PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית
28 ביוני 2021
פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.
פרוטוקול זה מספק תפוקה גבוהה ואיפור אמין לניתוח NHEJ שיכול לקבוע את השכיחות ואת הכמות היחסית של מוטציות Indel באוכלוסיות יתושים בעריכת גנים. בהשוואה לדור הבא, או ריצוף סנגר, ל- ddPCR יש זמן תפנית מהיר יותר לתוצאות, המאפשר ניתוח מהיר ומלא של שונות גנטית לשדה עבור אורגניזמים מהונדסים גנטית. שיטה זו צריכה להיות ישימה בדרך כלל לכל המערכות הניסיוניות.
שיוכיח את ההליך יהיה תאי פאם, עמית מחקר מהמעבדה של היאנג. ראשית, הכינו 25 מיקרוליטרים של ה-PCR טיפה דיגיטלית, או תערובת דגימת ddPCR על ידי הוספת תערובת סופר ddPCR, פריימרים קדימה ואחורה, בדיקות HEX או FAM, DNA ומים בפרופורציות המתוארות בטקסט. ואז לערבב ביסודיות את התגובה על ידי מערבולת.
באמצעות פיפטה רב-ערוצית של 50 מיקרוליטר, טען 20 מיקרוליטרים של תערובת דגימת ddPCR לשורה האמצעית של המחסנית. לאחר מכן השתמש 200 מיקרוליטר פיפטה רב ערוצית לטעון 70 microliters של השמן לשורה התחתונה מבלי ליצור בועות לאורך הצינורות. מניחים את האטם, נוגעים רק בקצוות, נמנעים מהמרכז, האזור הקומר, ולאחר מכן מניחים את הצלחת בבטחה במחולל הטיפות, וסוגרים את הכיסוי כדי להתחיל את הריצה.
כדי להעביר את תערובת הטבילה מהשורה העליונה של המחסנית לצלחת 96-well, השתמש בצינור רב-ערוצי, ושחרר 40 מיקרוליטרים של דגימה נוזלית למשך שלוש עד חמש שניות בזווית של 30 עד 45 מעלות. לאחר מכן לגרש את התערובת לתוך הבאר לאט במשך יותר משלוש שניות בזווית של 45 מעלות, ומאפשר לו לרדת מהצד, ולאחר מכן ללכת לתחנה השנייה של pipette לגרש את הנוזל לחלוטין. בעזרת אטמי חום בנייר כסף, אוטמים את הלוחות לחמש שניות ב-180 מעלות צלזיוס.
מניחים את הצלחת האטומה לתוך התרמוציקלר, ומגדירים את תנאי ה- PCR להנחיות ההורדה של NHEJ על ידי הגדרת denaturation ראשונית ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להגדיר 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות כדי denature, 55 מעלות צלזיוס מדקה אחת עד חלאל, ו 60 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי להאריך. לאחר 40 מחזורים, קבעו 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והחזקה סופית בארבע מעלות צלזיוס.
השתמש בקצב הרמפה של שתי מעלות צלזיוס לשנייה עבור כל השלבים. טמפרטורת חישול ישתנה, על פי הבדיקות או פריימר בשימוש. מניחים את הצלחת בבטחה בקורא הטיפות כאשר ה- A1 מסומן היטב בצד שמאל העליון.
פתח את התוכנית והגדר את הצלחת על ידי הגדרת FAM כערוץ הייחוס הידוע, ו- HEX כערוץ הלא ידוע עבור כל באר. לאחר מכן, שנה את השם עבור כל דוגמה. הפעל את ניסוי הקריאה טיפה כימות ישיר תוך שמירת התבנית.
לייעד את הפרמטרים הניסיוניים הנכונים לניתוח תוכנה, כלומר מידע לדוגמה, תערובת סופר, שם יעד, סוג יעד, ערוץ אות 1 ערוץ 2. לאחר מכן, הגדר את הסף לספירת טיפות מעל 10,000 לקבלת תוצאות אמינות. לאחר מכן, בדוק את ספירת הטיפות עבור כל באר בכרטיסיה טיפה, ומבטיח שכולם מעל 10,000.
לבסוף, בדוק משרעת 1D להפרדת אותות יעילה מתשלילים. בעורך הלוחות, הדגישו את כל הצלחת והגדירו את סוג הניסוי לירידה. הגדר את יעד WT כהפניה, וייעד את ערוץ 1 עבור FAM ואת ערוץ 2 עבור HEX.
הגדר את יעד NHEJ כלא ידוע, וייעד את ערוץ 1 עבור FAM ואת ערוץ 2 כאפס. בכרטיסיה משרעת דו-ממדית, הגדר את סף האשכול בעזרת כלי הגרף עבור כל דגימה. הזנב קשור בדרך כלל עם אשכול WT לבדיקות NHEJ.
תחת לשונית היחס, לחץ על סמל גלגל השיניים מהחלק השמאלי העליון של הגרף ובחר את שפע השבר כדי להתוות נקודה המתאימה לאחוז אירועי NHEJ. 15 דגימות שונות של 10 יתושים כל אחד הכיל אללים NHEJ שונים, נותחו וזוהו באמצעות בדיקת טיפה, והתוצאות הראו כי כל 15 הדגימות נשאו 100% אללים Indel. בניסוי אחר, 11 דגימות של יתושים מסוג בר ויתושים NHEJ עם אחוזי NHEJ שונים נבדקו עם פרוטוקול ddPCR זה.
התוצאות הראו כי האחוז שזוהה היה קרוב יחסית לזיהוי Indel על ידי טכניקת ניתוח אמפליסון. פיפטה לאט כדי למנוע בועות, ולאפשר לכל טיפות אמולסיה לטפטף במורד הקיר של בארות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את השלבים לביצוע PCR בטיפות דיגיטליות (ddPCR) לצורך ניתוח אירועי חיבור קצוות שאינו הומולוגי (NHEJ) לאחר שבירה על ידי Cas9. הוא מספק שיטה מהימנה לכימות מוטציות Indel באורגניזמים שעברו שינוי גנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסה גנטית
- ביולוגיה מולקולרית
- גנומיקה
רקע
- NHEJ הוא מנגנון קריטי לתיקון DNA.
- ddPCR מציע יתרונות על פני שיטות ריצוף מסורתיות.
- ניתוח מהיר הוא חיוני ליישומים שטח במודיפיקציה גנטית.
- שיטה זו ישימה במגוון מערכות ניסוייות.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט לניתוח אירועי NHEJ באמצעות ddPCR.
- סיוע בכימות של וריאציות גנטיות באורגניזמים שעברו מודיפיקציה.
- הדגמת היעילות של ddPCR בזיהוי מוטציות Indel.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תערובת דגימות ל-ddPCR עם ריאגנטים ספציפיים.
- טעינת דגימות למחולל טיפות ולתרמוסייקלר.
- קביעת תנאי PCR לצורך אנליזת NHEJ.
- שימוש בתוכנה לקריאת טיפות וניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- כל הדגימות שנבדקו הראו 100% אללים מסוג Indel.
- תוצאות ה-ddPCR היו דומות לאלו של טכניקות ניתוח אמפליקונים.
- הושגה כמותיזציה מהימנה של אירועי NHEJ.
- השיטה הפגינה יעילות בניתוח וריאציות גנטיות.
מסקנות
- ddPCR הוא כלי חסון לניתוח אירועי NHEJ.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למגוון מחקרים גנטיים.
- זמן תגובה מהיר משפר את יכולות המחקר בתחום הגנטיקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכנולוגיית PCR של טיפות דיגיטליות (ddPCR) מאפשרת זיהוי כמותי ומהיר של מוטציות מסוג indel באוכלוסיות של יתושים שעברו שינוי גנטי, ובכך תומכת בהערכה רחבת-היקף של דיוק העריכה באמצעות CRISPR-Cas9. שיטה זו מספקת חלופה שניתן להפעיל בשטח עבור ריצוף, עם זמן תגובה קצר יותר, המקל על קבלת החלטות בזמן אמת בתוכניות להנחיית גנים (gene drive) ובקרת וקטורים. על ידי אספקת נתונים על תדירות מוטציות ברמת האוכלוסייה, ה-ddPCR מסייע בהפחתת סיכונים של מבנים גנטיים ובהערכת הפוטנציאל להשפעות מחוץ למטרה (off-target) במהלך פיתוח פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: כימות שכיחות מוטציות indel להערכת יעילות העריכה של CRISPR-Cas9 ועקביות המוטגנזה בגנומים המטרה.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה מהירה של מאגרי יתושים ערוכים כדי לאשר פעילות on-target לפני המעבר לבדיקות פונקציונליות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של אירועי NHEJ ללא צורך בזיהוי רצפים בודדים, דבר התומך בהערכה ניתנת להרחבה של נטל מוטציות.
- ערך תפעולי: תואם ליישום במעבדה בשטח, ובכך מפחית את התלות בתשתיות ריצוף מרכזיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מודד את שכיחות אללה של indel במדגמים מאוחדים (pooled samples) כדי להקריב קורלציה בין שונות גנטית לתוצאות פנוטיפיות במערכות של drive גנים.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות במהירות רבה יותר מאשר ריצוף Sanger או ריצוף דור הבא (next-generation sequencing), ובכך מאיץ את מחזורי החזרתיות (iteration cycles) בתיקוף פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ddPCR משתלב ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לניתוח מוטציות כמותי לאחר עריכה גנומית ולפני סריקה פנוטיפית, ובכך תומך בקבלת החלטות של go/no-go בהתבסס על דיוק העריכה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות indels הנובעים מ-NHEJ כמדד ליעילות העריכה בלוכוסים המטרה.
- סריקה: מספק כימות סטנדרטי וניתן לשחזור של תדירות מוטציות במערכי דגימות גדולים לצורך מוכנות הבדיקה.
- אנליטיקה: מפיק את השכיחות השברית של אירועי NHEJ, מה שמאפשר השוואה בין תנאי עריכה לבין ביצועי guide RNA.
- מחקר תרגומי: מאפשר רציפות מאימות מבנה ערוך להערכת יציבות גנטית ברמת האוכלוסייה.
- שימוש חוזר בארגון: הפרוטוקול ניתן להסתגל עבור חרקים ומערכות מודל אחרות לצורך ניתוח NHEJ עקבי בתהליכי עבודה של הנדסה גנטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בדיוק העריכה באמצעות זיהוי כמותי של indel, המפחית עמימות מכניסטית במערכות שעברו עריכה גנטית.
- ערך תפעולי: יכולת סריקה בתפוקה גבוהה עם זמן עבודה ידני מינימלי ותוצאות מהירות, המשפרות את תפוקת המעבדה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות להמשך או הפסקה (go/no-go) על ידי קביעת ספי סדירות של מוטציות, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מבני gene drive מותאם סיכונים, בהתבסס על דיוק עריכה מאומת.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות בהגדרת ddPCR, כולל הכנת דגימות, יצירת טיפות ואופטימיזציה של PCR.
- תלוי בגישה למחולל טיפות, לתרמוציקלר ולקורא פלואורסצנציה עם תצורת ערוצים מתאימה.
- מחייב תכנון סטנדרטי של פריימרים ופרובים לצורך הבחנה מדויקת במטרה במבחני NHEJ.
- יש להתחשב בשונות של טמפרטורת ההיברידציה (annealing) בהתאם לכימיה של הפרוב כדי להבטיח הפרדה של האות.
- מוגבל לכימות יחסי; אינו מספק מידע על רצף ספציפי לאלל ללא שימוש בשיטות משלימות.
