עקומת למידה.
כדי להתחיל, השתמש בשאיפה למקם 20 עד 30 נקבות בצינור חרוט שקוף 50 מיליליטר. ודאו שהצינור נחתך בשני קצותיו ומכוסה בסרט שיניים לטקס בקצה אחד ורשת ניילון ונייר סינון בקצה השני, שם יתושים יטילו את ביציהם. מניחים את הצינור מלא יתושים בצלחת פטרי קטנה מלאה במים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן מניחים את הצינור ואת המנה באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
הסר את הצינור מן האינקובטור ולהכניס את הצינור לתוך כלוב ריק. הקש בעדינות על הצינור כדי לאפשר ליתושים לעוף החוצה. הסר את הצינור מהכלוב ברגע שכל היתושים עפו החוצה.
כאשר הצינור הוא ללא יתושים, לפתוח את הטבעת התחתונה, להסיר את הניילון, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את נייר המסנן עם הביצים מן הצינור. מניחים את נייר הפילטר עמוס הביצים בצלחת פטרי מפלסטיק המכילה שכבה של נייר סינון לח במים. שים קרום על שקופית זכוכית נקייה ולהשתמש מלקחיים נקיים כדי לכסות את הממברנה עם פיסת נייר מסנן, משאיר כמילימטר אחד של מסנן הממברנה חשוף.
הרטיבו את נייר המסנן במים דה-יונים, ואז השתמשו במברשת כדי להעביר בעדינות 30 עד 50 עוברים לקצה הממברנה וליישר את הביצים אנכית לאורך הממברנה. כוון את הביצים באותו כיוון, כך שכאשר ביצים נצפות תחת מיקרוסקופ microinjection, הקצה האחורי נמצא במצב למטה ויוצר זווית של 15 מעלות עם המחט. מרפדים את כל קצה הממברנה בביצים.
השתמש קצה microloader כדי למלא את המחטים עם שני microliters של תערובת DNA. הכנס את המחט למחזיק המחט וחבר את צינורות משאבת הלחץ האוטומטית. יישר את המחט כך שהיא עושה זווית של 15 מעלות עם המישור של השקופית.
פתח את קצה המחט על ידי נגיעה זהירה בביצה הראשונה, ולאחר מכן הכנס את קצה המחט לכ -10 מיקרומטרים בקוטב האחורי. זריקה מוצלחת תוביל לתנועה קטנה של הציטופלסמה בתוך הביצה. השתמש בפקדי השלב הקואקסיאלי של המיקרוסקופ כדי לעבור לביצה הבאה כדי להמשיך בהזרקה.
כדי להבטיח כי קצה המחט נשאר פתוח ולא היה סתום, לחץ על כפתור הזרק לפני הכניסה לעובר אחר לדמיין את טיפה קטנה בפתח המחט. אם המחט נסתמת, לחץ על כפתור נקה כדי לנקות את המחט ולחזור על בדיקת ההדמיה טיפה. התאם את הלחץ לפי הצורך אם פתח קצה המחט גדל מעט כדי להבטיח שגודל הטיפה יישאר קטן.
להזריק על 40 עד 50 ביצים עם מחט אחת. לאחר השלמת הזריקות, לשטוף את הביצים לתוך מיכל זכוכית מרופד בנייר מסנן ומלא 50 מיליליטר של מים deionized. באמצעות פרוטוקול זה, מערכת מונחה גנים אוטונומית הוכנסה לתוך הנבט של זן מעבדה G3 של אנופלס גמביה.
המערכת תוכננה למקד את האורתולוגיה הקרדינל, או Agcd, על הכרומוזום השלישי במין זה. pCO37 plasmid מוצג. הוא מכיל סטרפטוקוקוס פיוגנס Cas9 אנדונוקלאז תחת שליטה של האלמנטים הרגולטוריים של אורתולוגית הגן ננו.
בנוסף, יש לו RNA מדריך תחת שליטתו של מקדם גנים U6 ואת קלטת הסמן הדומיננטית 3XP3 CFP המבטאת את חלבון הפלואורסצנטי ציאן. גישות מולקולריות אימתו החדרה מדויקת של כ -10 ק"ג זוגות בסיס של DNA, אשר הוגדר AgNosCd-1. ניתוחי מעקב מקיפים הראו כי AgNosCd-1 היה יעיל מאוד בכונן, יצר אללים עמידים מעטים, ולא היה עומס גנטי גדול בשל שילוב וביטוי של מערכת כונן הגנים.
כונן גנים הומוזיגוס המכיל יתושים היו מוטנטים אובדן תפקוד, עם זחלים, גלמים, ומבוגרים שזה עתה הופיעו שיש פנוטיפ עיניים אדומות. כאשר מנסים פרוטוקול זה, שמירה על 88 הוא חיוני עבור בקיעה טובה כדי ביצה אפורה בהירה ולהימנע ביצים לבנות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכניקת מיקרו-הזרקה להכנסת גנים אקסוגניים לעוברים של Anopheles gambiae, ומסייע ליצירת יתושים מהונדסים. שיטה זו מתמודדת עם האתגרים ההיסטוריים של הפיכת מין זה באמצעות גישות הנדסה גנטית קונבנציונליות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- הנדסה גנטית
- אנטומולוגיה
- בקרת וקטורים
רקע
- Anopheles gambiae הוא וקטור מלריה מרכזי.
- הפיכת מין זה הייתה קשה עם טכניקות סטנדרטיות.
- מיקרו-הזרקה מציעה שיטה אמינה ליצירת יתושים מהונדסים.
- שיטה זו יכולה להתאים למיני יתושים אחרים.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול מיקרו-הזרקה ספציפי עבור Anopheles gambiae.
- לאפשר יצירת יתושים מהונדסים לצורך בקרת מלריה.
- לספק שיטה אמינה לחוקרים בתחום.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- מיקרו-הזרקה של מבני DNA לתוך עוברים.
- שימוש בטכניקות ספציפיות שפותחו על ידי מעבדת ג'יימס.
- התאמת השיטה למיני יתושים שונים.
- אימונים ותרגול לשליטה בטכניקה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של Anopheles gambiae מהונדסים.
- הוכחת אמינות שיטת המיקרו-הזרקה.
- יישומים פוטנציאליים באסטרטגיות למניעת מלריה.
- הקלה על שינוי אוכלוסיות יתושים מסוג בר.
מסקנות
- השיטה של מיקרו-הזרקה יעילה להכנסת גנים.
- שיטה זו יכולה לסייע משמעותית במחקר בקרת וקטורים.
- מחקרים נוספים יכולים לחקור את יישומה במינים אחרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microinjection of Anopheles gambiae embryos enables stable germline transformation, addressing a longstanding bottleneck in vector control research. This technique supports the development of gene drive systems for malaria elimination by facilitating heritable genetic modifications in a key disease vector. Reliable embryo injection enhances predictive confidence in target validation and preclinical modeling of transmission-interrupting strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genes involved in blood-feeding, immunity, and olfaction through stable transgene expression.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate transgenic lines for target de-risking in vector-borne disease programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Creates standardized transgenic mosquito strains for phenotypic screening of antiparasitic or transmission-blocking compounds.
- Operational Value: Supports assay readiness by delivering consistent genetic backgrounds for high-throughput evaluation of gene drive efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables evaluation of gene drive performance, resistance allele formation, and genetic load in controlled laboratory settings prior to field trials.
- Operational Value: Facilitates preclinical validation of transmission-reducing traits in Anopheles gambiae strains under standardized insectary conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The microinjection method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling target validation, strain generation, and functional assessment of genetic interventions for malaria control.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in pathogen transmission and host-seeking behaviors via germline transformation.
- Screening: Generates isogenic transgenic lines for reproducible evaluation of gene drive components and effector genes.
- Analytics: Enables quantitative measurement of transgene expression, drive efficiency, and phenotypic outcomes such as eye color or fertility.
- Translational Research: Connects molecular constructs to organismal phenotypes in a disease-relevant system for risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform technology adaptable across mosquito species for sustained vector control pipeline support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through heritable gene expression and phenotypic readouts.
- Operational Value: Standardized embryo handling and injection protocols improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage vector control programs by enabling early assessment of gene drive properties.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions based on drive efficiency, resistance profiles, and fitness costs in transgenic strains.
Implementation Considerations
- Expertise in mosquito embryology and microinjection instrumentation is required for successful embryo manipulation.
- Access to microinjection systems, pressure pumps, and microscopy setups with coaxial stage controls is essential.
- Standardization of embryo alignment, needle angle, and injection volume across teams ensures consistent transgenic outcomes.
- Adaptation to other mosquito species may require optimization of incubation timing, embryo staging, and membrane preparation.
- Success depends on user proficiency due to the technical learning curve inherent in delicate embryo handling.
