בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

זוהי שיטה לבודד תאי לימפה הרחם מעכברים בהריון ולא בהריון. שיטה זו יכולה לשמש עבור יישומים במורד הזרם מרובים כגון פנוטיפינג FACS, מיון תאים, בדיקות פונקציונליות, RNA-seq, ופרוטומיקה. הפרוטוקול כאן מדגים כיצד פנוטיפ קבוצה 1 תאי לימפה מולדים הרחם על ידי ציטומטריית זרימה.

השיטה שלנו מאפשרת הערכה של הרכב ומאפיינים פונקציונליים של אוכלוסין לימפוציטים שונים הקיימים ברקמת הרחם של בעלי חיים בהריון ולא בהריון. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של לימפוציטים ברחם תוך שמירה על ביטוי פני השטח של חלבון, כדאיות התא ופונקציונליות. לכן הוא מתאים למגוון יישומים הבאים.

הסרת העובר בתחילת הניסוי ואיסוף לויקוציטים הם צעדים מאתגרים מבחינה טכנית. מכיוון שמדובר בניסוי ממושך, יש צורך בתשומת לב ומיקוד מסוימים ברגע שהגעתם לשלבי הכתמת הנוגדנים. כדי להתחיל, להעביר את רקמת הרחם שנקטפו מעכבר שחור C57 נקבה בהריון לתוך צלחת פטרי סטרילית, ולאחר מכן באמצעות מכשירים סטריליים בעדינות להסיר את השומן המקיף את הרקמה, תוך דאגה לא לתת לרקמה להתייבש.

הסר את העוברים על ידי ניתוח כל אתר השתלה עם מכשירים סטריליים, ולאחר מכן להחזיר את הרחם לצינור איסוף חמשמיליליטר המקורי שלה המכיל מיליליטר אחד של מדיה אוסף. באמצעות מספריים, לרכך את הרקמה בצינור האיסוף, ולאחר מכן למקם את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של תערובת עיכול אנזימטי מחומם מראש לצינור.

לדגור על הצינור במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם עצבנות כדי לשפר את פעילות העיכול אנזימטי. לאחר הדגירה הושלמה, מערבולת הצינור, ולשמור אותו על קרח כדי לעכב את הפעילות אנזימטית, ולאחר מכן להעביר את רקמת העיכול לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר שכותרתו כראוי. לשטוף את צינור איסוף חמישה מיליליטר עם סך של 10 מיליליטר של קר קרח חמישה מילימיליטר EDTA PBS פתרון כדי לאסוף את כל הרקמה הנותרת ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.

צנטריפוגה דגימת הרקמה המעוכלת במשך 10 דקות ב 400 פעמים G.להשליך את supernatant, בעדינות להעיף את הכדור, ולאחר מכן resuspended ב 10 מיליליטר של מראש מחומם חמישה מיליטר EDTA PBS פתרון. כדי להפחית את גושי התאים, לדגור על המדגם ב 37 מעלות צלזיוס עם עצבנות, ואחריו מערבולת על גבוה במשך 10 שניות. להסרת גושי תאים ברקמה לא מזווגת, הניחו מסננת 70 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר, ולאחר מכן באמצעות הבוכנה של מזרק סטרילי אחד מיליליטר סטרילי, כפה את הרקמה המעוכלת דרך המסננת לתוך הצינור.

לשטוף את המסננת מספר פעמים עם סך של 10 מיליליטר של PBS קר כדי לאסוף את כל התאים, ולאחר מכן לבלות את צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר במשך 10 דקות ב 400 פעמים G.לאחר השלכת supernatant, תאי הלימפה המולדים עשויים להיות מבודדים באמצעות אפשרות A או אפשרות B.For אפשרות A, resuspend הכדור בחמישה מיליליטר של 80%איזוטוני לכל שיחה באמצעות צינור voy. ואז באמצעות פיפטה voy על מהירות איטית, בזהירות שכבת שמונה מיליליטר, 40% לכל פתרון שיחה, על הכדור resuspended בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. פיפטה לאט וברצף, מחזיק את 15 מיליליטר לזווית של כ -45 מעלות.

מבלי להפריע שכבת העל, צנטריפוגה הצינור במשך 20 דקות ב 850 פעמים G עם תאוצה בינונית הפסקות מינימום בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה הושלמה, בזהירות להסיר את הצינור מן הצנטריפוגה מבלי להפריע שכבות לכל שיחה. לאחר מכן מבלי להפריע לטבעת הלוקוציטים בממשק של שני פתרונות השיחה, השתמש בצינור פסטר סטרילי כדי להשליך את כל למעט 0.5 עד מיליליטר אחד של שכבת השיחה העליונה.

תוך כדי ניסיון לשמור על כמות פתרון לכל שיחה נשאב לתוך פיפטה למינימום, בזהירות לאסוף את הטבעת של לויקוציטים, ולהעביר את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר חדש שכותרתו. הוסף 10 מיליליטר של מדיום RPMI סטרילי בתוספת 10% חום והפעיל FBS לתאים, ואז צנטריפוגות התאים במשך חמש דקות ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-טבעי והמשיכו לתסיסת תאי הדם האדומים.

כדי לבודד את התאים באמצעות אפשרות B, לאחר העברת הרקמה המעוכלת דרך מסננת התא וצנטריפוגה התוצאה בהשעיית תאים כפי שהודגם בעבר, resuspend הכדור עם שמונה מיליליטר של 35%איזוטוני לכל שיחה ומדיום RPMI, ולהעביר את התאים לתוך צינור 15 מיליליטר. צנטריפוגות הצינור ב 940 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תאוצה בינונית הפסקות מינימום. לאחר מכן באמצעות שאיפה או pipette voy, לשאוף supernatant בזהירות לפני שימוש חוזר את הכדור ב 14 מיליליטר של RPMI בינוני בתוספת עם 10% חום מופעל FBS.

צנטריפוגות הדגימה שוב במשך חמש דקות ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להשליך את supernatant על ידי שאיפה ולהמשיך תמוגה תא דם אדום. כדי ללתת את תאי הדם האדומים, resuspend המדגם בשלושה מיליליטרים של אחד X פתרון lysing תא דם אדום ודגרה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS לתוך המדגם כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגות הצינור ב 400 פעמים G במשך חמש דקות לאחר השלכת supernatant, להוסיף עוד 10 מיליליטר של PBS צנטרפוגציה חוזרת.

resuspend הכדור במיליליטר אחד של מדיום RPMI בתוספת עם 10% חום מומת FBS, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה בתא דרך מסננת תאים סטרילית 70 מיקרומטר. לאחר ספירת התאים להתאים את הריכוז של השעיית התא לאחד עד 2 מיליון תאים ב 100 microliters של PBS ולהמשיך ניתוח כתמים ו facs. קבוצת הרחם ILCs אחת כוללת תאי NK קונבנציונליים, תאי NK תושבי רקמות, וקבוצת ILCs אחת עם האחוזים שלהם משתנים במהלך החיים וההריון.

ניתן להפלות קבוצות משנה אלה באמצעות ציטומטריית זרימה על-ידי תחילה gating תאים על היכולת שלהם לפזר אור, לאחר מכן בידוד תקליטור יחיד לרכישה 45 תקליטור חיובי שלושה תאים שליליים CD 19 שלילי, ולאחר מכן זיהוי קבוצה אחת ILCs כי הם NK 1.1 ו NKP 46 חיובי. בתוך קבוצה אחת ILCs, CD49A EMs שלילי חיובי הם תאי NK קונבנציונליים. CD49A חיובי Ems תאים חיוביים הם תאי NK תושב רקמות.

ותאי EMS חיוביים CD49 הם קבוצה אחת רחם ILCs. כתמים של לימפוציטים טחול ורחם עם נוגדנים נגד NK P46 ו- NK 1.1 מראה כי לימפוציטים הטחול מבטאים כמויות גבוהות יותר של NKP 46 על פני השטח שלהם מאשר עמיתם הרחם. בניתוק רקמות אנזימטי, אפיטופים פני השטח ניתן לשנות בהתאם אנזימים המשמשים במדיום העיכול.

לדוגמה, כתמים עבור קולטן MHC CD49 NKG2A הוא עני כאשר נעשה שימוש בליברז TM. עם זאת, עיכול עם ליבראז DH משמר זיהוי NKG2A על ידי שיבוט נוגדנים 1611. כ-6.5% מהקבוצה הראשונה של ILCs הנמצאת בדגימות רקמת הרחם ביום ההיריון 8.5 נגזרות מדם.

ניתן להוציא מזהמי דם באמצעות כתמים תוך-וינטליים עם נוגדנים נגד CD45 הצטופפו עם פלואורוכרום. בעת הגדרת פגישות זמן, עליך לקחת בחשבון כי עכברים הם ליליים. לכן יש להגדירם מאוחר ככל האפשר אחר הצהריים, שכן ההזדווגות תתרחש במהלך הלילה.

גם בעת בחירת נקבות, עליך לוודא כי אין להם מחיצה בנרתיק. אנחנו בדרך כלל עושים ניתוח ציטומטריה זרימה להסתכל על חלבונים רבים בצד החיצוני של התאים ובתוך התאים. אנחנו גם עושים מיצוי חומצת גרעין כדי לחקור ביטוי גנים, כולל ריצוף RNA.

ואנחנו גם מצליחים לעקוף בדיקות תפקודיות כדי לחקור את התגובות של תאי לימפה מולדים ברחם.