Name: השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: חקור את יכולת ההפקת החום של המיטוכונדריה באמצעות טכניקת המהדק טלאי למדידת דליפת פרוטונים. שיטה זו מאפשרת לזהות מנגנונים מולקולריים ולחקור מוליכויות נוספות כגון סידן ונוקלאוטידי אדנין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אני מודה לד"ר יורי קיריצ'וק על המדע הגדול שהייתי חלק ממנו במעבדתו ולחברי מעבדת קיריצ'וק על הדיונים המועילים. אני מודה גם לד"ר דאגלס ס. וואלאס על שסיפק עכברי נוקאאוט AAC1 . מימון: A.M.B נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של איגוד הלב האמריקאי 19CDA34630062.

כל ההליכים הניסוייים בבעלי חיים שבוצעו תואמים את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (IACUC).
הערה: הליך הבידוד המיטוכונדריאלי מבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית ומשתנה מעט מרקמה לרקמה. לדוגמה, מכיוון שרקמת השומן החום עשירה מאוד בשומנים, היא דורשת צעד נוסף כדי להפריד בין פסולת תאים ואברונים לבין שלב השומנים לפני קצירת המיטוכונדריה. כדי למנוע בלבול, שני הליכי הבידוד המיטוכונדריאליים (אחד מהשומן החום והשני מהלב) מפורטים להלן.
1. בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום בין-סקפולרי של עכברים (שונה מ-Bertholet et al. 2020)15
<ol><li>המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.</li>
	<li>לאחר מיקום העכבר עם בטנו מול השולחן, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער (שונה מ- Mann et al., 2014)16.</li>
	<li>בצעו חתך של 2 ס"מ בגב העליון לאחר שתפסו את העור בפינצטה.</li>
	<li>הוציאו את השומן הבין-סקפולרי החום של העכבר המתאים לאיבר בעל שתי אונות עם צורת פרפר16.</li>
	<li>מעבירים את השומן החום לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ במילוי 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) שהונח בעבר על קרח.</li>
	<li>נקו את השומן החום מהשומן הלבן מתחת למשקפת.</li>
	<li>מעבירים את השומן החום לכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לחתוך אותו לחתיכות דקות. העברה להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (חומר פלסטי פוליטטראפלואורואתילן (PTFE) מזיקים).</li>
	<li>השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.</li>
	<li>צנטריפוגה ההומוגנאט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C ב 4 °C ב 15 מ"ל צינור חרוטי קר כקרח. יש להשליך את ה-supernatant המכיל את שלב השומנים.</li>
	<li>החיזרו את הכדור ב-5 מ"ל של חיץ בידוד קר כקרח (טבלה 1) והומוגניזציה, בפעם השנייה, את ההשעיה על הקרח עם שש משיכות איטיות במהירות של 275 סיבוב לדקה.</li>
	<li>מעבירים את ההומוגנאט בצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לכדור את כל הגרעינים והתאים הלא שבורים.</li>
	<li>אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.</li>
	<li>גלולת Resuspend המכילה מיטוכונדריה ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) ומדגירה את התרחיף המיטוכונדריה על קרח למשך 10-15 דקות.</li>
</ol>2. בידוד מיטוכונדריאלי מלב העכבר (שונה מ- Garg et al. 2019)17
<ol><li>המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.</li>
	<li>לאחר הצבת העכבר על גבו, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער. לאחר מכן, בצע חתך של 2 ס"מ על בית החזה לאחר אחיזת העור בפינצטה.</li>
	<li>נתחו את הלב מהחזה של החיה ושטפו אותו כדי להסיר את כל הדם בכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של תמיסת הבידוד הקר (טבלה 1).</li>
	<li>לאחר שהלב נוקה מעקבות של דם, העבירו אותו לכוס נוספת של 10 מ"ל המכילה 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לקצוץ אותו לחתיכות דקות. לאחר מכן, העבר להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (הדברת PTFE).</li>
	<li>השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.</li>
	<li>מעבירים את ההומוגנאט לצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לגרעיני כדוריות ולתאים לא שבורים.</li>
	<li>אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.</li>
	<li>בצעו שימוש חוזר בכדור המיטוכונדריאלי ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) והדגירו את התרחיף המיטוכונדריאלי על קרח למשך 10-15 דקות.</li>
</ol>3. הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של ה- OMM.
הערה: הליך העיתונות הצרפתית מאפשר לשחרר את ה-IMM מה-OMM כאשר שלמותו נשמרת, כולל המטריצה וה-crista (איור 2)18. המיטוכונדריה מודגרת מראש במאגר היפרטוני-מניטול (טבלה 2) ונתונה ללחץ נמוך יותר במהלך הליך העיתונות הצרפתית כדי למנוע כל מתיחה דרסטית של ה-IMM כאשר ה-OMM נקרע.
<ol><li>מלאו את תרחיף המיטוכונדריה-היפרטוני-מניטול לתוך תא לחץ מיני מקורר (קוטר בוכנה 3/8 אינץ') של העיתונות הצרפתית (איור 3A).</li>
	<li>בחר את מצב Medium של העיתונות הצרפתית ודחס את המתלים דרך תא הלחץ המיני ב-110 בחוגה של העיתונות הצרפתית עבור המיטוכונדריה של השומן החום וב-140 עבור המיטוכונדריה של הלב (כ-2,000 psi).  ודאו שהמתלים יוצאים מתא הלחץ הזעיר בקצב של כ-1 טיפה לשנייה.</li>
	<li>אסוף את הטיפות בצינור חרוטי מצונן קרח של 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את המתלים ב 10,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).</li>
	<li>בצעו שימוש חוזר בכדור המיטופלסטים ב-0.5-2 מ"ל של חיץ היפרטוני-KCl קר כקרח (טבלה 3) ואחסנו את ההשעיה על קרח. הערה: שומן חום ומיטופלסטים של לב מוכנים להקלטות מהדקי טלאים וצריכים להישאר שמישים במשך כ-3-6 שעות.</li>
</ol>4. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של דליפת H+ דרך UCP1 ו-AAC 5,7,15
הערה: השתמש במערך האלקטרופיזיולוגי הבא (איור 3B): מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית (DIC), 60x מטרת טבילת מים, טבלת בידוד רטט וכלוב פאראדיי, מגבר סטנדרטי התומך בהקלטות רעש נמוך, דיגיטציה סטנדרטית המשמשת להתקנה אלקטרופיזיולוגית, pClamp 10, מיקרומניפולטור, אלקטרודת ייחוס אמבטיה (3 M KCl-agar גשר מלח שהוכנס בתוך מחזיק מיקרואלקטרודה המכיל כדור כלוריד כסוף/כסוף מעוצב לתוך גוף המחזיק (המתואר ב- Liu et al. 2021)19, תא פרפוזיה עם תחתית כיסוי זכוכית 0.13 מ"מ, המחובר למערכת פרפוזיה הניזונה מכוח הכבידה.
<ol><li>משוך את חוטי הזכוכית הבורוסיליקטים ביום ההקלטה באמצעות מושך מיקרופיפט. הגדר תוכנית על המושך המשמש ליצירת פיפטות עם רמה גבוהה של שכפול20. הערה: תכנון תוכנית זה דורש מספר ניסיונות להשיג פיפטות המותאמות למהדק התיקון של IMM. לפיפטה סטנדרטית יש קצוות עדינים עם צורה חרוטית מתקדמת.</li>
	<li>הכנס חוט זכוכית אחד בתוך המושך ומשך כדי להשיג כמעט שתי פיפטות טלאי זהות מחוט בורוסיליקט אחד.</li>
	<li>התאם את התוכנית כאשר פיפטות הופכות להיות לא עקביות בין מחזורי משיכה עקב הזדקנות של חוט תיבת החימום של המושך.</li>
	<li>מקמו את הפיפטה בתוך מלטש הפיפטה והניחו את הקצה ליד החוט מתחת להגדלה של פי 100 כדי ללטש אותו.</li>
	<li>לחץ על דוושת כף הרגל מספר פעמים כדי לחמם את החוט מבלי לסתום או לפגוע בעקומת הקצה.</li>
	<li>פיפטות פולניות עם התנגדות בין 25 ל-35 MΩ מתקבלות כאשר הן מתמלאות בתמיסת פיפטה מבוססת TMA (TMA עבור טטרה-מתילמוניום הידרוקסיד, טבלה 4).</li>
	<li>קדם-דגירה של כיסויים (קוטר 5 מ"מ, עובי 0.1 מ"מ) עם 0.1% ג'לטין כדי להפחית את הידבקות המיטופלסט ולשטוף אותם בתמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) לפני הפקדת תרחיף המיטופלסט.</li>
	<li>מכינים דילול גולמי על ידי ערבוב של כ-35 μL של תרחיף המיטופלסט המרוכז עם 500 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) ומניחים אותה על כיסויים שהונחו בעבר בבאר של צלחת בעלת 4 בארות.</li>
	<li>דגירה על קרח במשך 15 עד 20 דקות עבור מיטופלסטים למשקעים על הכיסוי.</li>
	<li>מלאו את תא האמבטיה לחלוטין בכ-50 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5).</li>
	<li>העבר כיסוי עם מיטופלסטים בתוך התא באמצעות פינצטה מיקרו-דיסקטיבית דקה עם קצה כפוף.</li>
	<li>מסדרים את הכיסוי בתחתית החדר. אין להחדיר את החדר כדי לשמור על יציבות המיטופלסטים על הכיסוי.</li>
	<li>בחר מיטופלסט בודד שאינו דבק בצורת 8 על ידי סריקת הכיסוי מתחת למיקרוסקופ עם מטרה של פי 60.</li>
	<li>טענו את הפיפטה בתמיסת הפיפטה (כ-50 μL) והניחו אותה במחזיק הפיפטה.</li>
	<li>הביאו את הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור והתקרבו אליה ממש מעל המיטופלסט שנבחר כדי להתקרב ל-IMM. תוכנית המגבר נותנת את ההתנגדות של הפיפטה ברגע שהיא בתמיסת האמבטיה. החזק את פוטנציאל הממברנה ב- 0 mV והחיל פולסים של 10 mV באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר.</li>
	<li>הפעילו לחץ שלילי קל כדי ליצור במהירות ג'יגאזאל עם ה-IMM (איור 2B).</li>
	<li>הגבירו את הפיפטה עם המיטופלסט המחובר כדי להרחיק אותם מהכיסוי כדי למנוע את שבירת האטמים עקב סחף הפיפטה במהלך הניסוי.</li>
	<li>הפיצו את חולפי הקיבולים המשוטטים באמצעות הפקודה "בדיקת ממברנה" בתוכנית המגבר לפני בדיקת תצורת המיטופלסט כולו כדי לקבל מדידת קיבוליות (Cm) נכונה עבור קרום המיטופלסט לאחר הפריצה.</li>
	<li>החל פולסים של מתח קצר-טווח (5-15 אלפיות השנייה) (250-600 mV) עם תוכנית המגבר כדי לקרוע את תיקון הממברנה מתחת לפיפטת הזכוכית ולהשיג את תצורת המיטופלסט השלמה (איור 2C). פריצה מוצלחת משתקפת על ידי הופעתם המחודשת של ארעי הקיבול.</li>
	<li>לאחר הפריצה, התאם את ארעי הקיבול עם אפשרות בדיקת הממברנה של תוכנית המגבר כדי להעריך את קיבוליות הממברנה (המשקפת את גודל המיטופלסט) ואת התנגדות הגישה שלו Ra (המשקפת את איכות תצורת המיטופלסט השלם). לאחר הפריצה, Ra צריך להיות בין 40 ל 80 MΩ. למיטופלסטים (בגודל 2-6 מיקרומטר) המשמשים לניסויים בהידוק טלאי יש בדרך כלל קיבוליות ממברנה של 0.5-1.1 pF.</li>
	<li>מיד לאחר הפריצה, החליפו את תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) בתמיסת האמבטיה HEPES (טבלה 6) על ידי הפעלת הזלוף.</li>
	<li>החל פרוטוקול רמפה של 850 אלפיות השנייה שתוכנן עם תוכנית המגבר, החל מ-160 mV- ועד +100 mV עם מרווח של 5 שניות, תוך החזקת המיטופלסט ב-0 mV. פרוטוקול זה עובד עבור מחקרי UCP1 6,7,15 ו-AAC5 (איור 4 ואיור 5). הערה: מומלץ למדידות זרם H+ תלויות UCP1 ו-AAC לרכוש את כל הנתונים האלקטרופיזיולוגיים ב-10 קילוהרץ ולסנן ב-1 קילוהרץ באמצעות תוכנה מתאימה המניעה את המגבר והדיגיטציה.</li>
</ol>

<ol><li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).</li>
<li>Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+advances+in+adaptive+thermogenesis%3A+UCP1+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond.</a> Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hunt+for+the+molecular+mechanism+of+brown+fat+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 9-18 (2017).</li>
<li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29+transport+is+an+integral+function+of+the+mitochondrial+ADP%2FATP+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier.</a> Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).</li>
<li>Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+fatty-acid-dependent+UCP1+uncoupling+in+brown+fat+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria.</a> Cell. 151 (2), 400-413 (2012).</li>
<li>Bertholet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+patch+clamp+of+beige+adipocytes+reveals+UCP1-positive+and+UCP1-negative+cells+both+exhibiting+futile+creatine+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).</li>
<li>Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+is+a+highly+selective+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel.</a> Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).</li>
<li>Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+varies+greatly+between+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues.</a> Nature Communications. 3, 1317(2012).</li>
<li>Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCU+encodes+the+pore+conducting+mitochondrial+calcium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents.</a> eLife. 2, 00704(2013).</li>
<li>Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+transmembrane+mechanisms+control+MCU-mediated+mitochondrial+Ca%282%2B%29+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).</li>
<li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMRE+is+a+matrix+Ca%282%2B%29+sensor+that+governs+gatekeeping+of+the+mitochondrial+Ca%282%2B%29+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter.</a> Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).</li>
<li>Vais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCUR1%2C+CCDC90A%2C+is+a+regulator+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).</li>
<li>Kamer, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MICU1+imparts+the+mitochondrial+uniporter+with+the+ability+to+discriminate+between+Ca%282%2B%29+and+Mn%282%2B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).</li>
<li>Bertholet, A. M., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+H%28%2B%29+leak+in+brown+and+beige+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat.</a> Frontiers in Physiology. 11, 326(2020).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174(2014).</li>
<li>Garg, V., Kirichok, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+analysis+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).</li>
<li>Decker, G. L., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+biochemical+studies+of+mitoplasts+and+outer+membranes+derived+from+French-pressed+mitochondria.+Advances+in+mitochondrial+subfractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation.</a> Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+electrical+currents+across+the+plasma+membrane+of+mammalian+sperm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).</li>
<li>Flaming, D. G., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+puller+design%3A+form+of+the+heating+filament+and+effects+of+filament+width+on+tip+length+and+diameter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter.</a> Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).</li>
<li>Klingenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+and+ATP+transport+in+mitochondria+and+its+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+and+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier.</a> Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).</li>
</ol>

המחבר מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

מאמר שיטה זה נועד להציג את טכניקת מהדק הטלאי שיושמה לאחרונה על המיטוכונדריה, גישה חדשה לחקר ישיר של דליפת H+ דרך ה-IMM האחראית על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית 5,6,7,15. טכניקה זו אינה מוגבלת לרקמות וניתן להשתמש בה גם כדי לנתח דליפת H+ ומוליכות אחרות של ה-IMM במודלים סטנדרטיים שונים של בני אדם ותאים כגון תאי HAP1, COS7, C2C12 ו-MEF. עם זאת, כל בידוד מיטוכונדריאלי דורש כמה התאמות...

המיטוכונדריה מפורסמים בהיותם תחנת הכוח של התא. ואכן, הם המקור העיקרי לאנרגיה כימית, ATP. מה שפחות ידוע הוא כי המיטוכונדריה גם לייצר חום. למעשה, כל מיטוכונדריה מייצרת כל הזמן את שני סוגי האנרגיות (ATP וחום) ואיזון עדין בין שתי צורות האנרגיה מגדיר הומאוסטזיס של תאים מטבוליים (איור 1). כיצד המיטוכונדריה מפיצה אנרגיה בין ATP לחום היא ללא ספק השאלה הבסיסית ביותר בתחום הביו-אנרגיה, אם כי היא עדיין לא ידועה במידה רבה. אנו כן יודעים שהגדלת ייצור החום המיטוכונדריאלי (הנקראת תרמוגנזה מיטוכונדריאלית), וכתוצאה מכך הפחתת ייצור ה-ATP מגדילה את ההוצאה האנרגטית וזו אחת הדרכים הטובות ביותר להילחם בתסמונת מטבולית1.
תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מקורה בדליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית (IMM), מה שמוביל לניתוק של חמצון המצע וסינתזת ATP עם ייצור כתוצאה מכך של חום, ומכאן השם "uncoupling המיטוכונדריאלי"1 (איור 1). דליפה זו של H+ תלויה במובילים מיטוכונדריאליים הנקראים חלבונים לא משתפים פעולה (UCPs). UCP1 היה ה-UCP הראשון שזוהה. זה בא לידי ביטוי רק ברקמות תרמוגניות, שומן חום, ושומן בז 'שבו המיטוכונדריה מתמחים בייצור חום 2,3,4. הזהות של UCP ברקמות שאינן שומן כגון שרירי השלד, הלב והכבד, נותרה שנויה במחלוקת. המיטוכונדריה ברקמות אלה יכולה להיות כ -25% מכלל האנרגיה המיטוכונדרית המומרת לחום, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על הפיזיולוגיה של כל הגוף1. מלבד שמירה על טמפרטורת הגוף הבסיסית, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה על ידי הפחתת קלוריות. בנוסף, הוא מפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי מיטוכונדריה כדי להגן על תאים מפני נזק חמצוני1. לפיכך, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מעורבת בהזדקנות תקינה, בהפרעות ניווניות הקשורות לגיל ובמצבים אחרים המערבים עקה חמצונית, כגון איסכמיה-רפרפוזיה. לכן, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת רב עוצמה של חילוף החומרים התאי, והבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תקדם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות כדי להילחם בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
נשימה מיטוכונדריאלית הייתה הטכניקה הראשונה שחשפה את התפקיד המכריע של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית בחילוף החומרים התאי והיא עדיין הפופולרית ביותר בקהילה1. טכניקה זו מבוססת על מדידת צריכת החמצן על ידי שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETC) הגוברת כאשר מופעלת דליפת H+ מיטוכונדריאלית. טכניקה זו, למרות שהיא אינסטרומנטלית, אינה יכולה לחקור באופן ישיר דליפת H+ מיטוכונדריאלית על פני IMM1, ובכך הופכת את הזיהוי והאפיון המדויקים של החלבונים האחראים לכך לקשה, במיוחד ברקמות שאינן שומן שבהן ייצור החום הוא משני בהשוואה לייצור ATP. לאחרונה, הפיתוח של טכניקת הידוק הטלאי המיושמת על המיטוכונדריה, סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ על פני כל ה-IMM ברקמות שונות 5,6,7.
מהדק הטלאים המיטוכונדריאלי של כל ה-IMM הוקם לראשונה בצורה ניתנת לשחזור על ידי Kirichok et al.8. הם תיארו את המדידה הישירה הראשונה של זרמי חד-פורטר סידן מיטוכונדריאלי (MCU) בשנת 2004 באמצעות מיטופלסטים מקווי תאים COS-78. מאוחר יותר, מעבדת קיריצ'וק הראתה זרמי סידן מהודעות מיידיות של רקמות עכבר9 ודרוזופילה 9. מעבדות אחרות משתמשות כיום באופן שגרתי בטכניקה זו כדי לחקור את התכונות הביופיזיות של MCU 10,11,12,13,14. ניתוח מדבקת IMM שלם של מוליכות אשלגן וכלוריד אפשרי גם הוא והוזכר במספר מאמרים אך עדיין לא היה הנושא העיקרי של פרסום 6,7,9. המדידה הראשונה של זרמי H+ ברחבי ה-IMM דווחה בשנת 2012 ממיטוכונדריה6 של שומן חום עכבר, וממיטוכונדריה של שומן בז' בעכבר בשנת 20177. זרם זה נובע מחלבון ה-uncoupling הספציפי של רקמות תרמוגניות, UCP1 6,7. עבודות שפורסמו לאחרונה בשנת 2019 אפיינו את AAC כחלבון העיקרי האחראי לדליפת H+ מיטוכונדריאלית ברקמות שאינן שומן כגון הלב ושרירי השלד5.
גישה ייחודית זו מאפשרת כעת ניתוח פונקציונלי ישיר ברזולוציה גבוהה של תעלות היונים המיטוכונדריה והמובילים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. כדי להקל על הרחבת השיטה ולהשלים מחקרים אחרים כגון נשימה מיטוכונדריאלית, מתואר להלן פרוטוקול מפורט למדידת זרמי H+ הנישאים על ידי UCP1 ו- AAC. שלושה שלבים חשובים מתוארים: 1) בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום עכברי כדי לנתח זרם H+ תלוי UCP1 ובידוד מיטוכונדריאלי מהלב כדי לנתח זרם H+ תלוי AAC, 2) הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של הממברנה המיטוכונדרית החיצונית (OMM), 3) הקלטות מהדק טלאי של זרמי UCP1 ו-H+ התלויים ב-AAC על פני כל ה-IMM.

<table><tbody><tr><td>0.1% ג'לטין</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>60X טבילה במים מטרה, צמצם מספרי 1.20</td><td>מגבר אולימפוס</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B</td> התקנים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>מכשירי סאטר</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B Digitizer</td> מכשירים <td></td><td>מולקולריים</td><td></td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עיתונות צרפתית</td><td>גלן מילס</td><td>5500-000011</td><td></td></tr><tr><td>IKA Eurostar PWR CV S1 מעבדה מערבל</td><td></td><td></td><td></td>תקורה</tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX71 או IX73</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו פורג</td>' <td>(Narishige)</td> <td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanupulator MPC-385</td><td>Sutter מכשירים</td><td>FG-MPC325</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרואלקטרודה לגשר אגר</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>MEH3F4515</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td> <td>(Sutter Instruments)</td> <td>P97</td><td></td></tr><tr><td>מיני תא לעיתונות צרפתית</td><td>גלן מילס</td><td>5500-FA-004</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר IKA 6-2000RPM</td><td>קול פארמר</td><td>EW-50705-50</td><td></td></tr><tr><td>אובייקטיבי 100X הגדלה</td><td>Nikon&nbsp; עדשה</td><td>MPlan 100/0.80 ELWD 210/0</td><td></td></tr><tr><td>pClamp 10</td> מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>תא זלוף</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-24E</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem הומוגנייזר 10 מ"ל</td><td>Wheaton</td><td>358039</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת SORVALL X4R PRO-MD</td><td>Thermo Scientific</td><td>75 009 521</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים קטנים: קוטר 5 מ"מ, עובי 0.1 מ"מ</td><td>Warner Instruments</td><td>640700</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד רעידות</td><td>ניופורט</td><td>VIS3036-SG2-325A</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-חומצה גלוקונית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TMA</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>331635</td><td></td></tr><tr><td>TrisBase</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>TrisCl</td><td>&nbsp; סיגמא אולדריץ'</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

תרמוגנזה מיטוכונדריאלית (הידועה גם בשם uncoupling מיטוכונדריאלי) היא אחד היעדים המבטיחים ביותר להגדלת הוצאות האנרגיה כדי להילחם בתסמונת המטבולית. רקמות תרמוגניות כגון שומנים חומים ובז 'מפתחות מיטוכונדריה מיוחדת מאוד לייצור חום. מיטוכונדריה של רקמות אחרות, המייצרות בעיקר ATP, ממירות גם הן עד 25% מכלל ייצור האנרגיה המיטוכונדרית לחום ולכן יכולות להשפיע באופן ניכר על הפיזיולוגיה של הגוף כולו. תרמוגנזה מיטוכונדריאלית לא רק חיונית לשמירה על טמפרטורת הגוף, אלא גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ומפחיתה את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להגן על התאים מפני נזק חמצוני. מאחר שתרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת מרכזי של חילוף החומרים התאי, הבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למאבק בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. חשוב לציין שהמנגנונים המולקולריים המדויקים השולטים בהפעלה חריפה של תרמוגנזה במיטוכונדריה מוגדרים בצורה גרועה. מחסור זה במידע נובע במידה רבה ממחסור בשיטות למדידה ישירה של חלבונים שאינם מתחברים. ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיית מהדקי טלאים המיושמת על המיטוכונדריה אפשרה, לראשונה, את המחקר הישיר של התופעה במקור התרמוגנזה המיטוכונדרית, דליפת H+ דרך ה-IMM, ואת האפיון הביופיזי הראשון של מובילי מיטוכונדריה האחראים לכך, את החלבון הלא-משתף פעולה 1 (UCP1), ספציפי לשומנים חומים ובז', ואת טרנספורטר ADP/ATP (AAC) לכל הרקמות האחרות. גישה ייחודית זו תספק תובנות חדשות על המנגנונים השולטים בדליפת H+ ובתרמוגנזה מיטוכונדריאלית וכיצד ניתן למקד אותם כדי להילחם בתסמונת המטבולית. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית הידוק הטלאים המיושמת על המיטוכונדריה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית שלהן על ידי מדידה ישירה של זרמי H+ באמצעות ה-IMM.

פיתוח מתודולוגיית הידוק התיקון המיושמת על המיטוכונדריה סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ דרך ה-IMM והמובילים המיטוכונדריים, UCP1 ו-AAC, האחראים לכך. הניתוח האלקטרופיזיולוגי של דליפות H+ תלויות UCP1 ו-AAC יכול לספק מבט ראשון על היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה. סעיף התוצאות מתאר את ההליכים הסטנדרטיים למדידת דליפת H+ באמצעות UCP1 ו-AAC.
מדידת זרם H+ תלוית UCP1 (איור 4)6,7,15<sup cla...

מאמר שיטה זה מפרט את השלבים העיקריים במדידת דליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית באמצעות טכניקת הידוק טלאי, גישה חדשה לחקר היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה.

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בטכניקת מהדק המדבקה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה על ידי מדידה ישירה של דליפת פרוטונים מיטוכונדריאליים על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי. המדידה הישירה של זרם הפרוטון דרך הממברנה המיטוכונדרית הפנימית מסייעת לזהות ולאפיין במדויק את המנגנונים המולקולריים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. טכניקה זו מאפשרת לא רק למדוד את זרם הפרוטונים על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית, אלא גם לחקור מוליכונדרים אחרים החשובים לתפקוד המיטוכונדריה, כגון סידן או מטבוליטים כמו נוקלאוטידים אדנין.מקם את העכבר המתת מורדם על גבו ומרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער. לאחר מכן, בצע חתך של שני סנטימטרים על בית החזה. לאחר שתפסו את העור בפינצטה, נתחו את הלב מהחזה של החיה ושטפו אותו כדי להסיר את כל הדם לכוס של 10 מיליליטר עם חמישה מיליליטרים של תמיסת בידוד קר.לאחר שהלב נוקה מעקבות של דם, העבירו אותו לכוס אחרת של 10 מיליליטר שהכילה חמישה מיליליטרים של מאגר בידוד קר וקיצצו אותו לחתיכות דקות. לאחר מכן, העבירו אותו להומוגנייזר זכוכית 10 מיליליטר מקורר קרח. השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניזציה של הרקמה החתוכה על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים בדקה.מעבירים את ההומוגנאט לצינור חרוטי קר כקרח של 15 מיליליטר וצנטריפוגות אותו ב-700 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לכדור את הגרעינים והתאים הלא שבורים. אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מיליליטר והניחו אותו על קרח. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל כדור המכיל את המיטוכונדריה.יש לגדל מחדש את הכדור המיטוכונדריאלי ב-3.8 מיליליטרים של חיץ מניטול היפרטוני קר כקרח ולדגום את התרחיף המיטוכונדריאלי על קרח למשך 10 עד 15 דקות. מלאו את תרחיף המניטול ההיפרטוני המיטוכונדריאלי לתוך תא לחץ מיני מקורר של העיתונות הצרפתית. לאחר מכן, הניחו את התא על המכבש הצרפתי.לאחר מכן, בחר את המצב הנמוך של הלחיצה הצרפתית ודחס את המתלים דרך תא הלחץ הזעיר ב-110 על החוגה עבור המיטוכונדריה של השומן החום, ובשעה 140 עבור המיטוכונדריה של הלב, כדי להבטיח שהמתלים יוצאים מתא הלחץ הזעיר בקצב של כטיפה אחת לשנייה. אספו את הטיפות בצינור חרוטי מצונן קרח של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ההשעיה ב 10, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בצעו שימוש חוזר בכדור המיטופלסטים ב-0.5 עד 2 מיליליטרים של חיץ אשלגן כלוריד היפרטוני קר כקרח ואחסנו את התרחיף על קרח. משוך את חוטי הזכוכית הבורוסיליקטים ביום ההקלטה באמצעות מושך מיקרופיפט, וקבע תוכנית על המושך המשמש ליצירת פיפטות עם רמה גבוהה של יכולת שכפול. הכנס חוט זכוכית אחד בתוך המושך ומשך כדי להשיג כמעט שתי פיפטות טלאי זהות מחוט בורוסיליקט אחד.התאם את התוכנית כאשר פיפטות הופכות להיות לא עקביות בין מחזורי משיכה עקב הזדקנות של חוט תיבת החימום של המושך. מקם את הפיפטה בתוך מלטש הפיפטה והנח את הקצה ליד החוט מתחת להגדלה של פי 100 כדי לירות לוטש אותו. לחץ על דוושת כף הרגל מספר פעמים כדי לחמם את החוט מבלי לסתום או לפגוע בעקומת הקצה.פולנית עד פיפטות יש התנגדות בין 25 ל 35 megaohms מתקבלים כאשר מלא בתמיסת פיפטה מבוססת TMA. החלקות כיסוי טרום הדגירה עם 0.1% ג'לטין כדי להפחית את הידבקות המיטופלסטיקה ולשטוף אותן בתמיסת אמבט אשלגן כלוריד לפני הפקדת תרחיף המיטופלסט. הכינו דילול גולמי על ידי ערבוב של כ-35 מיקרוליטרים של תרחיף המיטופלסט המרוכז עם 500 מיקרוליטרים של תמיסת אמבט האשלגן כלוריד והניחו אותה על תלושי הכיסוי שהונחו בעבר בבאר של צלחת בעלת ארבע בארות.דגירה על קרח במשך 15 עד 20 דקות עבור mitoplasts כדי משקעים במורד החלקת הכיסוי. מלאו את תא האמבטיה לחלוטין בכ-50 מיקרוליטרים של תמיסת האמבטיה אשלגן כלורי והעבירו החלקת כיסוי עם מיטופלסטים בתוך התא באמצעות פינצטה מיקרו-דיסקטיבית דקה עם קצה כפוף. סדרו את החלקת הכיסוי בתחתית התא מבלי לחדור את התא כדי לשמור על יציבות המיטופלסטים על החלקת הכיסוי.בחר מיטופלסט בודד שאינו דבק על-ידי סריקת החלקת הכיסוי מתחת למיקרוסקופ עם מטרה של פי 60. טענו את הפיפטה בתמיסת הפיפטה והניחו אותה במחזיק הפיפטה. מביאים את הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור ומזיזים אותה ממש מעל המיטופלסט שנבחר כדי להתקרב ל-IMM.החזיקו את פוטנציאל הממברנה באפס מיליבולטים והחלו פולסים של 10 מיליוולט באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר. הפעילו לחץ שלילי קל כדי ליצור במהירות ג'יגאזאל עם ה-IMM. הרימו את הפיפטה עם המיטופלסט המחובר כדי להרחיק אותם מהחלקת הכיסוי כדי למנוע את שבירת האטמים עקב סחף פיפטה במהלך הניסוי.פצה את ארעי הקיבולים המשוטטים באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר לפני שתבדוק את תצורת המיטופלסט השלם כדי לקבל מדידת קיבוליות נכונה עבור קרום המיטופלסט לאחר הפריצה. החל פולסים של מתח קצר טווח עם תוכנית המגבר כדי לקרוע את מדבקת הממברנה מתחת לפיפטת הזכוכית ולהשיג את תצורת המיטולסט כולו. לאחר הפריצה, התאם את ארעי הקיבול עם אפשרות בדיקת הממברנה של תוכנית המגבר כדי להעריך את קיבוליות הממברנה ואת התנגדות הגישה שלה.מיד לאחר הפריצה, החליפו את תמיסת האמבטיה אשלגן כלורי בתמיסת אמבט HEPES באמצעות זלוף. החל פרוטוקול רמפה של 850 אלפיות השנייה עם תוכנית המגבר. יישום פרוטוקול רמפת המתח משרה זרם פרוטון בעל משרעת גדולה על פני ה- IMM של שומן חום ללא תוספת של חומצות שומן אקסוגניות, המפעילים הנדרשים של UCPs.לאחר זלוף על ידי מעכב UCP1 גואנוזין דיפוספט או 10-millimolar מתיל בטא ציקלודקסטרין עבור מיצוי חומצת שומן ממברנה אנדוגנית, הזרם השיורי משמש כדי לקבוע את המשרעת של זרמי UCP1, אשר נעלם לחלוטין ב- IMM של עכברים לקויי UCP1. בניגוד לשומן חום, ה-IMM של רקמות שאינן שומן, כגון שרירי השלד והלב, אינו מפתח זרם פרוטון הניתן למדידה מיד לאחר הפריצה. כדי לגרום לזרם פרוטונים הניתן למדידה באמצעות AAC, חיוני ליישם את תמיסת האמבטיה HEPES המכילה מיקרומולר אחד עד שני מיקרומולרי של חומצות שומן אקסוגניות.כדי לאשר כי זרם הפרוטון הנמדד נישא על ידי AAC, חשוב ליישם מעכבים ספציפיים, carboxyatractyloside, אשר מעכבים כמעט לחלוטין את זרם הפרוטונים המוצג ב- IMM של עכברים לקויי AAC1. עיכוב קבוע אך לעולם לא מלא של דליפת פרוטונים מושג רק כאשר ADP נמצא משני צידי הממברנה כדי ליצור חילופי נוקלאוטידים פעילים באמצעות AAC. איכות הכנת המיטופלסט תשפיע על שיעור ההצלחה בהשגת תצורת המיטופלסט השלם.זה חיוני כדי לייעל את זה. לאחר שהמנגנון המולקולרי של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מנותח בטכניקת מהדק הטלאי, מדידת צריכת החמצן המיטוכונדרית תדגים את החשיבות של זרם פרוטונים ותרמוגנזה במיטוכונדריה שלמה. טכניקה זו פותחת את הדרך לחוקרים לחקור כל מיני מוליכות, יונים ומטבוליטים החשובים לתפקוד המיטוכונדריה.

the-use-patch-clamp-technique-to-study-thermogenic-capacity

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

שיטה לבודד את שלפוחית ​​submitochondrial מועשרת במתחמי ה-ATP synthase F1FO ממוח חולדה מתוארת. שלפוחית ​​אלה מאפשרים מחקר של הפעילות של F1FO ATPase המורכב והאפנון שלה תוך שימוש בטכניקה של הקלטת תיקון מהדק.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

שיטה זו מנצלת את התרומה של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדרית לדליפת פרוטונים בהולכה נמוכה כדי לקבוע את סף המתח לפתיחת נקבוביות בעכברי תסמונת X שבירים בילודים עם תכולת קו-אנזים Q מיטוכונדריאלית מוגברת של קרדיומיוציטים בהשוואה לבקרת wildtype.

הערכה של הסתברות פתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית בהגדרה של עודף קו-אנזים Q

עכברים וחולדות מושתלים בניתוח במשדרי טמפרטורה מרוחקים ולאחר מכן מורגלים לסביבת הבדיקה ולהליך. שינויים בטמפרטורת השרירים נמדדים בתגובה לגירויים פרמקולוגיים או קונטקסטואליים בכלוב הביתי או במהלך פעילות גופנית שנקבעה (כלומר, הליכה על הליכון במהירות קבועה).

מדידת תרמוגנזה של שרירי השלד בעכברים ובחולדות

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לכימות המשמעות הפיזיולוגית של השפעת פעילות רקמת השומן החום (BAT) על חילוף החומרים האנושי. זה מושג על ידי שילוב העמסת פחמימות וקלורימטריה עקיפה עם מדידות של שינויים supraclavicular בטמפרטורה. גישה חדשנית זו יכולה לסייע בפיתוח יעד פרמקולוגי לתרמוגנזה BAT בבני אדם.

שימוש בשילוב של קלורימטריה עקיפה, תרמוגרפיה אינפרא אדומה ורמות גלוקוז בדם כדי למדוד תרמוגנזה של רקמת שומן חום בבני אדם

פרוטוקול זה מפרט שיטה למדידה ישירה של פעילות תעלות יונים על שלפוחיות תוך תאיות באמצעות מערכת מהדק טלאי אנדוליזוזומלי ידנית. אנו מדגימים את השיטה הכוללת הגדלת אנדוליזוזומים ובידוד ידני של שלפוחיות אלה. גישה זו מבטיחה שחוקרים יוכלו לשכפל וליישם במדויק את ההליך.

טכניקות Patch-Clamp לניתוח שלפוחית אנדוליזוזומלית בודדת

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

חקור את יכולת ההפקת החום של המיטוכונדריה באמצעות טכניקת המהדק טלאי למדידת דליפת פרוטונים. שיטה זו מאפשרת לזהות מנגנונים מולקולריים ולחקור מוליכויות נוספות כגון סידן ונוקלאוטידי אדנין.

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

גלה סרטונים נוספים