Name: 5-אתניל-2-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: למדו פרוטוקול תיוג כפול EdU/pH3 לניתוח מחזור התא בתאי גזע עצביים של Drosophila. השיטה מאפשרת זיהוי שלבים G1, S ו-M ומסייעת בחקר מוטציות המשפיעות על חלוקת תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה במימון הקרן הלאומית למדע השוויצרית (מענק פרויקט 31003A_173188; www.snf.ch) ואוניברסיטת ברן (www.unibe.ch) ל- BS. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

1. הכנת ריאגנטים ומלאי לבדיקת קליקים של EdU
הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה 1 לקבלת פרטים אודות הערכה והריגנטים שסופקו עם הערכה.
<ol><li>הביאו את הבקבוקונים לטמפרטורת החדר לפני הכנת הפתרונות.</li>
	<li>הכן 10 mM EdU (רכיב A) פתרון מלאי על ידי הוספת 2 מ"ל של דימתילסולפוקס (DMSO, רכיב C). מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן פתרון עבודה של Alexa Fluor 647-azide (רכיב B) על ידי הוספת 70μL של DMSO (רכיב C). מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן פתרון 1x של מאגר התגובה Click-iT EdU (רכיב D) על ידי ערבוב 4 מ"ל של פתרון זה עם 36 מ"ל של מים דה-יוניים. יש לאחסן את הפתרון הנותר ב-2-6 °C (6 °F).</li>
	<li>צור מלאי של 10x (200 מ"ג/מ"ל) של תוסף מאגר קליק-iT EdU (רכיב F) על-ידי הוספת 2 מ"ל של מים דה-יוניים. מערבבים היטב ומאחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חנות Hoechst 33342 (רכיב G) ב 2-6 °C (70 °F). אחסן את DMSO (רכיב C) במתמד ב- -20 °C (20 °F). הערה: יש להשתמש בכפפות כדי לטפל ב- DMSO ובהוויסט.</li>
</ol>2. ניתוח מוחות זחלי זחלים שלישיים והתאגדות EdU
הערה: הפרוטוקול עבור ניתוחי מוח תואר בעבר12. לפני תחילת הניתוחים, ודאו שכמויות מספיקות של פתרונות EdU ו-PFA מוכנות ומופשרות כמתואר ב-2.6 וב-3.1.
<ol><li>הכן תמיסת מלח (PBS) עם אגירת פוספט 10x על-ידי הוספת 25.6 גרם Na2HPO4.7H20, 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl ו-2 גרם KH2PO4 ל-1 ליטר של מים דה-יוניים. התאימו את ה-pH ל-7.4, ולאחר מכן הכינו תמיסה 1x במים דה-יוניים.</li>
	<li>הוסף שניידרס ניתוח בינוני (SM) לשני שקעים רצופים של (3 או 9) צלחת ספוט זכוכית דיכאון. הוסף PBS 1x לדיכאון הבא ברציפות.</li>
	<li>בעזרת זוג מלקחיים, בחרו זחלים נודדים של כוכב שלישי והניחו על טישו רטוב עם PBS כדי לנקות שאריות מזון זבובים. מניחים את הזחל בדיכאון עם PBS ולאחר מכן בדיכאון הרצופים עם SM.</li>
	<li>בעזרת זוג מלקחיים עדינים, יש להסיר 3/4מהפלג התחתון של הזחל.<ol>
<li>תפסו בעדינות את קרסי הפה הזחלי בזוג מלקחיים אחד, והחזקו את החתך בקצה השני עם זוג המלקחיים האחרים.</li>
		<li>להפוך את ראש הזחל מבפנים החוצה על ידי דחיפה פנימה ווים הפה ובו זמנית קילוף את הרקמה בקצה השני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התבונן במוח הזחל עם דיסקים דמיוניים מחוברים. הסר רקמות אחרות המחוברות למוח, ולהעביר את המוח לדיכאון הבא ברציפות עם SM.</li>
	<li>להפשיר את פתרון מניית EdU 10 מ"מ. הכן פתרון 100 מיקרומטר על ידי דילול מלאי זה 10 mM ב- SM.</li>
	<li>הוסף 100 μL של פתרון 100 EdU + SM זה בדיכאון אחר על צלחת Pyrex. דגירה ~ 5-10 מוחות ניתחו ב 100 μL של 100 μM EdU + SM פתרון עבור 2 שעות ב 25 °C (70 °F). הערה: כאשר NBs מתחלקים פעם ב- ~ 2 שעות, פרוטוקול זה נועד לנתח מחזור תא מלא אחד. השתמש במוח שלם רק לצעדים נוספים. יש להשליך מוחות שניזוקו במהלך הניתוח.</li>
</ol>3. קיבעון וחיסון
<ol><li>הכן 4% פתרון paraformaldehyde (PFA) במכסה המנוע אדים.<ol>
<li>יש להוסיף 4 גרם אבקת פרפורמלדהיד ל-80 מל של 1x PBS בתוך המונחת על מערבל מגנטי וחום ל-60 מעלות צלזיוס. כדי להמיס PFA, להוסיף כמה טיפות של 1 N NaOH. בדוק את ה- pH, והסתגל ל- 7.0 עם כמה טיפות של 1 M HCl במידת הצורך.</li>
		<li>כוונן את עוצמת הקול ל- 100 מ"ל עם PBS 1x. Aliquot הפתרון PFA ולאחסן ב 2-6 °C (7 °F) עד חודש אחד. הוסף 0.3% חומר ניקוי לא יוני (ראה טבלת החומרים) לפתרון PFA לקיבעון יעיל של רקמות גדולות כגון המוח הזחלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר התאגדות EdU, להעביר את המוח ל 0.6 מ"ל צינורות microcentrifuge המכילים 4% PFA. דגירה בטמפרטורת החדר על מטור במשך 15 דקות. הקש על הצינור על ספסל המעבדה כך שהמוחות להתיישב בתחתית הצינור.</li>
	<li>הסר את PFA ולשטוף 3 פעמים עם PBS + 0.3% חומר ניקוי לא יוני (PBST) בטמפרטורת החדר. ודא כי כל לשטוף נמשך לפחות 10 דקות על nutator. לאחר הכביסה האחרונה, להסיר PBST, להוסיף פתרון חסימה (PBST + 5% אלבומין סרום בקר), ודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדלל נוגדן נגד מירנדה (1:250) ונוגדן נגד pH3 (1:200) ב-PBST (שניהם נוגדנים באותו צינור). הסר את מאגר החסימה והוסף את פתרון הנוגדנים הראשי. דגירה לילה ב 2-6 °C (6 °F) על nutator. הערה: מירנדה היא חלבון ממברנה נוכח על CB NBs. הוא משמש לזיהוי תאים עגולים גדולים אלה באזור CB13.</li>
	<li>הסר את פתרון הנוגדנים העיקרי ושטוף 3 פעמים עם PBST. ודא כי כל לשטוף נמשך 10 דקות על nutator בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכן פתרון נוגדנים משני על ידי הוספת 1:500 מדולל אלכסה פלור 488 אנטי ארנב ואלכסה פלור 568 אנטי חולדה ב PBST. הסר את PBST, והוסף את פתרון הנוגדנים המשני למוחות נותחו. לדגור לילה ב 2-6 °C (6 °F) בחושך, על nutator, ולשטוף 3 פעמים עם PBST (שלב 3.5).</li>
</ol>4. זיהוי EdU, כתמי DNA והרכבה
<ol><li>כדי להכין את קוקטייל הזיהוי EdU, לערבב את הרכיבים (ראה טבלה 2) בצינור 1.5 מ"ל.</li>
	<li>לאחר הכביסה האחרונה (שלב 3.6), הסירו PBST והוסיפו את קוקטייל הזיהוי של EdU למוחות נותחו. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות על nutator. לשטוף 2 פעמים עם PBST במשך 10 דקות כל אחד, בחושך.</li>
	<li>להכתמת DNA, לדלל Hoechst 33342 (רכיב G) 1:2,000 PBST כדי להכין פתרון 5 מיקרוגרם / mL.</li>
	<li>הסר PBST לאחר השטיפה השנייה (שלב 4.2), ולהוסיף 500 μL של 5 מיקרוגרם / mL Hoechst פתרון למוחות נותחו. לדגור בחושך במשך 10 דקות. להסיר Hoechst, ולשטוף פעם אחת עם PBST במשך 10 דקות.</li>
	<li>הקש על הצינור על ספסל המעבדה, ולתת למוח להתיישב. הסר PBST מן הצינור, אבל להשאיר מאחור רק 50-100 μL.</li>
	<li>חותכים את הקצה של קצה מיקרופיט 200 μL, ולהעביר בזהירות את המוח על שקופית זכוכית נקייה. הסר PBST עודף מהשקופית על-ידי כתמים עם רצועות נייר מסנן. תיזהר לא לתת לנייר הסינון לגעת במוח.</li>
	<li>שים טיפה של מדיום מסיס במים, לא פלואורסצנטי על המוח, וכוון את המוח כך כבל העצבים הגחוני פונה למגלשה, והאונות פונות כלפי מעלה. סדרו את המוח בקובץ אחד כך שיהיה קל יותר לדמיין את המוח באופן סדרתי.</li>
	<li>מניחים בעדינות כיסוי על גבי המוח. מניחים את השקופית ב 2-6 °C (6 °F) לילה. הערה: בינוני הרכבה מתקשה על אחסון לילה, כך שאין צורך לאטום את כיסוי עם לק.</li>
</ol>5. הדמיה
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על המיקרוסקופ לסריקת הלייזר ומטרת טבילת השמן המשמשת בפרוטוקול זה.
<ol><li>מתוך תוכנת הרכישה, בחר את המטרה 63x.</li>
	<li>שים טיפה של שמן טבילה על כיסוי ממש מעל המוח רכוב כדי להקל על איתור הרקמה דרך העין.</li>
	<li>באמצעות ערוץ DAPI / Hoechst 33342, מצא את המוח דרך העין ולאחר מכן עבור למצב הרכישה בתוכנה.</li>
	<li>הגדר 4 ערוצים כדי לדמיין Hoechst 33342 (DNA), אלכסה פלור 488 (pH3), אלכסה פלור 568 (מירנדה), ואלכסה פלור 647 (EdU). השתמש בכלי מסייע הצבע, שמגדיר באופן אוטומטי את לייזרי העירור ומסנני הפליטה עבור הצבעים שנבחרו.</li>
	<li>הגדר את שדה הראייה כך שהוא מקיף את כל אונה המוח. תמונה את כל הנפח של אונת המוח על ידי רכישת z-ערימות במרווחים 0.8 מיקרומטר זה מזה. אחסן את כל התמונות מהפעלת הדמיה בתבנית ספריה *.lif.</li>
</ol>6. ניתוח תמונה
הערה: השלבים הבאים מתארים את הניתוח של תמונות שנרכשו וכיצד למיין תאים לשלב G0/G1, שלב S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלב M באמצעות תוכנת ImageJ.
<ol><li>הורד פיג'י (פיג'י הוא ImageJ) מכתובת ה- URL הבאה: https://fiji.sc/. פתח את פיג'י ולאחר מכן גרור ושחרר את קבצי ה- .lif לתוך פיג'י. הערה: פיג'י היא גרסה של ImageJ שמגיע מותקן מראש עם כמה תוספים14. העברת קבצי .lif לפיג'י תפתח את תוסף Bio-formats, הדרוש לעיבוד קבצי .lif. תוסף ביו-פורמטים נדרש גם כדי לפתוח קבצי תמונה שנוצרו מכמה מותגי מיקרוסקופ אחרים, למשל, קבצים nd2 שנוצרו ממיקרוסקופ ניקון. תוסף זה מגיע מותקן מראש עם פיג'י.</li>
	<li>בחר דפדפן נתונים מהכרטיסיה הצגת מחסנית והשתמש בערימה וירטואלית מהכרטיסיה ניהול זיכרון בתוסף ביו-פורמטים. הערה: קבצי Lif עם ערימות z מ 8-10 מוחות הם לעתים קרובות 300-400 מגה בייט בגודל. במחשבים עם זיכרון RAM נמוך, פתיחת כמה קבצים כאלה יכולה לרוקן במהירות את ה- RAM הזמין ב- ImageJ ולמנוע עיבוד תמונה נוסף. מחסנית וירטואלית היא 'לקריאה בלבד', אינה זקוקה ל- RAM גבוה לעיבוד, והיא אפשרות אידיאלית לטעון ערכות נתונים גדולות לפיג'י.</li>
	<li>שים לב לתמונה הרב-ערוצית המוצגת ב- ImageJ. שנה את צבע הערוצים שורת התפריטים באמצעות הכלי | צבע תמונה |. שימו לב ל-NBs המסומנים על ידי מירנדה כתאים עגולים גדולים באזור CB.</li>
	<li>צייר אזור עניין (ROI) באמצעות הכלי אליפסה מעל כל NB כדי להימנע מספירת ה- NB פעמיים.<ol>
<li>מתוך שורת התפריטים ImageJ, בחר ניתוח כלי | | מנהל ROI. סמן את כל ה- NBs במקטע z הנוכחי והקש t לאחר סימון כל תא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר שכל ה- NBs בסעיף z הנוכחי מסומנים, שנה את הערוצים ל- pH3 ו- EdU, וספור באופן ידני את מספר ה- NBs החיוביים של EdU, NBs חיובי, NBs מכתים באופן חיובי הן עבור EdU והן עבור pH3, ו- NBs לא מכתים עבור שני הסמנים.</li>
	<li>חפש NBs במקטעי z הבאים, מחק בדיקות ROIS ישנות והוסף בדיקות ROIs חדשות לספירת NBs בערימות שונות.</li>
	<li>הכן גיליון אלקטרוני עם העמודות הבאות: 1. EdU- pH3-: מקטע זה מייצג את התאים הכפולים-שליליים הנמצאים בשלב G0/G1 של מחזור התא; 2. EdU+: התאים בקטגוריה זו שילבו EdU והם עוברים שכפול DNA (S-phase); 3. EdU+ pH3+: תאים דו-חיוביים אלה השלימו את שלב ה- S והתקדמו לשלב G2 או M; 4. pH3+: NBs אלה עוברים מיטוזה.</li>
	<li>חשב אחוזים של NBs נוכחים בכל 4 הקטגוריות לעיל עבור כל אונה. הכן גרף עמודות באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני המציגה את הנתונים המאוגדים עבור אחוזים של NBs בכל קטגוריה.</li>
</ol>

<ol><li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li>
<li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review+of+regulation%2C+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li>
<li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li>
<li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894(2015).</li>
<li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+regulation+by+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers%3A+A+comparative+study+with+Ki67%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461(2010).</li>
<li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913(2020).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li>
<li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miranda%2C+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division%2C+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li>
<li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NVX-412%2C+a+new+oncology+drug+candidate%2C+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015(2012).</li>
<li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53%2Fp21%28WAF1%29+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li>
<li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+S-phase+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Developing S-phase control.</a> Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li>
<li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li>
<li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29-coupled-fluorescence-intensity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517(2017).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li>
<li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li>
</ol>

המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

התאגדות EdU ותגובת ה'קליק' הבאה שלה עם אזיד חדיר לתא מציגה יתרונות מעשיים של טכניקה זו על פני שיטת BrdU בשימוש מוקדם יותר7. עם זאת, תגובה זו מזורזת על ידי יונים Cu(I), וכמה צבעים עשויים להיות לא יציבים בנוכחות זרז נחושת זה, כפי שמומלץ בבירור על ידי יצרן ערכת EdU קליק-אי. כאשר ניסויי חיסון בוצעו לאחר ביצוע שלב הזיהוי של EdU, עוצמת האות הצפויה לא נצפתה עם צבעי הערוץ האדום, אלכסה פלור 568 ו- Cy3. עם זאת, הפרוטוקול עבד כאשר תגובות חיסוניות הושלמו לפני שלב הזיהוי של EdU. עם פרוטוקול זה, ארבעה ערוצים שי...

מחזור חלוקת התאים כולל שלב G1 (שלב הפער הראשון), שלב שכפול/S, G2 (שלב פער שני) ושלב M (מיטוטי). עובר בשלבים אלה, התא עובר שינויים דרמטיים תמלול הסלולר, תרגום, וארגון מחדש של מכונות שלד1,2. בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים, תאים עשויים להפסיק באופן זמני להתחלק ולהיות ססגוניים (G0) או להבדיל ולהפסיק לצמיתות לחלק3. תרחישים אחרים, כגון נזק לדנ"א, עלולים לגרום לבידול מוקדם או אפופטוזיס3,4. התגובה לרמזים כאלה מתווכת על ידי מחסומי מחזור סלולריים, הפועלים כמערכת מעקב כדי להבטיח את שלמותם של תהליכים סלולריים חיוניים לפני שהתא מתחייב לשלב הבא של מחזור החלוקה5. לכן, מחקרים על גנים המסדירים שכפול DNA, מחסומים ומכונות מיטוטיות צריכים לנתח פגמים אפשריים בהתקדמות מחזור התא שעלולים להתרחש בתאים מוטנטיים או על פירוק siRNA של גנים אלה. בנוסף, ניתוחים כאלה עשויים להיות מועסקים כדי לבדוק את בריאות התא הכוללת, כמו גם תגובות תאיות לטיפול תרופתי.
5-ברומו-2'-דאוקסיאורידין (BrdU) הוא אנלוגי תימידין המשולב ב- DNA במהלךשכפול 6. שיטה זו שימשה בהרחבה לזיהוי תאים ב- S-phase. עם זאת, התאים נתונים לאחר מכן להליכי דנ"א קשים כדי לאפשר זיהוי של BrdU באמצעות נוגדנים נגד BrdU6. טיפול קשה זה עלול לפגוע באפיטופים הסלולר ולמנוע אפיון נוסף של המדגם באמצעות חיסונים. שילוב EdU וזיהוי לאחר מכן על ידי נחושת מזורז, "תגובת קליק" עם קטן, תא חדיר, צבעי אזיד מתויגים באופן פלואורסצנטי מבטל את הצורך בהליכי דנטורציה קשים7. שיטה זו, אם כן, התגלתה כחלופה מעשית יותר לתאגדות BrdU.
יתר על כן, pH3 תואר כסמן אמין עבור mitotic / M פאזה תאים8. Histone H3 הוא חלבון היסטון ליבה הקשור לדנ"א שהופך לזרחן בסביבות שלב ה- G2 המאוחר לשלב M המוקדם והוא דה-זרחן לקראת סוף אנאפאזה8. מספר נוגדנים מסחריים ניתן להשתמש כדי לזהות pH3 באמצעות פרוטוקולים חיסוניים סטנדרטיים. מכתים כפול של EdU ו- pH3 יאפשר אפוא זיהוי של תאים ב- S-phase כמו גם M-phase. בנוסף, תאים בשלב G1 ו- G2 מוקדם לא יכתימו באופן חיובי עבור אף אחד מהסמנים.
תאי גזע עצביים Drosophila או neuroblasts (NBs) מציעים מודל תאי גזע מאופיין היטב שבו תאים מתחלקים באופן אסימטרי כדי לייצר NB אחד זהה מתחדש עצמי ותא אם גנגליון (GMC), אשר נגזר על בידול9. בנוסף, מספר כלים גנטיים ונוגדנים ספציפיים ל- NB הופכים את המערכת הזו למתאים למניפולציה גנטית והדמיה של תאים חיים. כתוצאה מכך, מספר מחקרים השתמשו NBs כדי לחקור גנים המסדירים חטיבות אסימטריות וקביעת גורל התא9. אוכלוסיות נפרדות של NBs קיימות במוח המרכזי (CB) ובאונה האופטית (OL) של המוח הזחלי9; CB NBs שימשו למחקר הנוכחי. אלה NBs CB זחל השלישי הם תאים גדולים המתאימים גם לחקר גורמים המסדירים את הרכבת ציר מיטוטי. פרוטוקול לניתוח פגמים התקדמות מחזור התא יהיה כלי חיוני במחקרים כאלה.
פרוטוקולים שפורסמו קודם לכן השתמשו בערכות מסחריות, כגון Click-iT EdU Alexa Fluor Cell התפשטות ערכה, המספקים מספר רכיבי תגובה וצבעי אזיד מתויגים עם מגוון של צבעי Alexa Fluor עבור שילוב וזיהויEdU 10. עם זאת, ריאגנטים המסופקים עם ערכות כאלה אינם תואמים כמה תגי פלורסנט המשמשים לעתים קרובות עם נוגדנים משניים. ערכת זיהוי EdU זו (ערכת התפשטות תאי EdU של Click-iT Alexa Fluor שסופקה עם אלכסה פלור 647-מצומד צבע אזיד) נבדקה ב- Drosophila שלישי זחל זחל NBs, וכתמים שותפים נוסה עם נוגדנים נגד pH3 ומירנדה, סמן עבור NBs. יתר על כן, אלכסה פלור 568- או Cy3 מתויג נוגדנים משניים שימשו לגילוי של מירנדה תיוג על קרום הפלזמה של NBs11. עם זאת, עוצמת האות הצפויה ודפוס הכתמים (תוצאות שלא פורסמו) לא נצפו עם נוגדנים משניים אלה כאשר חיסון בוצע לאחר זיהוי EdU.
עבור שילוב EdU, הפרוטוקול המתואר על ידי דאול ועמיתיו נדרש האכלה של הזחלים עם בינוני קנקל-לבן מעורבב עם EdU ו ברומופנול כחול (BPB)10. הזחלים ניזונים ממזון EdU ו- BPB, אשר ניתן לראות על ידי צבעו הכחול על בליעה במעיים הזחל. למרות שיטה זו שימשה לשילוב EdU ב Mms19 אובדן פונקציה (Mms19P)זחלי instar השלישי, זחלי Mms19P כנראה לא להאכיל כמו כמעט כל צבע כחול זוהה במעיים זחל (תוצאות שלא פורסמו). זחלי Mms19P מראים עיוותים התפתחותיים דרסטיים ובסופו של דבר נעצרים בשלב האינסטאר השלישי. זה עשוי איכשהו להשפיע על התנהגות ההזנה של זחלי instar השלישי ולהפוך את פרוטוקול האכלת EdU לא מתאים במקרים כאלה.
לאחר שלמד את הספרות הזמינה ועבד בהרחבה על התקינה של צעדים חיוניים, הוצעה גישה חלופית עבור EdU / pH3 תיוג כפול ב- Drosophila NBs, אשר אינו דורש האכלת EdU לזחלים. מחקר קודם השתמש כפול EdU / pH3 כתמים כדי לנתח את מחזור התא ב NBs, אבל לא הציג פרוטוקול מפורט4. זה מהווה משוכה מיותרת למעבדות המנסות ליישם שיטה זו. יתר על כן, הערכת התאימות של ריאגנטים שונים עם ערכת EdU וביצוע אופטימיזציה נוספת יכול להיות תהליך גוזל זמן. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב המכסה שילוב EdU במוחות זחלים ניתחו וחיסון עם נוגדנים נגד pH3, ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה כדי להקצות NBs לארבע קטגוריות נפרדות: שלב G0 / G1, שלב S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלב M. השלבים הזקוקים למיטוב מפורטים ועצות הניתנות לניתוח תמונה של ערכות נתונים גדולות. בנוסף, הקריאה EdU /pH3 ב- NBs מסוג פראי מנותחת ומושוות ל- Mms19P NBs, אשר דווחו לאחרונה כדי להראות עיכוב מחזור התא11.

<table><tbody><tr><td>fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td><td>Bloomington stock center</td><td>#15477</td><td>הכנסת אלמנט P באקסון השלישי של Mms19</td></tr><tr><td>&nbsp;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td><td>נוצר בבית</td><td></td><td>eGFP מתויג חלבון Mms19 מבוטא ברקע Mms19p</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington stock center</td> <td>#3605</td><td>מלאי מסוג פרא (w;+;+)</td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td></td><td></td><td>ראשוניים דילול</td></tr><tr><td>חולדה אנטי-מירנדה</td><td>Abcam</td><td>Ab197788</td><td>1/250</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-pH3</td><td>איתות תאים</td><td>9701</td><td>1/200</td></tr><tr><td><נוגדנים משניים>חזקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עזים נגד חולדות Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>112-165-167</td><td>1/150</td></tr><tr><td>עז נגד חולדות Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1/500</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A27034</td><td>1/500</td></tr><tr><td><חזק>מגיב / ערכה< / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount הרכבה בינונית</td><td>Polysciences Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שילוב Click-it EdU, Alexa Flour 647</td><td>Thermo Fischer</td><td>Scientific C10340</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA) שבר V</td><td>Merck</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fischer Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>חומר ניקוי לא יוני</td></tr><tr><td><חזק>תוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיג'י (Imagej)https://imagej.net/Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRISM</td><td>Graph pad</td><td>software גרסה 5</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft office</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר עם טבילה בשמן, 1.4 NA Plan-apochromat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקווה פולי/הר הרכבה בינונית</td><td></td><td></td><td>מסיס במים, לא פלואורסצנטי הרכבה</td></tr><tr><td>בינונית פיירקס 3 או 9 שקע זכוכית ספוט נייר</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>סינון Whatman</td></tr></tbody></table>

5-אתניל-2'-deoxyuridine/phospho-histone h3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים drosophila

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

In vivo ניתוח התקדמות מחזור התא מבוצע באופן שגרתי במחקרים על גנים המסדירים מיטוזה ושכפול DNA. 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) נוצל כדי לחקור התקדמות שכפול/ S-פאזה, בעוד נוגדנים נגד פוספו-histone H3 נוצלו כדי לסמן גרעינים מיוטיים ותאים. שילוב של שתי התוויות יאפשר סיווג של של שלב G0/G1 (שלב פער), S (שכפול) ו- M (מיטוטי) וישמש ככלי חשוב להערכת ההשפעות של נוקאאוטים גנטיים מיוטיים או מוטציות ריקות על התקדמות מחזור התא. עם זאת, ריאגנטים המשמשים לסימון תאים המסומנים על-ידי EdU אינם תואמים למספר תגי נוגדנים-פלואורסצנטיים משניים. זה מסבך חיסונים, שבו נוגדנים משניים ראשוניים ומתויגים משמשים לסימון תאי מיטוט חיוביים pH3. מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב לתיוג כפול של EdU ו- pH3 בתאי גזע עצביים זחל Drosophila, מערכת בשימוש נרחב כדי לחקור גורמים מיוטיים. בנוסף, פרוטוקול מסופק לניתוח וכימות תמונה כדי להקצות תאים מסומנים ב-3 קטגוריות נפרדות, של שלבים G0/G1, S, S>G2/M (התקדמות מ- S ל- G2/M) ושלבי M.

המוח הזחלי השלישי של Drosophila נעשה שימוש כמערכת מודל לחקר תהליכים תאיים והתפתחותיים בסיסיים9. במוקד המחקר הנוכחי היה להציג פרוטוקול לניתוח התקדמות מחזור התא ב- EdU- ו- pH3-שכותרתו NBs של אזור CB (איור 1). ה- CB NBs מחולקים לסוג I וסוג II, והם מציגים את תבנית החלוקה האסימטרית האופיינית9. כל סוג I חטיבת NB מייצר NB, אשר מסוגל התחדשות עצמית, ועוד GMC כי הוא נגזר על בידול9. לעומת זאת, סוג II NBs ליצור מעבר-מגביר, ...

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

בפרוטוקול זה, אנו לא רק מספקים הסבר מפורט על כל שלב של שילוב EDU וחיסון, אלא גם מסבירים רכישת תמונה, עיבוד תמונה, ומספקים כמה טיפים לניתוח ערכות נתונים גדולות. טכניקה זו מאפשרת הקצאת תאים בשלבי G1, S ו- M. זה יהיה שימושי במיוחד עבור ניתוח מחזור התא על מחקרים על מוטציות שאינן המשפיעות על גנים מיוטיים.היינו מצפים מאנשים להיאבק במשך חודשיים עד שלושה חודשים אם אין להם ידע או ניסיון קודם עם טכניקה זו. כדי להתחיל, להוסיף את מדיום הניתוח של שניידר או SM לשני שקעים רצופים של צלחת ספוט מבריק ולהוסיף PBS לדיכאון הבא. בעזרת זוג מלקחיים, בחרו זחלים נודדים של כוכב שלישי והניחו אותם על רקמה עם PBS כדי לנקות שאריות מזון זבובים.מניחים את הזחל בדיכאון עם PBS ואחריו דיכאון עוקב המכיל SM. לאחר מכן תחת מיקרוסקופ ניתוח, להשתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר שלושה רבעים של הגוף התחתון של הזחל. לאחר מכן לתפוס בעדינות את קרסי הפה זחל עם זוג אחד של מלקחיים ולהחזיק את הקיטור של הקצה השני עם זוג המלקחיים האחרים. להפוך את ראש הזחל מבפנים החוצה על ידי דחיפת קרסי הפה פנימה ובו זמנית קילוף את הרקמה בקצה השני.התבונן במוח הזחל עם דיסקים דמיוניים מחוברים. הסר רקמות אחרות המחוברות למוח ולהעביר את המוח לדיכאון העוקב לאחר מכן עם SM. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון EDU SM מיקרומולרי לדיכאון נוסף על צלחת Pyrex ודגר כ 5 עד 10 מוחות ניתחו בתמיסה זו במשך 2 שעות ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר קיבעון וחיסון להסיר PBST ולהוסיף את קוקטייל זיהוי EDU למוחות ניתחו.ואז לדגור אותם בטמפרטורת החדר בחושך על סירוס. לאחר 30 דקות, לשטוף את הדגימות פעמיים עם PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף בחושך. להכתמת DNA, הכינו 5 מיקרוגרם למיליליטר Hoechst 33342 פתרון.הסר PBST לאחר הכביסה השנייה ולהוסיף 500 microliters של פתרון Hoechst למוחות ניתחו, ולאחר מכן לדגור אותם בחושך. לאחר 10 דקות, להסיר את Hoechst לשטוף את הדגימות עם PBST במשך 10 דקות. הקש על הצינור על ספסל המעבדה ולתת למוח להתיישב.הסר PBST מהצינור, משאיר מאחור 50 עד 100 microliters. חותכים את הקצה של קצה מיקרופיפט 200 מיקרוליטר ולהשתמש בו כדי להעביר את המוח על שקופית זכוכית נקייה. הסר PBST גישה מהשקופית על-ידי החלקתה עם רצועות נייר סינון.אל תתנו לנייר הסינון לגעת במוח. שים טיפה של מדיום מסיס במים, לא פלואורסצנטי על המוח וכוון את המוח כך כבל העצבים הגחוני פונה למגלשה והאונות פונות כלפי מעלה. סדרו את המוח בקובץ אחד כך שיהיה קל יותר לדמיין את המוח באופן סדרתי.מניחים בעדינות פתק כיסוי על גבי המוח ודגר את השקופית למשך הלילה ב-2 עד 6 מעלות צלזיוס. מתוך תוכנת הרכישה בחר את המטרה 63 פעמים. שים טיפה של שמן טבילה על להחליק הכיסוי ממש מעל המוח רכוב כדי להקל על איתור הרקמה דרך העין.באמצעות ערוץ Hoechst 33342 נדוש, מצא את המוח דרך העין ולאחר מכן עבור למצב הרכישה בתוכנה. הגדר 4 ערוצים כדי לדמיין Hoechst 33342, אלקסה קומה 4 8 8, אלקסה קומה 5 6, 8, ואלכסה קומה 6 4 7. השתמש בכלי מסייע הצבע כדי להגדיר באופן אוטומטי את לייזרי העירור והפליטה שנבחרו.הגדר את שדה הראייה, כך שהוא מקיף את כל אונת המוח. צלם את כל הנפח של אונת המוח על ידי רכישת מס זה במרווחים 0.8 מיקרון זה מזה. אחסן את כל התמונות מהפעלת הדמיה בתבנית ספריה של Dot L I F.לניתוח תמונה, פתחו את פיג'י ולאחר מכן גררו ושחררו את קבצי ה-LIF בפיג'י. בחר דפדפן נתונים מהכרטיסיה תצוגת מחסנית והשתמש בערימה וירטואלית מהכרטיסיה ניהול זיכרון בתוסף תבניות ביולוגיות. שים לב לתמונה מרובת הערוצים המוצגת בתמונה J.Change צבע הערוצים מתוך שורת התפריטים, באמצעות הכלי תמונה, צבע וערוצים.ולנטר את מירנדה שכותרתו neuroblasts, המופיעים כתאים עגולים גדולים באזור המוח המרכזי. צייר אזור של עניין באמצעות הכלי אליפסה על כל neuroblast כדי למנוע לספור את neuroblast פעמיים. מתוך שורת התפריטים של התמונה J, בחר ניתוח, כלים ומנהל על ביצוע על ביצועים.סמן את כל הנוירובלסטים במקטע Z הנוכחי והקש T לאחר סימון כל תא. לאחר כל neuroblasts בסעיף Z הנוכחי מסומנים, לשנות את הערוצים pH3 ו EDU ולספור באופן ידני את מספר נוירובלסטים חיוביים EDU, נוירובלסטים חיוביים pH3, נוירובלסטים חיוביים EDU ו- pH3, נוירובלסטים לא מכתים עבור אף אחד מהסמן. חפש נוירובלסטים ומקטעי Z הבאים, מחק ROIs ישנים והוסף ROIs חדשים לספירת neuroblasts בערימות שונות.הכן גיליון אלקטרוני וחשב אחוזים של נוירובלסטים הקיימים בכל ארבע הקטגוריות עבור כל אונה. הכן גרף עמודות באמצעות תוכנת הגיליונות האלקטרוניים, המציג את נתוני מאגרים עבור אחוזים של neuroblasts בכל קטגוריה. נוירובלסטים מרכזיים במוח ממוחות זחלי הכוכב השלישי המסומנים במירנדה, EDU ו- pH3 מוצגים כאן.תאים הוקצו לשלבי G1/G0, S, SG2/M ו- M. בניתוח pH3 EDU, שיעור גבוה משמעותית של MMS19, אובדן נוירובלסטים פונקציה נמצא בשלב M לעומת neuroblasts סוג פראי. ביטוי MMS19:eGFP באובדן הרקע של הפונקציה MMS19 הציל את שיעור התאים בשלב M לרמות סוג פראי.חשוב לא להשתמש במוחות פגומים לצעדים הבאים. ופתרון אד צריך להיות מוכן טרי לפני תחילת ניתוחים. נכס זה יכול לשמש כמיון ראשוני מהיר כדי לזהות פגמים בשלבי מחזור תאים ספציפיים.לאחר מכן ניתן לעקוב אחר ניתוח מפורט יותר של שלב מסוים.

5-ethynyl-2-deoxyuridinephospho-histone-h3-dual-labeling-protocol-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

פרוטוקול לניתוח של מחזור תא...

ניתוח מחזור תא חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם

מנהל של שני אנלוגים של תימידין, edu וBrdU, בעכברים בהריון מאפשר הניתוח של התקדמות מחזור התא בעצבי ובתאים במוח העכבר העוברי. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את ההשפעות של מתח genotoxic, כוללים קרינה מייננת, בהתפתחות המוח.

התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור קו תאים של דרוזופילה S2 הרגיש למעכבי מולקולות קטנות של קינזין-5. מתואר גם השימוש בתאים אלה בבדיקת תיקון שגיאות מבוססת תאים.

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.

יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

למדו פרוטוקול תיוג כפול EdU/pH3 לניתוח מחזור התא בתאי גזע עצביים של Drosophila. השיטה מאפשרת זיהוי שלבים G1, S ו-M ומסייעת בחקר מוטציות המשפיעות על חלוקת תאים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

גלה סרטונים נוספים