מערכת ללא תאים טהורים של OnePot

פרוטוקול זה עבור מערכת ביטוי חלבון ללא תאים רקומביננטית, הידועה בכינויה מערכת PURE משתמשת בפולחן תאים ובטיהור תאים כדי לייעל את טיהורי החלבון הנדרשים. זה מצמצם באופן משמעותי את הזמן ואת דרישות העבודה. שיטת OnePot הוכיחה את עצמה לא רק חסכונית, אלא גם יעילה בזמן.

זה מקצר את זמני ההכנה מכמה שבועות לשלושה ימי עבודה. זה הופך את הפלטפורמה נטולת התאים PURE נגישה למעבדות נוספות ברחבי העולם ועוזרת ליישם פלטפורמה חזקה באמת זו לביולוגיה סינתטית ללא תאים. לפני שתתחילו, ודאו שכל הזנים מעל מבטאים היטב את החלבון שלהם.

כדי להתחיל, להכין את העמודה לטיהור חלבון OnePot כמתואר בכתב היד הטקסט באמצעות שני מיליליטר של שרף Sepharose, ולאחר מכן לטעון את העמודה עם ניקל גופרתי. הכן את תרביות המתנע על ידי שילוב של 20 מיליליטר של מדיה LB עם 20 microliters של אמפיצ'ין. הוסף 300 מיקרוליטרים של התקשורת לתוך 35 בארות של צלחת באר סטרילית 96 עמוק.

לחסן כל אחד מהם עם המתח המתאים שלה, למעט גורם התארכות תרמו לא יציב, או EFTU, ולאטום את הצלחת עם קרום נושם. עבור תרבות EFTU, לחסן שלושה מיליליטר של אמפצילין המכיל מדיה LB בצינור תרבות 14 מיליליטר עם כובע הצמדה. כשלושה מיליליטרים של תרבות EFTU מספיקים לתרבות ביטוי אחת של OnePot.

לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 260 סיבובים לדקה לילה. למחרת, להעביר 500 מיליליטר של מדיה LB ו 500 microliters של אמפצילין לתוך הבקבוק הסטרילי מבולבל. לחסן את תרבות OnePot PURE עם 1, 675 מיקרוליטרים של תרבות EFTU ו -55 מיקרוליטרים של כל אחת מהתרבויות מצלחת הבאר העמוקה.

לדגור על התרבות במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם טלטול של 260 סיבובים לדקה, או עד הצפיפות האופטית של התרבות מגיעה 0.2 עד 0.3. לגרום לתרבות עם 500 מיקרוליטרים של IPTG 0.1 מילימולר ולגדול במשך שלוש שעות נוספות. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו 3, 220 פעמים G במשך 10 דקות, ולאחסן את גלולה התא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

ביום השלישי, למדוד את כמויות המאגרים הדרושים לטיהור שלהם ולהוסיף TCEP לכולם כפי שצוין בטקסט. אחסן את המאגרים הנותרים ללא TCEP בארבע מעלות צלזיוס לטיהורים עתידיים. יש לכלול את העמודה הטעונה עם 30 מיליליטר של חוצץ A.After 25 מיליליטר של חוצץ A עבר, לסגור את העמודה מלמטה.

להפשיר את התאים ולהשתמש pipette סרולוגי כדי resuspend גלולה התא ב 7.5 מיליליטר של חוצץ A.Lyse התאים באמצעות בדיקה 130 וואט. אם sonication הוא מוצלח, הפתרון יהפוך כהה יותר. הקפד לשמור על התאים על קרח ולהניח את הגשוש עמוק מספיק מבלי לגעת בצינור.

הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 21, 130 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשמור את lysate על קרח. הוסף את הסופר-טבעי לעמודה המשוויבת. סגור את העמודה מלמעלה וודא שאין דליפה.

לדגור על העמודה במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס תחת סיבוב באמצעות סיבוב צינור. יש לאלוט רכיבים לא מאוגדים מהעמוד ולשטוף עם 25 מיליליטר של חוצץ A.Wash את העמודה עם 25 מיליליטר של 25 מילימולר חיץ imidazole. יש לאלוט את החלבונים עם חמישה מיליליטרים של 450 מילימולר חיץ imidazole ולשמור את החלבונים הנבה על הקרח בכל עת.

לדלל את eluate עם 25 מיליליטר של חוצץ HT ולשמור את התערובת על קרח. מוסיפים 15 מיליליטר למסנן צנטריפוגלי של 15 מיליליטר ומתרכזים בנפח של 1.5 מיליליטר. מוסיפים את 15 המיליליטר הנותרים למסנן עם הפתרון המרוכז ומתרכזים שוב ב-1.5 מיליליטר.

מוסיפים 10 מיליליטר של חוצץ HT לדגימה המרוכזת ומתרכזים למיליליטר אחד. לשחזר את המדגם המרוכז ולהוסיף כמות שווה של מאגר מלאי B ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. במהלך חילופי המאגרים, שחזר את העמודה כפי שצוין בטקסט.

ביום הרביעי, למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ברדפורד assay. מרכז את המדגם עם 0.5 מיליליטר של שלושה קילודלטון ניתוק מסנן צנטריפוגלי ל 20 מיליגרם למיליליטר. אמת את הרכב החלבון OnePot PURE באמצעות עמוד SDS.

לדלל 2.5 microliters של המדגם עם 7.5 microliters של מים מעורבב עם 10 microliters של שני חוצץ X Laemmli, ולאחר מכן לטעון חמישה microliters ו 2.5 microliters של הדגימות על הג'ל. הפעל את דף ה- SDS כפי שצוין בטקסט. מלא את הריכוז והאורך של ה- DNA בתאים הצהובים המתאימים בגיליון האלקטרוני באמצעות שניים עד 10 ננומולר של DNA לתגובה.

מלאו את נפח התגובה הכולל הרצוי במיקרו-לייטרים. מוציאים את ריאגנטים הנדרשים מהמקפיא ומפשירים אותם על קרח. לאחר מכן, pipette את כמויות מחושבות של מים, DNA ופתרון אנרגיה לצד אחד של צינור PCR או פינה אחת של באר על צלחת 384 היטב.

Pipette את הכמויות המחושב של חלבון ופתרון ריבוזום לצד השני של צינור PCR או הפינה הנגדית של צלחת 384 היטב. ספין במשך כ-30 שניות כדי למזג את רכיבי התגובה. כדי למנוע אידוי במהלך ניסויים קורא צלחת, להוסיף 35 microliters של שעווה נוזלית, ולאטום את הצלחת עם איטום שקוף.

דגירה במשך שלוש שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס. לקריאה על קורא לוחות, למדוד את עוצמת פלורסצנטית אורך הגל הנדרש כל שתי דקות. ביטוי יתר מוצלח בכל הזנים הבודדים המשמשים לאחר מכן להכנת חלבון OnePot מוצג כאן.

ההרכב הכולל של פתרון חלבון OnePot PURE הסופי נותח על ידי דף SDS. זה מורגש כי EFTU קיים בריכוז גבוה יותר בהשוואה חלבונים אחרים, כצפוי. התשואות הסינתזה של פתרון חלבון OnePot בשילוב עם ריבוזומים מתויגים או לא מתויגים נותחו על ידי ניטור פלואורסצנטיות eGFP לאורך זמן.

רמות הביטוי של שלושה חלבונים שונים המסומנים באמצעות הרשימה הירוקה tRNA במערכת תיוג במבחנה, או כתמי קומאסי, נותחו על ג'ל עמוד SDS. עבור מערכת PURE פונקציונלית, זה קריטי לחלוטין כי כל הזנים לבטא את החלבונים המתאימים שלהם היטב. טכניקה זו מאפשרת את יישום מערכת PURE להנדסת מערכות ביולוגיות, ומאפשרת פיתוח רשתות גנטיות חדשניות, אבחון מולקולרי, טיפולי וערכות חינוכיות.