פרופיל מרחבי של ביטוי חלבונים ורנ"א ברקמות: גישה לכוונון עדין של מיקרו-דיסקציה וירטואלית

פרוטוקול זה מסייע להנחות את בחירת אזורי העניין עבור טכנולוגיות omics מרחביות, מה שמאפשר אפיון ממוקד יותר של רקמות או אוכלוסיות תאים. פרוטוקול אוטומטי לבחירת ROI במבחני פרוטאומיקה הוא חזק יותר וניתן לשחזור מאשר פרוטוקולים ידניים, ושימוש ב- ROIs של 50 מיקרומטר עבור מבחני תעתיק מאפשר פרופיל של אוכלוסיות תאים ספציפיות. התחילו בתכנות ה-autostainer להפעלת נוגדנים להדמיה פלואורסצנטית.

בתוכנת הצבייט האוטומטי, לחץ על כפתור הבית ובחר פרוטוקולים. לאחר מכן לחץ על צור / ערוך פרוטוקולים ובחר גילוי RUO אוניברסלי כהליך. לחץ על רצף ראשון, ולאחר מכן בחר Deparaffinazation, ואחריו Depar v2.

עבור טמפרטורה בינונית, בחר 72 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לחץ על טיפול מקדים ובחר מיזוג תאים ומאגר CC1. עבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס, לאחר מכן לחץ על CC1 שמונה דקות, והמשך ללחוץ עד שתבחר CC1 64 דקות. לחץ על מעכב, לאחר מכן בחר מעכב גילוי, ועבור זמן דגירה, בחר שמונה דקות.

לאחר מכן לחץ על נוגדן, ואחריו דגירה של נוגדנים בטמפרטורה גבוהה. עבור טמפרטורה נמוכה, בחר 37 מעלות צלזיוס. עבור נוגדן, בחר את הנוגדן 6 מתווית המתקן.

עבור זמן דגירה פלוס, בחר 32 דקות. לחץ על Multimer HRP ולאחר מכן בחר חוסם משאבי אנוש של Multimer. לאחר מכן עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig.

ועבור זמן הדגירה, בחר ארבע דקות. לאחר מכן, ב- Multimer HRP Reagent, בחר OMap Anti-Rb HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן לחץ על Cy5, ועבור זמן דגירה ארוך, בחר שעת אפס, שמונה דקות.

לחץ על רצף כפול ובחר דנטורציה של נוגדנים. לאחר מכן בחר נוגדנים דנטורציה CC2-1, ולטמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס. ודא כי זמן הדגירה הוא שמונה דקות.

לאחר מכן, לחץ על מעכב DS ובחר נטרל. לחץ על נוגדן DS, ולטמפרטורה נמוכה מאוד, בחר 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ב-Antibody, בחר ANTIBODY 3 מתווית המתקן.

ועבור זמן דגירה פלוס, בחר 32 דקות. לחץ על תוכנית המענה ההומניטרי של DS Multimer ובחר חוסם משאבי אנוש של DS Multimer. לאחר מכן עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר ארבע דקות.

לאחר מכן, ב- Multimer HRP Reagent, בחר OMap anti-Ms HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן לחץ על DS Rhodamine 6G, ולזמן דגירה ארוך, בחר שעת אפס, שמונה דקות. לחץ על כתם משולש ובחר דנטורציה של נוגדנים TS, לאחר מכן בחר נוגדנים דנטורציה CC2-2, ועבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס.

ודא כי זמן הדגירה הוא שמונה דקות. לאחר מכן, לחץ על מעכב TS ובחר TS נטרול. לחץ על נוגדן TS, ולטמפרטורה נמוכה מאוד, בחר 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, ב-Antibody, בחר את הנוגדן 7 מתווית המתקן, ועבור זמן דגירה פלוס, בחר 32 דקות. לחץ על HRP Multimer TS ובחר חוסם HRP של TS Multimer. לאחר מכן עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר ארבע דקות.

לאחר מכן, ב-Multimer HRP Reagent, בחר OMap Anti-Rb HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן לחץ על TS FAM, ועבור זמן דגירה ארוך, בחר שעת אפס, שמונה דקות. לחץ על שמור והוסף כותרת לפרוטוקול.

בחר מספר פרוטוקול, הוסף הערה ולחץ על פעיל, ואחריו שמור. אופים בתנור חלקים של רקמות אנושיות משובצות פורמלין קבועות פרפין בתנור שגודלו 70 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 60 דקות. בזמן שהשקופיות נאפות, הדפס תוויות על-ידי לחיצה על צור תווית בתוכנת הצביעה האוטומטית.

לאחר מכן, לחץ על פרוטוקולים, בחר את מספר הפרוטוקול ולחץ על סגור / הדפס. הוסף מידע רלוונטי בתווית השקופית ולחץ על הדפס. מוציאים את השקופיות מהתנור ומניחים להן להתקרר לטמפרטורת החדר.

החל את תוויות הפרוטוקול שהודפסו בעבר על השקופיות המתאימות. העמיסו מכשירי נוגדנים הניתנים למילוי חוזר עם נוגדנים בהתאם למספרי תווית הנוגדנים. יש לדלל כל נוגדן בדילול שצוין ולהכין את מכשירי הנוגדנים הניתנים למילוי חוזר.

אסוף מכשירי ריאגנטים ממולאים מראש לחסימה, זיהוי והגברה והנח אותם על מגש הריאגנטים של המכשיר. טען שקופיות במגירות השקופיות ולחץ על הפעלה, ולאחר מכן על כן. אשר את תחילת הריצה על ידי בדיקת משך הריצה בתוכנת הסטיינר האוטומטי.

למחרת, הבטיחו את השלמת הריצה על ידי צפייה באורות מהבהבים ירוקים על חריצי מגירת השקופיות. לאחר מכן הסר את השקופיות מהמכשיר ושטוף את השקופיות במרץ במאגר תגובה של פי 1 עד שתמיסת ההחלקה של כיסוי נוזלי תוסר לחלוטין. החלף את SYTO 13 ב- SYTO 64 ב- 5, 000 ננומולר כדי לאפשר שילוב פלואורופור.

יש לדלל את SYTO 64 ב-1x TBS ולדגור בתא לחות למשך 15 דקות. השתמש ב- FITC עבור DISCOVERY Fam והגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה. השתמש ב- Cy3 עבור DISCOVERY Rhodamine 6G והגדר את החשיפה ל-200 אלפיות השנייה.

השתמש ב-Texas Red עבור SYTO 64 והגדר את החשיפה ל-50 אלפיות השנייה. ציין את SYTO 64 כערוץ המיקוד, ולבסוף, השתמש ב- Cy5 עבור DISCOVERY Cy5. הגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה ושמור שינויים.

אופים בתנור חלקים קבועים של כדורי פרפין משובצים בפורמלין ל-70 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 60 דקות. סרוק שקופיות על פלטפורמת יצירת הפרופילים המרחבית ובחר גדלים של 50 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר. פרוטוקול ההדמיה האוטומטי פותח על ידי הכללת פקדים חיצוניים כדי לאשר שלא היה דימום דרך הערוצים השכנים.

מפת החום של log 2 של כל הסמנים הכלולים בבדיקת הפרוטאומיקה המרחבית המשווה את פרוטוקול פאן-ציטוקרטין CD 45 הידני בשחור לפרוטוקול 3-plex האוטומטי באפור מראה ערך Spearman R של 0.88. מתוך 31 נוגדנים ששימשו במבחנים, 23 נוגדנים היו בעלי ערך ספירמן R גבוה או שווה ל-0.5. מפת החום של log 2 של מטרות נבחרות שנכללו בבדיקת התמלול המרחבי המשווה את פרוטוקול פאן-ציטוקרטין CD 45 הידני בשחור לפרוטוקול האוטומטי 3-plex באפור הראתה הבדלים בערכים אלה.

נתוני הרצף עבור פרוטוקול ההדמיה האוטומטית 3-plex הציגו ערכים נמוכים יותר בהשוואה לפרוטוקול ההדמיה הידנית pan-cytokeratin CD 45, המשתקף גם על ידי ערכי Spearman R הנמוכים של 0.15. כמו כן, אובדן של טווח דינמי נצפתה בעת שימוש בפרוטוקול החזותי האוטומטי 3-plex. הזיהוי של ROIs קטנים בפרוטוקול השעתוק המרחבי בוצע על ידי בחירה של אזורי עניין מעגליים בקוטר 50 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר ספירות RNA עבור מטרות נבחרות על קווי תאים שונים היו דומות בין שני אזורי גודל העניין לאחר הנורמליזציה.

פרוטוקול זה ללוחות הדמיה אוטומטיים יכול להיות מותאם על ידי חוקרים על ידי החלפת סמנים על מנת לפתח לוחות המגדירים במדויק ROIs כדי לענות על שאלות הפרוטאומיקה המרחבית שלהם.