קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

זרימת העבודה מורכבת מגידול תאים בתנאים סביבתיים מבוקרים לחלוטין, צמרמורת מהירה שלהם באמצעות מים נמסים / קרח ותיקון עם ריכוז אופטימיזציה מראש של פורמלדהיד וזמן הדגירה. תגובת הקיבעון מרווה לאחר מכן באמצעות עודף של תרכובות המכילות קבוצת אמינו ראשונית, כגון גליצין או טריפס. תאים נאספים, נשטפים וניתן לאחסן אותם קפואים.

תאים קבועים יכולים להיות lysed מכני או כימי, ואת lysate משמש להפרדה של שברים ריבוזומליים בהתבסס על הגודל המולקולרי שלהם, תכונות משקעים או סמני זיקה. הגישה מביאה לחומר רב-תכליתי שמיש לטיהור וזיהוי בסיוע אימונו, העשרה של מתחמים המכילים גורמים ספציפיים במיקרוסקופיית אלקטרונים. לאחר חסימה עמוקה מוצלבת, הגברת RNA או ניתוחים מבוססי הכלאה, רצף RNA וספקטרומטריית מסה הופכים לאפשריים.

הגדר תרבות שמרים של ליטר אחד בשייקר מסלולית עם צפיפות אופטית התחלתית לא יותר מ 0.05 יחידות ספיגה ב 600 ננומטר ולהשתמש פפטון ו מדיה דקסטרוז ב 30 מעלות צלזיוס. הגדר צנטריפוגה הכנה עם רוטור תואם ובקבוקי צנטריפוגה עבור גלולה ההשעיה הנוזלית של תאי שמרים ב 5000 G בארבע מעלות צלזיוס. שמור תיעוד של הצפיפות האופטית של התאים הגדלים.

זה חייב להיות בין 0.6 ל 0.8 יחידות ספיגה ו 600 ננומטר בזמן האיסוף אם שלב הצמיחה המעריכי הוא עניין. ברגע שהתאים מוכנים, הקימו מקרר בתוך מכסה המנוע הכימי עם אופה המכיל 250 גרם של קרח מים כתוש נקיים ותראו לכם גם 25 מיליליטר טריפסין ומתנול שנרכש טרי התייצב 37% תמיסת פורמלדהיד בתוך מכסה המנוע. יוצקים את תרבית התא האחרונה לאופה המכיל את הקרח.

לאחר מכן להוסיף 75 מיליליטר של 37%פורמלדהיד לריכוז סופי של 2.2% משקל על נפח מערבבים באינטנסיביות את התערובת עד שהקרח נמס. לאחר הקרח נמס, להגדיר שעון במשך 10 דקות לאחר הדגירה במשך 10 דקות, להעביר את התרבות לתוך בקבוקי צנטריפוגה מקורר מראש גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס, 5000 G במשך חמש דקות. בעוד הספין הוא, על מראש מגניב צינור 50 מיליליטר ולשמור על חיץ מוכן טרי A המכיל גליצין כדי לנטרל כל פורמלדהיד שנותר על קרח.

לאחר צנטריפוגה, מניחים את צינורות הצנטריפוגה על קרח עם צד הכדור במגע עם הקרח. מכניסים את הצינורות למכסה המנוע של האדים ומשליכים את הסופר-נט למיכל פסולת פורמלדהיד. להשעות מחדש את גלולה התא מצינורות ישנים ב 20 מיליליטר של חוצץ A באמצעות סטריפט 25 מיליליטר והעברה לתוך צינור 50 מיליליטר.

לפצות את הנפח ל 40 מיליליטר עם חוצץ A ולאסוף את תאי לשטוף על ידי צנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס, 5000 G במשך חמש דקות. להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה התא ב 40 מיליליטר חוצץ אחד, שהוא חוצץ A לא מכיל גליצין כדי להסיר זיהום גליצין. גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס, 5000 G חמש דקות.

חזור על הכביסות עם חוצץ A, עוד פעם אחת. להשליך את supernatant ומניחים את גלולה התא על קרח. שקול את הצינור עם הכדור, מסת התא הרטוב צריך להיות בערך גרם אחד לכל ליטר אחד של תרבית התא.

מלאו פוליסטירן מקופסה מרופדת בנייר אלומיניום עם חנקן נוזלי לעומק של כשלושה סנטימטרים. מניחים בצינור 50 מיליליטר זקוף בקופסה. להשעות מחדש את הכדור ב 550 microliters של חוצץ A שתיים על ידי pipetting ומערבולת במשך 10 שניות.

הוסף 10 מיקרוליטרים של 40 יחידות לכל מעכב RNase מיקרוליטר ומערבולת שוב במשך 10 שניות. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, מטפטפים את ההשעיה של התא לתוך 50 מיליליטר 2 המכילים את החנקן הנוזלי. כדי להתכונן לשלב הבא, טרום מגניב 1.5 מיליליטר גרעין חינם צינורות על קרח יבש 10 מיליליטר צנצנות טחינה נירוסטה.

מעבירים את טיפות ההשעיה הקפואות לתוך הצנצנות באמצעות מרית סטרילית נקייה. שקועים בצנצנות הטחינה בחנקן נוזלי למשך דקה אחת, ומבטיחים שהשלב הנוזלי יישאר מעל הצומת. הקם טחנת ערבוב קריו ב 27 הרץ לתסיסה במשך דקה אחת.

להסעיר את צנצנות הטחינה האטומות ב 27 הרץ במשך דקה אחת בטחנת המיקסר. מצננים מחדש את הצנצנות בחנקן נוזלי כבעבר ומנערים עוד דקה. מעבירים את הצנצנות לקופסת הקרח המכילה קרח יבש יחד עם צינורות ללא גרעין 1.5 מיליליטר.

באמצעות מרית פלדה קטנה להעביר את התוצאות תאריך לטחון מרופד לתוך הצינורות. ואז לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס. בשני צלוחיות T175 לגדל HEK 293 תאים ל 60 עד 70% מפגש ואת המדיום הנשר שונה של Dalbeko ו 10% סרום בקר עוברי ב 37 מעלות ו 5% פחמן דו חמצני.

לפחות שלוש שעות לפני זמן הקיבעון הרצוי, החליפו את המדיה של בקבוקון T175 בדיוק ב-30 מיליליטר של מדיה שלמה מחוממת מראש. הכן מקרר עד הקצה עם קרח מים כתוש ולשמור על מכסה המנוע אדים יחד עם חוצצים נדרשים, גם קרח. כדי לצנן את התאים, להסיר את בקבוקון T175 מן האינקובטור ולחץ אותו באופן רשמי נגד הקרח הבטחת מגע משטח מקסימלי.

בתוך מכסה המנוע של אדים כימיים, הטה את הבקבוק על צידו כך שהתקשורת תאסוף בצד שממול לתאים. פיפט 168 מיקרוליטרים של 37% נשקלים על ידי פורמלדהיד נפח ישירות לתוך המדיה המאוחסת. נותן ריכוז סופי של 0.2% פורמלדהיד.

מערבבים מיד. לדגור את הבקבוקונים על הקרח במשך 10 דקות נוספות. יוצקים את המדיה לתוך מיכל פסולת מתאים דרך הצד הבקבוקון מול התאים.

באמצעות סטריפטי, פיפטה ב 30 מיליליטר של תמיסת מלח חוצץ פוספט של Dalbeko ללא יוני סידן ומגנזיום ובנוסף מכיל 50 גליצין מילימולר בעדינות בצד שממול לתאים. מערבבים על ידי נדנדת הבקבוקון, מחזירים את הפלאש למיקום אופקי ודגור במשך 10 דקות נוספות על הקרח. יוצקים את הפתרון דרך הצד הבקבוקון ממול לתא ולהוסיף בעדינות שבעה מיליליטרים של פתרון EDTA 0.25%טריפסין סטנדרטי לנתק ולהשעות מחדש את התאים.

לדגור על הבקבוק בטמפרטורת החדר במשך חמש, מקסימום 10 דקות. אתר את הבקבוקון אנכית באמצעות strippete, לאסוף את התאים המנותקים על ידי שטיפת בעדינות כל שנותר מקירות הבקבוקון ולהעביר את המתלה לתוך צינור 50 מיליליטר להגדיר על קרח. מיד להשלים את פתרון ההשעיה שנאסף עם 20 מיליליטר של מדיה מלאה לערבב על ידי בעדינות היפוך הצינור.

גלולה את התאים על ידי centrifuging הצינור ב 100 G במשך חמש דקות וארבע מעלות צלזיוס. גלולה תא חייב להיות גלוי בבירור. יוצקים את התקשורת ומשהים בעדינות את הכדור ב-10 מיליליטר של תמיסת מלח מחוסנת פוספט של דלבקו ללא גליצין.

צנטריפוגה הצינור שוב ב 100 G במשך חמש דקות וב בארבע מעלות צלזיוס לשפוך את חוצץ לשטוף ולהשעות מחדש את הכדור ב 800 microliters של קרח קר פוספט של תמיסת מלח חוצץ של Dalbeko ללא גליצין, אבל המכיל מגנזיום ויוני סידן. העבר את התאים המושעים מחדש לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר חדש. צנטריפוגה הצינור ב 100 G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בזהירות להשליך את supernatant באמצעות pipetter מיליליטר אחד. בשלב זה, כדור התא יכול להיות קפוא במינוס 80 מעלות צלזיוס או להמשיך לשלב תמוגת התא. בארון בטיחות ביולוגית להוסיף 300 microliters של חוצץ תמוגה המבוסס על חומר ניקוי לא יוני, לא denaturing, ושבע microliters של מעכב ארגינז לערבב היטב על ידי pipetting באמצעות קצה מיליליטר אחד.

בזהירות לצרף מחט 25 מד למזרק אחד עד שלושה מיליליטר ו pipette במרץ את התערובת באמצעות לפחות שבע ספיגה איטית כלפי מעלה ומשיכות פליטה במהירות כלפי מטה. להשליך את המזרק ואת המחט לתוך הפח של חד ולחזור על ההליך עם מחט 31 מד ומזרק 0.3 מיליליטר. להשליך את המזרק והמחט לפח של החדה.

צנטריפוגות הצינור ב 12, 000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות כדי להסיר את פסולת התא. מעבירים את הסופרנט לצינור צנטריפוגה מיקרו-1.5 מיליליטר חדש עם חלבון נמוך. לאחסן את פסולת התא וליזייט במינוס 80 מעלות צלזיוס.

מתחמי תרגום רגישים להרכב היוני של המאגרים. אומיטנס של מגנזיום כלוריד ותוספת של תכונות משקעים גבוהות של EDTA, ובעוד סידן כלוריד הביא לשיאים תוצאה טובה יותר, השיפור היה שולי. לכן בחרנו חוצץ אחד.

משקל של 2.2% לפי פורמלדהיד נפח שמר מצוין על הפוליוזומים ולא הפחית את התשואה הכוללת לעומת 4% משקל לפי פורמלדהיד נפח. בתאי יונקים, ריכוז נמוך בהרבה של פורמלדהיד של 0.2% משקל לפי נפח שימש. כמו ריכוזים גבוהים יותר הביא לאובדן חומר פוליריבוסומלי משמעותי.

15 מילימולר EDTA הוסיף lysate וכל המאגרים הבאים הציגו אפקט פחותה באופן ייחודי על השברים הפוליזומליים, נגזר התאים הקבועים. ואפקט זה שוכפל חלקית עם EDTA 50 מילימולר עם חומר מ 4% תאים קבועים, התנגדות, התגלגלות טובה יותר. דלדול גלוקוז מעורר את אחת ההשפעות המעכבות התרגומיות הדרמטיות והמהירות ביותר על שמרים.

הן העצבים שנוספו והן גורמים באופן מקומי לתנאים הנגרמים מפירוק פוליום היו מעט, אך ככל הנראה יותר פוליוזומים נשמרו בגלוקוז הוסיף נמוך. חשוב לציין, חומר פוליזומלי מהתאים הקבועים מדגים הבחנה גבוהה בין התאים הרעבים והלא מורעבים המצביעים על התאמת קיבוע פורמלדהיד כדי לשמר הבדלים בתהליכים תרגומיים דינמיים. בגישות כגון tacy paysake, זה עשוי להיות תובנה נוספת כדי להסיר subunits ריבוזומלי קטן שאינם להתיישב היטב עם קנה שורש מלא שעבורם השתמשנו ultracentrifugation דו שלבי, המאפשר בידוד של SSU, LSU, RS, דיאזומים עמידים RNase, DS, ו polysomesomes בסדר גבוה שאושרו על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים של השברים הקבועים.

בהשוואה לתאים הלא קבועים, חומר מהתאים הקבועים הדגים נוכחות גבוהה של eIF4A מעבדה בשברים ריבוזומליים משקעים המהירים ביותר. באמצעות חומר קבוע מזן eIF4A tapi כדי ללכוד ולהעשיר eIF4A המכיל מתחמים עם חרוזי IDG מגנטיים, הצלחנו לצפות העשרה סלקטיבית של eIF4A לעומת בטא-אטין ב- SSU ו- RS, אך לא שברי LSU מהשיפוע השני על RNase אחד פירוק. בהשוואה לשיטות אחרות של מנוחה תרגומית, המהירות של פעולת פורמלדהיד על פני קרום התא והאופי חסר ההשערה של קישורים צולבים מבטיחים שימור המגוון המרבי של מתווכים מורכבים תרגום.

הממצאים שלנו תואמים את השימושיות של קיבוע פורמלדהיד מהיר לייצב מתחמים ארעיים מאוד ואת התועלת של עדויות בתרחישים של תגובות תאיות מהירות לשינויים סביבתיים או לתנאי לחץ.