צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים
30 ביוני 2021
מאמר זה נועד להציג פרוטוקול להכנת אנדוזומים למיחזור מתאי יונקים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית של צפיפות סוכרוז.
פרוטוקול זה מסייע בבידוד אנדוזומים למיחזור המכילים שברים מתאי יונקים שהודבקו כדי להקל על החקירה של סחר בחלבון באמצעות סחר אנדוציטי. טכניקה זו קלה לטיפול וישימה הן רקמות והן דגימות תא. מדגים את ההליך יהיה מיס Zhai יו צ'י, דוקטורנט מהמעבדה של ד"ר לאו.
בתור התחלה, צלחת 2 כפול 10 עד 6 תאים בצלחת תרבית 100 מ"מ. למחרת, להעביר את התאים עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן. כדי לקצור את התאים, להשליך את המדיום התרבותי 48 שעות לאחר transfection ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח.
לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר כקרח בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 0.5X בקוקטייל מעכב פוספטאז 0.5X לכל מנה. לאחר מכן, באמצעות מגרד תאים, לאסוף את התאים ולהעביר את השעיית התא לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי נדנדה.
השליכו את הסופר-נט וחידשו את גלולה התא בעדינות בחמישה מיליליטרים של חוצץ הומוגניזציה. לאסוף את התאים שוב על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה התא במיליליטר אחד של חוצץ הומוגניזציה. הומוגניזציה התאים עם הומוגניזר Dounce באמצעות 15 עד 20 משיכות.
ואז להעביר את homogonate לצינור צנטריפוגה שני מיליליטר. הוסף 700 מיקרוליטרים של חוצץ הומוגניזציה להומוגונאט. ואז לסובב את homogonate מדולל ולאסוף 1.5 מיליליטר של supernatant.
לסובב את supernatant שנאסף שוב, ולאחר מכן לאסוף 1.4 מיליליטר של supernatant ולתייג אותו כמו לאחר גרעינית-על-טבעי. כדי להכין את עמודת שיפוע הצפיפות, העבר 1.2 מיליליטר של supernatant פוסט גרעיני לצינור אולטרה צנטריפוגה. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של 62% תמיסת סוכרוז לדגימה ולערבב היטב על ידי pipetting עדין.
לאחר מכן, בזהירות להוסיף 3.3 מיליליטר של 35% תמיסת סוכרוז על גבי המדגם, ואחריו 2.2 מיליליטר של 25% תמיסת סוכרוז על גבי פתרון 35%סוכרוז. לבסוף, מלא את צינור ultracentrifuge למעלה עם חוצץ הומוגניזציה. צנטריפוגה את עמודת מעבר הצבע של הצפיפות ואסוף בזהירות 12 שברים של 1 מיליליטר כל אחד, החל מהחלק העליון של מעבר הצבע.
לאחר מכן, לדלל את כל השברים עם מיליליטר אחד של חוצץ דילול וצנטריפוגה הדגימות מדולל. לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant ולהוסיף 50 microliters של חוצץ מדגם 1X כדי לקצור את השברים. סמן המיחזור הסוף Rab11 זוהה בשבריר שבע.
סמנים תת-תאיים אחרים, כולל בטא COP, COX IV, GAPDH, EEA1, ראב 7, ו Lamp1 נחקרו גם הם. אות EEA1 חיובי זוהה גם בשבר שבע. עוצמות הרצועה הנמדדות של GAPDH, קוקס 4 ו-Rab11 הן בשבר שבע והן בסופר-נטאנט הפוסט-גרעיני מוצגות כאן.
לאחר חוצה תאי HEC293 עם ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L, או ELMO1 ARF6Q67L FE65, לא נמצאו שינויים בהפצת ELMO1 עם ביטוי יתר ARF6Q67L ו- FE65. רמת ELMO1 בשבר שבע הושוותה בין transfections שונים ונמצאה מוגבהת לאחר cotransfection של ARF6Q67L. עלייה נוספת נצפתה כאשר הן ARF6Q67L והן FE65 התבטאו במשותף.
לעומת זאת, נוקאאוט FE65 צמצם את העשרת ELmo1 בתיווך ARF6 בשבריר שבע. השבר שהושג יכול לשמש לניתוח הבא. לדוגמה, סופג מערבי כדי לדמיין שינויים ברמת החלבון בשבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת אנדוזומי מיחזור (recycling endosomes) מתאי יונקים באמצעות אולטראצנטריפוגציה במדרג צפיפות של סוכרוז. טכניקה זו נועדה להקל על חקירת תעבורת חלבונים דרך מסלולים אנדוציטוטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אנדוציטוזה
- תעתוק חלבונים
רקע
- אנדוזומים מחזרים (Recycling endosomes) ממלאים תפקיד מכריע בתעבורה התאית.
- הבנת תעבורת חלבונים חיונית להשגת תובנות לגבי תהליכים תאיים שונים.
- סנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגית (Ultracentrifugation) היא טכניקה נפוצה לבידוד רכיבים תאיים.
- פרוטוקול זה רלוונטי הן לדגימות רקמה והן לדגימות תאים.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה לבידוד אנדוזומים ממוחזרים (recycling endosomes).
- שיפור ההבנה של מנגנוני תעתוע אנדוציטוטים.
- תמיכה במחקרים עתידיים בדינמיקה של חלבונים בתוך תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאי יונקים באמצעות Lipofectamine.
- קציר תאים 48 שעות לאחר הטרנספקציה.
- שטיפת תאים ב-PBS קר (בטמפרטורת קרח).
- שימוש באולטרצנטריפוגציה במדרג צפיפות של סוכרוז לצורך בידוד.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אנדוזומים למחזור (recycling endosomes) מתאיםים שעברו טרנספקציה.
- הדגמת הפרוטוקול על ידי סטודנט לדוקטורט.
- סיוע למחקרים נוספים על תעתוק חלבונים.
- תיקוף של ישימות השיטה לסוגי דגימות שונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה פשוטה לבידוד אנדוזומים מחזירים (recycling endosomes).
- הוא צפוי לסייע בהבנת תעתוע חלבונים.
- שיטה זו יכולה לשמש בהקשרי מחקר ביולוגיים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד אנדוזומים למחזור (recycling endosomes) מאפשר הפחתת סיכונים מכנית של מטרות להובלה אנדוציטית על ידי אספקת נתונים כמותיים של פרקציונציה תת-תאית. דבר זה תומך בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות עבור חלבונים המווסתים מחזור של חלבוני ממבנה, כגון אפקטורים של ARF6. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי קישור מיקום החלבון למסלולי מחזור תפקודיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות לגבי רגולטורים של מחזור אנדוציטוטי כגון ARF6 ו-ELMO1.
- ערך תפעולי: מספק נתוני פרקציונציה להבהרת מנגנוני תעבורת חלבונים ספציפיים למסלולים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי תיקוף מעורבות המטרה בפרקציות של אנדוזומים מחזירים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת פרקציות מאוששות המכילות אנדוזומים של מיחזור לצורך ניתוח Western blot בהמשך.
- ערך תפעולי: מאפשר בידוד סטנדרטי וניתן לשחזור של אבייורים למדידה כמותית של חלבונים.
- ערך מדעי: מסייע למוכנות הבדיקה לסריקת תרכובות המווסתות מיחזור אנדוציטוטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר נתונים על תעתוע (trafficking) משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות בידוד של פרקציית Rab11-positive.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות משלב הפרקציונציה התת-תאית ועד לאישור פונקציונלי במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך מדעי: תומך בקידום מבוסס ניהול סיכונים על ידי אישור מיקום המטרה במסלולי מיחזור.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי בידוד של פракציות תת-תאיות, המספקות מידע התומך בהחלטות של תיקוף מטרה וזיהוי מובילים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי רגולטורים של מיחזור אנדוציטוטית באמצעות פרקציונציה ואנליזת סמנים.
- סריקה: מאפשר פיתוח של בדיקות באמצעות בידוד סטנדרטי של פרקציות חיוביות ל-Rab11 לצורך כימות חלבונים.
- אנליטיקה: מייצר תוצאות כמותיות של Western blot מפרקציות כדי להשוות העשרה של חלבונים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני פרקציונציה לרציפות פרה-קלינית באמצעות תיקוף של בידוד אנדוזומים של מיחזור.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פלטפורמה לשימוש חוזר עבור פרקציונציה תת-תאית בפרויקטים מרובים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי הובלה (trafficking).
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות ויכולת הרחבה של בידוד אברונים לצורך ניתוחים עקביים בהמשך התהליך.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) באמצעות אספקת נתוני לוקליזציה תת-תאית למטרות במסלול מיחזור.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על נתוני העשרה של אנדוזומים למחזור.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של תרבית תאים, טרנספקציה ואולטרה-צנטריפוגציה.
- תלוי בגישה לרוטורים מסוג swinging bucket ולאולטרה-צנטריפוגות לצורך הפרדה באמצעות מדרג צפיפות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הפרקציה בין צוותים שונים כדי להבטיח בידוד השוואתי של פרקציית Rab11.
- דורש התאמה של פאנלים של מרקרים (למשל, Rab11, EEA1) עבור סוגי תאים שונים או מסלולי תעתוע שונים.
- מוגבל על ידי הצורך במרקרי אימות כדי לאשר את טוהר הפרקציה לפני יישומים המשכיים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
