Name: צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: למדו איך להכין אנדוזומים ממוחזרים מתאי יונקים באמצעות צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני תנועת חלבונים בנתיבי אנדוציטוזה ומסייעת להבנת תהליכים תאיים חיוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממועצת מענקי המחקר בהונג קונג, תוכנית המענקים הישירים של CUHK, קרן ההקדש של מכללת יונייטד וקרן הצדקה TUYF. הנתונים בעבודה זו הותאמו מהפרסום הקודם שלנו, "ARF6-Rac1 איתות-תיווך נורייט גדל הוא potentiated על ידי מתאם עצבי FE65 באמצעות תזמור ARF6 ו ELMO1" שפורסם בכתב העת FASEB באוקטובר 2020.

1. תרבית תאים של יונקים וזיהוי
<ol><li>צלחת 2 x 106 תאים בצלחת תרבית 100 מ"מ. השתמש בארבע מנות עבור כל transfection. הערה: מספר התאים הנדרשים עשוי להשתנות עבור שורות תאים שונות. ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה לפני שתמשיך לשלב הבידוד.</li>
	<li>למחרת, להעביר את התאים עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן.</li>
</ol>2. קציר תאים
<ol><li>השלך את המדיום התרבותי 48 שעות לאחר טרנספקט.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח (10 mM נתרן פוספטים, 2.68 mM אשלגן כלורי, 140 mM נתרן כלורי) פעמיים.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח+ (PBS בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 0.5x וקוקטייל מעכב פוספטאז 0.5x) לכל מנה.</li>
	<li>לאסוף את התאים עם מגרד תא ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.</li>
	<li>גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי נדנדה ב 400 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנט והדביקו מחדש את גלולה התא בעדינות ב-5 מ"ל של חוצץ הומוגניזציה (HB; 250 מ"מ סוכרוז, 3 מ"מ imidazole ב-pH 7.4, 1 mM EDTA בתוספת 0.03 מ"מ cycloheximide, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x וקוקטייל מעכב פוספטאז 1x).</li>
	<li>לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1,300 x g במשך 10 דקות.</li>
	<li>resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של HB.</li>
	<li>הומוגניזציה התאים עם הומוגניזר Dounce עבור 15-20 משיכות. הערה: שיטות הומוגניזציה אחרות, למשל, העברת המדגם דרך מזרק, ניתן להשתמש. יעילות ההומוגניזציה יכולה להתגלות על ידי התבוננות בהומוגנט תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.</li>
	<li>מעבירים את ההומוגנית לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל. הערה: קציר 50 μL של הומוגניאט עם 12.5 μL של 5x מאגר מדגם ולתייג אותו כמו ליסייט הכולל.</li>
	<li>הוסף 0.7 מ"ל של HB להומוגניט.</li>
	<li>סובב את ההומוגנאט מדולל ב 2,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). הערה: הכדור מכיל גרעינים ותאים רצוף.</li>
	<li>לאסוף 1.5 מ"ל של supernatant ולחזור על שלב 2.12 פעם אחת.</li>
	<li>לאסוף 1.4 מ"ל של supernatant ולתייג אותו כמו לאחר גרעין supernatant (PNS).</li>
</ol>3. הכנת עמודות הדרגתיות בצפיפות
<ol><li>העבר 1.2 מ"ל של PNS לצינור אולטרה צנטריפוגה.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל לתמיסת סוכרוז 62% (2.351 M סוכרוז, 3 מ"מ imidazole ב- pH 7.4) וערבבו היטב על ידי צנרת עדינה. הערה: הפתרון המתקבל הוא פתרון סוכרוז של 40.6%.</li>
	<li>הוסף 3.3 מ"ל של פתרון סוכרוז 35% (1.177 M סוכרוז, 3 mM imidazole ב pH 7.4) בזהירות על גבי המדגם.</li>
	<li>הוסף 2.2 מ"ל של 25% תמיסה סוכרוז (0.806 M סוכרוז, 3 mM imidazole ב pH 7.4) בזהירות על גבי פתרון 35% סוכרוז. הערה: המדד השבירה של 62%, 40.6%, 35% ו-25% פתרונות סוכרוז בטמפרטורת החדר הם 1.44, 1.40, 1.39 ו-1.37, בהתאמה. ניתן לבדוק את האינדקסים השבירה של פתרונות הסורוז עם שבירה כדי להבטיח את הדיוק והעקביות של הניסוי.</li>
	<li>מלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה ב-HB. הערה: אחסן באופן זמני את עמודת מעבר הצבע של הצפיפות המוכנה ב- 4 °C (70 °F).</li>
</ol>4. שבר והתאוששות של שבר המכיל אנדוזום מיחזור
<ol><li>צנטריפוגות את העמודה ב 210,000 x g עבור 3 שעות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>אסוף 12 שברים (1 מ"ל כל אחד) בזהירות, החל מראש מעבר הצבע. הערה: יש למצוא את אנדוזומים המיחזור בממשק בין 35% ל -25% פתרונות סוכרוז. השברים שנאספו יכולים להיות קפואים בחנקן נוזלי ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לדלל את כל השברים עם 1 מ"ל של חוצץ דילול (3 mM imidazole ב pH 7.4, 1 mM EDTA).</li>
	<li>צנטריפוגה מדגם מדולל ב 100,000 x גרם עבור 1 שעה ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>שאפו את supernatant ולהוסיף 50 μL של חוצץ מדגם 1x כדי לקצור את השברים.</li>
	<li>לנתח את תכולת החלבון בשברים על ידי סופג מערבי.</li>
</ol>

<ol><li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiener+Medizinische+Wochenschrift%22%5BJournal%5D)">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li>
<li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li>
<li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li>
<li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li>
<li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li>
<li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).</li>
<li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).</li>
<li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement%2C+cell+division+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li>
<li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).</li>
<li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li>
<li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils%3A+impact+on+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).</li>
<li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DOCK180%2FElmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li>
<li>Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWibo%2C+M+%22Eukaryotic+Cell+Function+and+Growth%3A+Regulation+by+Intracellular+Cyclic+Nucleotides%22">Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides</a>. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).</li>
<li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li>
<li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics%3A+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li>
<li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li>
<li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li>
<li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in%3A+fractionation+strategies+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li>
<li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li>
<li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li>
<li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+specialized%2C+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li>
<li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li>
<li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimaraes+de+Araujo%2C+ME+%22Endocytic+Organelles%3A+Methods+For+Preparation+And+Analysis.+In+eLS%22">Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).</li>
<li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRickwood%2C+D+%22Centrifugation+Techniques%22">Centrifugation Techniques</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li>
<li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes%3A+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים עם תוכן מאמר זה.

הפרוטוקול לעיל מתאר את הנהלים לבידוד אנדוזומים של מיחזור תרבית על-ידי אולטרה-צנטריפוגה. האמינות של שיטה זו הוכח על ידי הפרסום האחרון22, המוכיח כי מיחזור אנדוזומים מבודדים בהצלחה אברונים אחרים (איור 1), כגון מנגנון Golgi ומיטוכונדריה. יש לשים לב לכמה צעדים קריטיים להשגת תוצאת הפרדה טובה. בעת הכנת פתרונות סוכרוז, מומלץ לאמת את אינדקסי השבירה של הפתרונות עם שבירה. המדד השבירה של פתרונות הסורוז 62%, 35% ו-25% בטמפרטורת החדר הם 1.44, 1.39 ו-1.37, בהתאמה. כמו כן, יש להימנע ...

סחר אנדוסומלי הוא תהליך פיזיולוגי חיוני המסבך אירועים ביולוגיים שונים1, למשל, הובלה של קולטני איתות, תעלות יונים ומולקולות הידבקות. חלבונים מקומיים בקרום הפלזמה מופנמים על ידי אנדוציטוזיס2. החלבונים המופנמים ממוינים לאחר מכן על ידי אנדוזום מוקדם3. חלק מהחלבונים מיועדים ליזוזומים להשפלה4. עם זאת, כמות משמעותית של חלבונים ממוחזרים בחזרה לפני השטח של התא על ידי מיחזור מהיר ותהליכי מיחזור איטיים. במיחזור מהיר, חלבונים לעזוב את אנדוזומים המוקדמים ולחזור ישירות קרום הפלזמה. לעומת זאת, במיחזור איטי, חלבונים ממוינים תחילה לתא המיחזור האנדיוציטי ולאחר מכן מועברים בחזרה לקרום הפלזמה. חלבוני מטען שונים, למשל, קלתרין, קומפלקס רטרומר, קומפלקס רטריבר וחלבון תסמונת ויסקוט-אולדריץ ', ותסביך SCAR Homologue (WASH), משתתפים בתהליכי מיחזור ממברנה כאלה4,5,6,7,8,9. האיזון של אירוע אנדוציטוזיס ומיחזור הוא חיוני להישרדות התא ותורם לאירועים תאיים שונים10, למשל, הידבקות תאים, נדידת תאים, קוטביות התא, טרנסדוקציה של אותות.
ARF6, GTPase קטן, הוא רגולטור דיווח של סחר אנדוציטי7,11,12. מעניין, קבוצות מחקר שונות המחישו את החשיבות של ARF6 במיחזור אנדוציטי13,14,15,16,17. מטרת המחקר היא לחקור את הקשר בין תולדת הנויריט בתיווך ARF6 לבין מיחזור אנדוציטי. הדו"ח הקודם מציע כי ההפעלה של ARF6 היא במעלה הזרם לפעילות Rac1 באמצעות פועל על ELMO1-dedicator של ציטוקינזיס 1 (DOCK180)קומפלקס 18. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד ARF6 מפעיל את איתות Rac1 המתווך של ELMO1-DOCK180. צפיפות הדרגתית אולטרה צנטריפוגה הועסק כדי לחקור את התפקיד של ARF6 בתיווך מיחזור אנדוציטי בתהליך כזה. באמצעות זה, השבר המכיל אנדוזום מיחזור הושג מ lysates התא19. השבר היה נתון לכתמים מערביים לניתוח תכולת חלבון. תוצאות החיסון חשפו כי תחת נוכחותו של FE65, חלבון מתאם מועשר במוח, ARF6 פעיל הגדיל באופן משמעותי את רמת ELMO1 בשבר המכיל אנדוזום מיחזור. הפרוטוקול הבא כולל את הנהלים ל(1) תאים יונקים; (2) הכנת הדגימות ועמודות מעבר צבע בצפיפות; ות (3) קבלת השבר המכיל אנדוזום למיחזור.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל, צינור פוליפרופילן בעל דופן עבה פתוחה, 11 x 34 מ"מ</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 100 מ"מ</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13.2 מ"ל, צינור Ultra-Clear ללא אישור פתוח, 14 x 89 מ"מ</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Sample Buffer</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11)</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> ארנב <td>mAb 4850S</td><td>נוגדן חד שבטי ארנב לזיהוי COX IV.</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Dounce, 7 מ"ל</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם נוגדן</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 נמוך (B-7)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר לזיהוי ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 נוגדן (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>נוגדן רב-שבטי עז לזיהוי FE65.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, HyClone בדרגת מחקר</td><td></td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH נוגדן חד שבטי (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר לזיהוי GAPDH.</td></tr><tr><td>תוכנת ImageLab</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>מדידת עוצמת הלהקה</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי נגד &beta;-COP חד שבטי</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר לזיהוי &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) עכבר mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2276S</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר לזיהוי חלבונים מתויגים myc.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, מלח דיסודיום, דיהידראט</td><td>קלביוכם</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה L-100 XP</td><td>בקמן קולטר</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה MAX-TL</td><td>בקמן קולטר</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>אופטי-MEM I סרום מופחת</td><td>מדיה Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS טבליות</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>נוגדן פוליקלונלי ספציפי ל-RAB11A</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>נוגדן רב-שבטי ארנב לזיהוי Rab11.</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>אפימטריקס</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti רוטור דלי מתנדנד</td><td>בקמן קולטר</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 רוטור זווית קבועה</td><td>בקמן קולטר</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

סחר אנדוסומלי הוא תהליך תאי חיוני המסדיר מגוון רחב של אירועים ביולוגיים. חלבונים מופנמים מקרום הפלזמה ולאחר מכן מועברים לאנדוזומים המוקדמים. החלבונים המופנמים יכולים להיות מועברים ליזוזום להשפלה או ממוחזר בחזרה לקרום הפלזמה. מסלול מיחזור אנדוציטי חזק נדרש כדי לאזן את הסרת חומרי הממברנה מאנדוציטוזיס. חלבונים שונים מדווחים כדי לווסת את המסלול, כולל גורם ADP-ריבוסילציה 6 (ARF6). אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות היא שיטה קלאסית לפירוק תאים. לאחר הצנטריפוגה, אברונים הם משקעים על פני השטח האיזופקניים שלהם. השברים נאספים ומשמשים עבור יישומים אחרים במורד הזרם. מתואר כאן פרוטוקול להשגת שבר המכיל אנדוזום ממחזור מתאי יונקים שהודבקו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות. השברים המבודדים היו נתונים לכתמים מערביים סטנדרטיים לניתוח תכולת החלבון שלהם. על ידי שימוש בשיטה זו, זיהינו כי מיקוד קרום הפלזמה של בלוע תנועתיות תא 1 (ELMO1), מצע רעלן בוטולינום C3 הקשורים לראס 1 (Rac1) גורם החלפת נוקלאוטידים גואנין, הוא באמצעות מיחזור אנדוציטי בתיווך ARF6.

לאחר פירוק תאי HEK293 הלא נגועים על-ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, נאספו 12 שברים החל מראש מעבר הצבע. השברים שנקטפו דוללו עם מאגר הדילול ביחס של 1:1 ונחשפו לסיבוב שני של צנטריפוגה. הדגימות היו נתונות אז סופג מערבי לניתוח תכולת החלבון שלהם. כפי שמוצג באיור 1, סמן המיחזור של Rab11 מזוהה בשבר 720. סמנים תת-תאיים אחרים, כולל β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 ו- Lamp1, נחקרו גם הם. אות EEA1 חיובי מזוהה גם בשבר 7. עוצמות הרצועה של GAPDH, COX IV ו- Rab11 הן בשבר 7 וה...

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול להכנת אנדוזומים למיחזור מתאי יונקים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית של צפיפות סוכרוז.

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

פרוטוקול זה מסייע בבידוד אנדוזומים למיחזור המכילים שברים מתאי יונקים שהודבקו כדי להקל על החקירה של סחר בחלבון באמצעות סחר אנדוציטי. טכניקה זו קלה לטיפול וישימה הן רקמות והן דגימות תא. מדגים את ההליך יהיה מיס Zhai יו צ'י, דוקטורנט מהמעבדה של ד"ר לאו.בתור התחלה, צלחת 2 כפול 10 עד 6 תאים בצלחת תרבית 100 מ"מ. למחרת, להעביר את התאים עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן. כדי לקצור את התאים, להשליך את המדיום התרבותי 48 שעות לאחר transfection ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח.לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר כקרח בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 0.5X בקוקטייל מעכב פוספטאז 0.5X לכל מנה. לאחר מכן, באמצעות מגרד תאים, לאסוף את התאים ולהעביר את השעיית התא לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי נדנדה.השליכו את הסופר-נט וחידשו את גלולה התא בעדינות בחמישה מיליליטרים של חוצץ הומוגניזציה. לאסוף את התאים שוב על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה התא במיליליטר אחד של חוצץ הומוגניזציה. הומוגניזציה התאים עם הומוגניזר Dounce באמצעות 15 עד 20 משיכות.ואז להעביר את homogonate לצינור צנטריפוגה שני מיליליטר. הוסף 700 מיקרוליטרים של חוצץ הומוגניזציה להומוגונאט. ואז לסובב את homogonate מדולל ולאסוף 1.5 מיליליטר של supernatant.לסובב את supernatant שנאסף שוב, ולאחר מכן לאסוף 1.4 מיליליטר של supernatant ולתייג אותו כמו לאחר גרעינית-על-טבעי. כדי להכין את עמודת שיפוע הצפיפות, העבר 1.2 מיליליטר של supernatant פוסט גרעיני לצינור אולטרה צנטריפוגה. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של 62% תמיסת סוכרוז לדגימה ולערבב היטב על ידי pipetting עדין.לאחר מכן, בזהירות להוסיף 3.3 מיליליטר של 35% תמיסת סוכרוז על גבי המדגם, ואחריו 2.2 מיליליטר של 25% תמיסת סוכרוז על גבי פתרון 35%סוכרוז. לבסוף, מלא את צינור ultracentrifuge למעלה עם חוצץ הומוגניזציה. צנטריפוגה את עמודת מעבר הצבע של הצפיפות ואסוף בזהירות 12 שברים של 1 מיליליטר כל אחד, החל מהחלק העליון של מעבר הצבע.לאחר מכן, לדלל את כל השברים עם מיליליטר אחד של חוצץ דילול וצנטריפוגה הדגימות מדולל. לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant ולהוסיף 50 microliters של חוצץ מדגם 1X כדי לקצור את השברים. סמן המיחזור הסוף Rab11 זוהה בשבריר שבע.סמנים תת-תאיים אחרים, כולל בטא COP, COX IV, GAPDH, EEA1, ראב 7, ו Lamp1 נחקרו גם הם. אות EEA1 חיובי זוהה גם בשבר שבע. עוצמות הרצועה הנמדדות של GAPDH, קוקס 4 ו-Rab11 הן בשבר שבע והן בסופר-נטאנט הפוסט-גרעיני מוצגות כאן.לאחר חוצה תאי HEC293 עם ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L, או ELMO1 ARF6Q67L FE65, לא נמצאו שינויים בהפצת ELMO1 עם ביטוי יתר ARF6Q67L ו- FE65. רמת ELMO1 בשבר שבע הושוותה בין transfections שונים ונמצאה מוגבהת לאחר cotransfection של ARF6Q67L. עלייה נוספת נצפתה כאשר הן ARF6Q67L והן FE65 התבטאו במשותף.לעומת זאת, נוקאאוט FE65 צמצם את העשרת ELmo1 בתיווך ARF6 בשבריר שבע. השבר שהושג יכול לשמש לניתוח הבא. לדוגמה, סופג מערבי כדי לדמיין שינויים ברמת החלבון בשבר.

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל המשתמש בצנטריפוגה הדרגתית כדי לבודד גרעינים בודדים. לאחר הבידוד, גרעינים אלה יכולים לשמש לריצוף ולניתוח גנום.

טיהור גרעינים מבוסס צנטריפוגה הדרגתית: טכניקה להשגת שבר אולטרה-טהור של גרעינים שלמים באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות

סרטון זה מדגים את שיטת הטיהור מבוססת צפיפות גרדיאנט אולטרה-צנטריפוגה לבידוד תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות המתאימות למחקרי אפיון.

טיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות: טכניקה לטיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

מחקר זה מתאר שיטה לבידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המועשרות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), מזהה את המאפיינים הפיזיים של BEV ממורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז, ודן ביישומים האפשריים של גישת DGC במחקר קליני ומדעי.

בידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות

הפרוטוקול מתאר בידוד של EVs מיקרוביאליים במעיים מחולדות רגישות למלח המוזנות ב-HSD באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. EVs אופיינו במעקב אחר ננו-חלקיקים, מבחני TEM, LPS/BCA וריצוף 16S rRNA כדי לנתח את הגודל, המורפולוגיה, ההרכב ומקור המיקרוביוטה.

הפרדה ואפיון דיפרנציאלי של שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקי מעיים בחולדות רגישות למלח בתנאי תזונה עתירי מלח

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והכימות של רנ"א קטן של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

למדו איך להכין אנדוזומים ממוחזרים מתאי יונקים באמצעות צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני תנועת חלבונים בנתיבי אנדוציטוזה ומסייעת להבנת תהליכים תאיים חיוניים.

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים