השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בטכניקת מהדק המדבקה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה על ידי מדידה ישירה של דליפת פרוטונים מיטוכונדריאליים על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי. המדידה הישירה של זרם הפרוטון דרך הממברנה המיטוכונדרית הפנימית מסייעת לזהות ולאפיין במדויק את המנגנונים המולקולריים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. טכניקה זו מאפשרת לא רק למדוד את זרם הפרוטונים על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית, אלא גם לחקור מוליכונדרים אחרים החשובים לתפקוד המיטוכונדריה, כגון סידן או מטבוליטים כמו נוקלאוטידים אדנין.

מקם את העכבר המתת מורדם על גבו ומרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער. לאחר מכן, בצע חתך של שני סנטימטרים על בית החזה. לאחר שתפסו את העור בפינצטה, נתחו את הלב מהחזה של החיה ושטפו אותו כדי להסיר את כל הדם לכוס של 10 מיליליטר עם חמישה מיליליטרים של תמיסת בידוד קר.

לאחר שהלב נוקה מעקבות של דם, העבירו אותו לכוס אחרת של 10 מיליליטר שהכילה חמישה מיליליטרים של מאגר בידוד קר וקיצצו אותו לחתיכות דקות. לאחר מכן, העבירו אותו להומוגנייזר זכוכית 10 מיליליטר מקורר קרח. השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניזציה של הרקמה החתוכה על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים בדקה.

מעבירים את ההומוגנאט לצינור חרוטי קר כקרח של 15 מיליליטר וצנטריפוגות אותו ב-700 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לכדור את הגרעינים והתאים הלא שבורים. אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מיליליטר והניחו אותו על קרח. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל כדור המכיל את המיטוכונדריה.

יש לגדל מחדש את הכדור המיטוכונדריאלי ב-3.8 מיליליטרים של חיץ מניטול היפרטוני קר כקרח ולדגום את התרחיף המיטוכונדריאלי על קרח למשך 10 עד 15 דקות. מלאו את תרחיף המניטול ההיפרטוני המיטוכונדריאלי לתוך תא לחץ מיני מקורר של העיתונות הצרפתית. לאחר מכן, הניחו את התא על המכבש הצרפתי.

לאחר מכן, בחר את המצב הנמוך של הלחיצה הצרפתית ודחס את המתלים דרך תא הלחץ הזעיר ב-110 על החוגה עבור המיטוכונדריה של השומן החום, ובשעה 140 עבור המיטוכונדריה של הלב, כדי להבטיח שהמתלים יוצאים מתא הלחץ הזעיר בקצב של כטיפה אחת לשנייה. אספו את הטיפות בצינור חרוטי מצונן קרח של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ההשעיה ב 10, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בצעו שימוש חוזר בכדור המיטופלסטים ב-0.5 עד 2 מיליליטרים של חיץ אשלגן כלוריד היפרטוני קר כקרח ואחסנו את התרחיף על קרח. משוך את חוטי הזכוכית הבורוסיליקטים ביום ההקלטה באמצעות מושך מיקרופיפט, וקבע תוכנית על המושך המשמש ליצירת פיפטות עם רמה גבוהה של יכולת שכפול. הכנס חוט זכוכית אחד בתוך המושך ומשך כדי להשיג כמעט שתי פיפטות טלאי זהות מחוט בורוסיליקט אחד.

התאם את התוכנית כאשר פיפטות הופכות להיות לא עקביות בין מחזורי משיכה עקב הזדקנות של חוט תיבת החימום של המושך. מקם את הפיפטה בתוך מלטש הפיפטה והנח את הקצה ליד החוט מתחת להגדלה של פי 100 כדי לירות לוטש אותו. לחץ על דוושת כף הרגל מספר פעמים כדי לחמם את החוט מבלי לסתום או לפגוע בעקומת הקצה.

פולנית עד פיפטות יש התנגדות בין 25 ל 35 megaohms מתקבלים כאשר מלא בתמיסת פיפטה מבוססת TMA. החלקות כיסוי טרום הדגירה עם 0.1% ג'לטין כדי להפחית את הידבקות המיטופלסטיקה ולשטוף אותן בתמיסת אמבט אשלגן כלוריד לפני הפקדת תרחיף המיטופלסט. הכינו דילול גולמי על ידי ערבוב של כ-35 מיקרוליטרים של תרחיף המיטופלסט המרוכז עם 500 מיקרוליטרים של תמיסת אמבט האשלגן כלוריד והניחו אותה על תלושי הכיסוי שהונחו בעבר בבאר של צלחת בעלת ארבע בארות.

דגירה על קרח במשך 15 עד 20 דקות עבור mitoplasts כדי משקעים במורד החלקת הכיסוי. מלאו את תא האמבטיה לחלוטין בכ-50 מיקרוליטרים של תמיסת האמבטיה אשלגן כלורי והעבירו החלקת כיסוי עם מיטופלסטים בתוך התא באמצעות פינצטה מיקרו-דיסקטיבית דקה עם קצה כפוף. סדרו את החלקת הכיסוי בתחתית התא מבלי לחדור את התא כדי לשמור על יציבות המיטופלסטים על החלקת הכיסוי.

בחר מיטופלסט בודד שאינו דבק על-ידי סריקת החלקת הכיסוי מתחת למיקרוסקופ עם מטרה של פי 60. טענו את הפיפטה בתמיסת הפיפטה והניחו אותה במחזיק הפיפטה. מביאים את הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור ומזיזים אותה ממש מעל המיטופלסט שנבחר כדי להתקרב ל-IMM.

החזיקו את פוטנציאל הממברנה באפס מיליבולטים והחלו פולסים של 10 מיליוולט באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר. הפעילו לחץ שלילי קל כדי ליצור במהירות ג'יגאזאל עם ה-IMM. הרימו את הפיפטה עם המיטופלסט המחובר כדי להרחיק אותם מהחלקת הכיסוי כדי למנוע את שבירת האטמים עקב סחף פיפטה במהלך הניסוי.

פצה את ארעי הקיבולים המשוטטים באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר לפני שתבדוק את תצורת המיטופלסט השלם כדי לקבל מדידת קיבוליות נכונה עבור קרום המיטופלסט לאחר הפריצה. החל פולסים של מתח קצר טווח עם תוכנית המגבר כדי לקרוע את מדבקת הממברנה מתחת לפיפטת הזכוכית ולהשיג את תצורת המיטולסט כולו. לאחר הפריצה, התאם את ארעי הקיבול עם אפשרות בדיקת הממברנה של תוכנית המגבר כדי להעריך את קיבוליות הממברנה ואת התנגדות הגישה שלה.

מיד לאחר הפריצה, החליפו את תמיסת האמבטיה אשלגן כלורי בתמיסת אמבט HEPES באמצעות זלוף. החל פרוטוקול רמפה של 850 אלפיות השנייה עם תוכנית המגבר. יישום פרוטוקול רמפת המתח משרה זרם פרוטון בעל משרעת גדולה על פני ה- IMM של שומן חום ללא תוספת של חומצות שומן אקסוגניות, המפעילים הנדרשים של UCPs.

לאחר זלוף על ידי מעכב UCP1 גואנוזין דיפוספט או 10-millimolar מתיל בטא ציקלודקסטרין עבור מיצוי חומצת שומן ממברנה אנדוגנית, הזרם השיורי משמש כדי לקבוע את המשרעת של זרמי UCP1, אשר נעלם לחלוטין ב- IMM של עכברים לקויי UCP1. בניגוד לשומן חום, ה-IMM של רקמות שאינן שומן, כגון שרירי השלד והלב, אינו מפתח זרם פרוטון הניתן למדידה מיד לאחר הפריצה. כדי לגרום לזרם פרוטונים הניתן למדידה באמצעות AAC, חיוני ליישם את תמיסת האמבטיה HEPES המכילה מיקרומולר אחד עד שני מיקרומולרי של חומצות שומן אקסוגניות.

כדי לאשר כי זרם הפרוטון הנמדד נישא על ידי AAC, חשוב ליישם מעכבים ספציפיים, carboxyatractyloside, אשר מעכבים כמעט לחלוטין את זרם הפרוטונים המוצג ב- IMM של עכברים לקויי AAC1. עיכוב קבוע אך לעולם לא מלא של דליפת פרוטונים מושג רק כאשר ADP נמצא משני צידי הממברנה כדי ליצור חילופי נוקלאוטידים פעילים באמצעות AAC. איכות הכנת המיטופלסט תשפיע על שיעור ההצלחה בהשגת תצורת המיטופלסט השלם.

זה חיוני כדי לייעל את זה. לאחר שהמנגנון המולקולרי של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מנותח בטכניקת מהדק הטלאי, מדידת צריכת החמצן המיטוכונדרית תדגים את החשיבות של זרם פרוטונים ותרמוגנזה במיטוכונדריה שלמה. טכניקה זו פותחת את הדרך לחוקרים לחקור כל מיני מוליכות, יונים ומטבוליטים החשובים לתפקוד המיטוכונדריה.