Name: קביעת הרעילות של קרינת UV וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: למדו הערכת רעילות של קרינת UV וכימיקלים בתאי אפיתל קרנית אנושיים ראשוניים ואימורטליים. שיטה זו מאפשרת לחקור בטיחות מוצרים אופתלמיים ולהפחית שימוש בבעלי חיים במחקר טוקסיקולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים לא קיבלו מימון לעבודה זו.

1. תרבות של pHCECs ו- iHCECs
<ol><li>לגדל את pHCECs ו- iHCECs בתווך אפיתל עיני אנושי (HOEM) עם התוספים הבאים: 6 mM L-גלוטמין, 0.002% תוסף מדיה התאית O (טבלה של חומרים), 1.0 μM אפינפרין, 0.4% תוסף מדיה התאית P (טבלה של חומרים), 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין rh, 5 מיקרוגרם / מ"ל apo-transferrin, ו 100 ng / mL הידרוקורטיזון hemisuccinate ב collagen-1 מצופה צלוחיות תרבית (18 מ"ל ב 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית).</li>
	<li>שנה את התווך בצלוחיות כל 2-3 ימים על ידי הסרת התווך לאחר שהתאים גדלים ל~ 80% מפגש. מוסיפים תמיסת דיסוציאציה ללא פנול אדום ודוגרים על הבקבוק בטמפרטורה של 37°C עד לניתוק מלא של התאים. נטרל את תמיסת הדיסוציאציה עם DMEM/F12 עם סרום ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב 500 × גרם. הסר את המדיום supernatant והשהה מחדש את התאים בתווך HOEM.</li>
</ol>2. קביעת גודל התא באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
<ol><li>זרעו הן pHCEC והן iHCECs על צלחות פטרי מצופות קולגן עם כיסויים בתחתית זכוכית בריכוז של 1 × 105 עם 1 מ"ל של HOEM. לגדל pHCECs ו- iHCECs, קבוצה אחת של תרבויות במשך 24 שעות וקבוצה אחרת של תרבויות במשך 48 שעות, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.</li>
	<li>לאחר תקופת הדגירה, יש להכתים את התאים בתמיסת חיץ צביעה של 500 μL המכילה קלצאין (4 מיקרומטר), אתידיום הומדימר-1 (8 מיקרומטר) ואקספין V (5 מיקרוליטר ב-500 מיקרוליטר חיץ אלקסה פלואור 647 מצומד) למשך 20 דקות ב-37°C. לאחר צביעת התאים, התאימו את המיקרוסקופ ללכידת אורכי גל עירור/פליטה של 488/515 ננומטר עבור calcein-AM, 543/600 ננומטר עבור ethidium homodimer-1, ו-633/665 ננומטר עבור annexin V באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.</li>
	<li>השג את התמונות וצלם ערימות Z כדי להעריך את גודל התא בשלושה ממדים.<ol><li>כדי לקבל את התמונות הדו-ממדיות (2D) והתלת-ממדיות (3D), מצא את האזור לתמונה עם מטרת מים apochromat 40x/1.2. באמצעות לייזרים Argon (488) (סריקה ראשונה), HeNe1 (543) (סריקה שנייה ו-HeNe2 (633) (סריקה שלישית), סרוק בשלושה ערוצים נפרדים באמצעות מפצלי האלומה, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis ו-NFT 545 LP560, LP505.</li>
		<li>השתמש בסריקה רציפה מרובת רצועות כדי להפחית את הדיבור הצולב. הערה: LP505 משמש עבור ערוץ 2 עם לייזר 488 כדי ללכוד את הפליטה של צבע calcein. LP560 משמש בערוץ 3 עם לייזר 543 כדי ללכוד את הפליטה של אתידיום הומודימר 1. NFT 635 משמש עם לייזר 633 כדי ללכוד את הפליטה של נספח V. מטרת ה- HFT היא להפריד את אור העירור והפליטה. NFT מפצל אור על ידי החזרת אור < אורך גל מסוים לערוץ נפרד, תוך מתן אפשרות לאור > אורך גל מסוים עד לערוץ שני. מסנני LP חוסמים אורכי גל קצרים יותר מאורך הגל שצוין ומאפשרים לאורכי הגל הארוכים יותר לעבור.</li>
		<li>לתמונה בתלת-ממד, הגדירו את הקונפוקל ל-Z-stack וסרקו לפחות 20 מסגרות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. חשיפת תאים לקרינת UV
<ol><li>זרעו את התאים ב 5 × 104/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות ודגרו ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 3 שעות. לאחר תקופת הדגירה, להפחית את נפח המדיום בבארות ל 300 μL. לאחר מכן, חשוף את התאים לקרינת UV (הן UVA ב 6.48 W/m 2 והן UVB ב 1.82 W/m2 כאשר צינורות UVA ו- UVB מופעלים באינקובטור בו זמנית) באינקובטור 37 ° C למשך 5 ו -20 דקות בניסויים נפרדים.</li>
	<li>לאחר קרינת UV, להוסיף 200 μL של HOEM טרי לכל באר לדגור במשך 20 שעות ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, לאסוף את התא supernatant בכל באר ולהעביר אותו לתוך סטרילי 2 מ"ל צינורות פוליפרופילן. להקפיא ב -80 ° C. כדי לקבוע את רמות הציטוקינים המשתחררים על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול, השתמשו בבדיקת ציטוקינים מרובים ועקבו אחר הוראות הערכה כדי לכמת את ארבעת הציטוקינים הבאים: IL-6, IL-8, IL-1β ו-TNF-α.</li>
	<li>הוסף מגיב בדיקה מטבולית לתאים בבארות.</li>
	<li>הכן מגיב בדיקה מטבולית 10% ב- DMEM/F12. החלף את מדיום התרבית בכל באר עם 1 מ"ל של תמיסת הבדיקה המטבולית 10% ודגר ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 4 שעות.</li>
	<li>מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי באורכי גל עירור/פליטה של 530/590 ננומטר.</li>
</ol>4. חשיפה של תאים לרעלים כימיים
<ol><li>תאי זרע ב 5 × 104/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 3 שעות. לאחר תקופת הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים ל -1 מ"ל של רעלים כימיים (BAK 0.001%, H 2 O20.01%, ו- SDS 0.0025% במי מלח חוצצי פוספט (PBS)) למשך 5 ו -15 דקות.</li>
	<li>לאחר חשיפה לרעלים הכימיים, להסיר את הרעלים מן הבארות, לשטוף עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, בצע בדיקה מטבולית על ידי החלפת המדיום עם 1 מ"ל של תמיסת בדיקה מטבולית 10% ודגרה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות רב-באר פלואורסצנטי באורכי גל עירור/פליטה של 530/590 ננומטר.</li>
	<li>מעבירים את הסופרנאטנטים של התא מהבארות לאחר הדגירה של 20 שעות לצינורות פוליפרופילן סטריליים נפרדים של 2 מ"ל ומקפיאים ב -80 מעלות צלזיוס. כמת ציטוקינים ששוחררו על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לכימיקלים. השתמש באותה פלטפורמת מולטיפלקס המשמשת להערכת הציטוקינים מהתאים שטופלו ב- UV. השתמש בבדיקת ציטוקינים מרובים בהתאם להוראות הערכה כדי לכמת את ארבעת הציטוקינים הבאים: IL-6, IL-8, IL-1β ו- TNF-α.</li>
</ol>5. בדיקת תאים שנחשפו לריכוזים שונים של BAK
<ol><li>זרע תאים ב 1 × 10 5/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות לדגור ב 37 ° C עם5% CO2 במשך 24 שעות. לאחר תקופת הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים ל -1 מ"ל של רעלים כימיים (BAK 0.001%, BAK 0.005% ו- BAK 0.01% ב- PBS) למשך 5 דקות.</li>
	<li>לאחר החשיפה, להסיר את הרעלים הכימיים, לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, יש לצבוע את התאים ב-500 μL של תמיסת חיץ צביעת אנקסין המכילה קלצאין (4 מיקרומטר), אתידיום הומודימר-1 (8 מיקרומטר) ואקספין V (5 מיקרוליטר ב-500 מיקרוליטר חיץ אלקסה פלואור 647 מצומד) למשך 20 דקות ב-37°C. כוונן את המיקרוסקופ למדידת עוצמות של צביעת נספח V, calcein AM ו-ethidium-1 באורכי גל עירור/פליטה של 630/675 ננומטר, 495/515 ננומטר ו-528/617 ננומטר, בהתאמה. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>בצע בדיקת נורמליות ובדיקה לשונות שווה לפני ביצוע ניתוח שונות (ANOVA), Welch ANOVA או מבחן Kruskal-Wallis. השתמש במבחן הפוסט-הוק המתאים להשוואה בין כל קבוצה שנבדקה. הגדר p < 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
<li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal%2C+lens%2C+and+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li>
<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li>
<li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span%3A+in+vitro+model+for+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li>
<li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li>
<li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li>
<li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li>
<li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li>
<li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li>
<li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li>
<li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li>
<li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).</li>
<li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase%3A+PP2A+structural+importance%2C+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li>
<li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation%2C+migration%2C+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+nvestigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li>
<li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li>
<li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li>
<li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li>
<li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection%3A+a+review+of+the+current+and+future+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li>
<li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li>
<li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132(2006).</li>
<li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li>
</ol>

המחבר, לינדון ו. ג'ונס, במהלך 3 השנים האחרונות, באמצעות CORE, קיבל תמיכה במחקר או הרצאות כבוד מהחברות הבאות: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage ו- Visioneering. לינדון ג'ונס הוא גם יועץ ו/או מכהן בוועדה מייעצת עבור Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis ו-Ophtecs. למחברים האחרים אין מה לחשוף.

הוערכו הבדלים פוטנציאליים בשימוש בשני סוגים של HCEC. התאים מוקמו באותו תווך (HOEM) בריכוזים זהים של תאים ולאחר מכן נחשפו לפרקי זמן קצרים וארוכים של קרינת UV ושלושה רעלנים עיניים. מינונים של קרינת UV וכימיקלים נבחרו על סמך ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם, שהיו מזיקות מספיק לתאים כדי לייצר תגובות ביניים שניתן להשוות. זמני חשיפה של 5 ו-20 דקות לקרינת UV ו-5 ו-15 דקות למינונים שנבחרו של BAK (0.001%), SDS (0.0025%) ו-H 2 O2(0.01%) היו זמני חשיפה אידיאליים וריכוזים שהראו תגובות שונות באופן משמעותי בין התאים לבי...

מחקרי טוקסיקולוגיה חוץ גופית מבוצעים כדי לחזות את ההשפעות הרעילות של כימיקלים וחומרים אחרים שיכולים לגרום נזק לתאים. בהערכת רעילות לקרנית, תאי אפיתל של הקרנית האנושית (HCECs) שימשו במודלים להערכת השפעות אלה 1,2,3,4. מודלים אלה בדרך כלל מעריכים השפעות פיזיולוגיות כגון שינויים בפעילות המטבולית של התא, התפשטות תאים, ותפקודי תאים אחרים כגון ייצור ושחרור של ציטוקינים דלקתיים. עבור מחקרים טוקסיקולוגיים אלה, תאים ממקורות שונים נבחרו כדי להעריך את ההשפעות המזיקות של כימיקלים וקרינת UV על HCECs 2,3. קווי pHCEC זמינים מחברות המספקות תאים אלה מרקמות תורם של מבוגרים. תאים ראשוניים ניתן לטפל עם dispase בעדינות לגרד את הקרנית עבור תרבית5. התאים נבדקים לאחר מכן עבור וירוסים וזיהום ולאחר מכן נשלח cryopreserved ב 10% dimethyl sulfoxide.
היתרון של קווי תאים ראשוניים הוא שהתאים זהים גנטית לתאי התורם. זה אידיאלי, כמו מודל in vitro צריך לחקות את רקמת in vivo ככל האפשר. החיסרון של קווי תאים ראשוניים הוא שיש להם מספר מוגבל של חלוקות תאים או מעברים6. מספר התאים המוגבל הזמין מגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע בתרבית ראשונית אחת, ומייקר את עלות הניסויים.
קווי תאים אימורטליים שימשו גם במודלים של רעילות תרביות תאים. עם זאת, בניגוד לקו התאים הראשוני המתקבל מרקמת in vivo, קו התאים האימורטלי השתנה גנטית. תאים אימורטליים נוצרים על ידי שילוב גנים של וירוס בדנ"א של תאים ראשוניים 6,7,8. תאים עם שילוב מוצלח של גנים נגיפיים נבחרים לקו התאים האימורטלי. היתרון של אימורטליזציה הוא שהיא מאפשרת התפשטות מהירה ללא הגבלת זמן, ומספקת מספר בלתי מוגבל של תאים לביצוע ניסויים מרובים באמצעות אותו קו תאים. זה מאפשר עקביות בין ניסויים ומפחית את העלות.
בנוסף לשינויים בגנים שהגבילו את התפשטות התאים, שינויים בביטוי גנים בעלי פונקציונליות קריטית יכולים להתרחש גם9. לכן, החיסרון בשימוש בתאים אימורטליים הוא שהם עשויים כבר לא לייצג את תאי in vivo המקוריים מבחינת התגובה שלהם לגירויים חיצוניים שונים10. ההשוואות כללו התבוננות בהשפעות הרעילות של כימיקלים על קרטוציטים ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית11, כמו גם HCECs אימורטליים ותאים ראשוניים של אפיתל קרנית ארנבת12. ההשוואה בין ההשפעות של רעלים על קרטוציטים אנושיים ראשוניים לבין קרטוציטים אלמותיים לא הראתה הבדלים משמעותיים11. באמצעות השיטות המפורטות במאמר זה, תיקבע היעילות של בדיקות אלה להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלני עיניים על pHCECs ו- iHCECs.
נבחרו שלושה רעלנים עיניים הנפוצים בבדיקות מבחנה: BAK, H 2 O2ו- SDS. BAK הוא חומר משמר קטיוני הנפוץ בתמיסות עיניים 13,14, H 2 O2משמש בדרך כלל לחיטוי עדשות מגע 15, ו-SDS הוא חומר פעילי שטח אניוני המצוי בדטרגנטים ושמפו 14. בדומה לרעלני עיניים, קרינת UV יכולה גם לגרום נזק משמעותי ל- HCECs3. בנוסף, חשיפת יתר לקרינת UV עלולה לגרום למצב עיני המכונה פוטוקרטיטיס המאופיין בתסמינים של קריעה, רגישות לאור ותחושת גרגריות16.
יש מספר בלתי מוגבל של תרביות תאים ראשוניות שניתן להשתמש בהן וקווי תאים אימורטליים שונים שפותחו. לכן, נערך מחקר כדי להשוות HCEC ראשוניים לקו HCEC אימורטלי כדי לקבוע דמיון והבדלים בין מודלים המשלבים סוגים אלה של תאים.
מחקר זה השתמש במיקרוסקופ כדי להעריך הבדלים אפשריים בין pHCECs ו- iHCECs על התגובה הפיזיולוגית של התא לקרינת UV ורעלנים. כמו כן נבדקו ההשפעות של קרינת UV וכימיקלים על הפעילות המטבולית של התא ושחרור ציטוקינים דלקתיים עבור שני קווי התא. החשיבות של קביעת ההבדלים בין שני קווי התאים היא להבין את השימוש המיטבי בקווי תאים אלה להערכה: 1) ההשפעה של קרינת UV על תאים, 2) ההשפעות של רעלים על תאים, 3) השינויים הנובעים מכך בחילוף החומרים, בכדאיות התא ובשחרור ציטוקינים בתאים למחקרים עתידיים.

<table><tbody><tr><td>75 ס"מ2 קורנינג בקבוק מאוורר</td><td></td><td>354485</td><td>זהו המותג BioCoat, מצופה קולגן</td></tr><tr><td>96 צלחת</td><td>באר costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Staining Buffer Solution</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, מיקרוסקופ קנדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי Zeiss 510 מערכת</td><td>Carl Zeiss Inc., גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 48 צלחות באר</td><td>קורנינג</td><td>354505</td><td>זהו המותג BioCoat, מצופה קולגן</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>יכול לקרוא פלואורסצנטיות מ-280 - 700 ננומטר (לבדיקה 540/590)</td></tr> <tr><td>היקון</td><td></td> <td>סרום בקר עובריSH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי תחתית זכוכית</td><td>תאגיד MatTek, אשלנד, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי אפיתל קרנית אנושיים</td> אוניברסיטת <td>אוטווה</td><td>N/A</td><td>SV40 אימורטליים תאי אפיתל קרנית אנושיים מד"ר מ. גריפית (מכון מחקר העיניים של אוטווה, אוטווה, קנדה) ואופיינו גריפית M, אוסבורן R, מונגר R, שיונג X, דוילון CJ, לייקוק NL, חכים M, סונג Y, ווטסקי MA. מקבילות קרנית אנושיות פונקציונליות הבנויות מקווי תאים. מדע. 1999;286:2169-72.</td></tr><tr><td>אמצעי אפיתל עיניים אנושי (HOEM) עם התוספים הבאים:</td><td>Millipore, Billerica, MA, ארה"</td>ב <td>SCMC001</td><td>Epigro Base Media בתוספת 6 מ"מ L-גלוטמין, 0.002% EpiFactor O (תוסף מדיה תאית O במאמר) , 1.0 &mu; M אפינפרין, 0.4% אפיפקטור P (תוסף מדיה תאית P במאמר), 5 &mu; g/mL rh אינסולין, 5 &mu; גרם/מ"ל אפו-טרנספרין, ו-100 ננוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון המיסוקצינט בצלוחיות תרבית מצופות קולגן-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, ארה"ב).</td></tr><tr><td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td><td>Rockville, MD, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td><td>Rockville, MD, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>ריכוז פי 100 אז הוסף 1 מ"ל לכל 99 מ"ל של מדיה</td></tr><tr><td>תאי אפיתל ראשוניים בקרנית</td><td>Millipore, Billerica, MA, ארה"ב</td><td>SCCE016</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות פלואורסצנטי SpectraMax רב בארות</td><td>מכשירים מולקולריים, Sunnyvale, CA, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (פתרון ניתוק תאים)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת הרעילות של קרינת uv וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

מאמר זה מתאר את השיטות למדידת הרעילות של קרינה אולטרה סגולה (UV) ורעלנים עיניים על תרביות תאי אפיתל ראשוניים (pHCEC) ומונצחים (iHCEC). התאים נחשפו לקרינת UV ולמינונים רעילים של בנזלקוניום כלוריד (BAK), מי חמצן (H 2 O2) וסודיום דודציל סולפט (SDS). הפעילות המטבולית נמדדה באמצעות בדיקה מטבולית. שחרור ציטוקינים דלקתיים נמדד באמצעות אינטרלוקין רב-תכליתי (IL)-1β, IL-6, IL-8 ובדיקת גורם נמק גידולי אלפא (TNF-α), והתאים הוערכו לכדאיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים.
ההשפעות המזיקות של UV על פעילות מטבולית של תאים ושחרור ציטוקינים התרחשו ב -5 דקות של חשיפה לקרינת UV עבור iHCEC ו -20 דקות עבור pHCEC. ירידות באחוזים דומים בפעילות המטבולית של iHCEC ו-pHCEC התרחשו לאחר חשיפה ל-BAK, H 2O2 או SDS, והשינויים המשמעותיים ביותר בשחרור ציטוקינים התרחשו עבור IL-6 ו-IL-8. מיקרוסקופיה של תאים שנחשפו ל-iHCEC ו-pHCEC שנחשפו ל-BAK עם כתמים פלואורסצנטיים הראתה מוות תאי בחשיפה של 0.005% ל-BAK, אם כי מידת צביעת האתידיום הייתה גדולה יותר ב-iHCEC מאשר ב-pHCECs. באמצעות שיטות מרובות להערכת השפעות רעילות באמצעות מיקרוסקופיה, הערכות של פעילות מטבולית וייצור ציטוקינים, ניתן לקבוע את הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים הן עבור קווי תאים ראשוניים והן עבור קווי תאים אימורטליים.

גודל תא HCECs הראשוניים והמונצחים הודגמו באמצעות שלושה צבעים פלואורסצנטיים, המשקפים שלושה שלבים שונים של קיום התא. תאים חיים הם ירוקים (calcein-AM), תאים מתים הם אדומים (ethidium homodimer-1), ותאים אפופטוטיים הם צהובים (annexin V-מחשב מותאם צבע עבור הדמיה טובה יותר של אות פלואורסצנטי). תאים חיים מכילים אסטראזות בציטופלסמה של התא וממירים קלצאין-AM לקלצאין. לתאים מתים יש קרומי תאים חדירים לאתידיום הומודימר-1. לתאים אפופטוטיים יש כתמים בקרום התא מכיוון שפוספטידיל-סרין מועבר לקרום החיצוני.
<p class="...

מאמר זה מתאר את ההליכים המשמשים להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים בקו תאים ראשוני ואימורטלי.

קביעת הרעילות של קרינת UV וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך במבחנה את הרעילות של ניסוחים חדשים של מוצרי עיניים. על ידי זיקוק ריכוזי כימיקלים ופורמולציות מוצרים באמצעות תאי עין במבחנה, ניתן למזער את השימוש בבעלי חיים להערכת בטיחות מוצרים חדשים. בדיקות In vitro מעריכות נקודות קצה רעילות שלא ניתן להעריך in vivo, כגון קביעת ההשפעה של כימיקל על תפקוד המיטוכונדריה, שלמות קרום התא ופעילות האנזים.הערכת רעילות תאים במבחנה היא המפתח להבנת מנגנונים פוטנציאליים של רעילות. זה חיוני לקביעת מינון נסבל מקסימלי של כימיקלים טיפוליים בעין. מי שידגים את ההליך יהיה ניג'אני נאגארודקומרן, חוקר ממעבדת ג'ונס.התחילו בהנחת pHCEC ו-iHCECs על צלחות פטרי מצופות קולגן עם כיסוי תחתון מזכוכית בריכוז של 1 x 10 עד ה-5 עם מיליליטר אחד של אפיתל עיני אנושי בינוני, או HOEM. לגדל pHCECs ו- iHCECs קבוצה אחת של תרביות במשך 24 שעות וקבוצה נוספת במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, מכתימים את התאים בתמיסת חיץ צביעה של 500 מיקרוליטר המכילה 4 קלצאין מיקרומולרי, 8 מיקרומולרי אתידיום הומודימר 1 ואנקטין 5 למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר צביעת התאים, התאימו את מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי כדי ללכוד את אורכי גל העירור והפליטה, כמתואר בכתב היד של הטקסט. השג את התמונות הדו-ממדיות והתלת ממדיות בהתאם להוראות בכתב היד. זרעו את התאים בגודל 5X10 עד 4 למיליליטר של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות.לאחר הדגירה, להפחית את נפח המדיום בבארות ל 300 מיקרוליטר. לאחר מכן, חשפו את התאים לקרינת UVA ב-6.48 וואט למ"ר, וקרינת UVB ב-1.82 וואט למ"ר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ו-20 דקות בניסויים נפרדים. לאחר קרינת UV, יש להוסיף 200 מיקרוליטר של HOEM טרי לכל באר ולדגור במשך 20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.למחרת, לאסוף את supernatant התא בכל באר ולהעביר אותו לתוך צינורות פוליפרופילן סטרילי 2 מיליליטר. מקפיאים את הסופרנאטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את רמות הציטוקינים המשתחררים על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול, השתמשו בבדיקת ציטוקינים מרובים ועקבו אחר הוראות הערכה כדי לכמת אינטרלוקין 6, אינטרלוקין 8, אינטרלוקין-1 בטא ו-TNF-אלפא.הכן מגיב בדיקה מטבולית 10% ב- DMEM ו- F12. החלף את מדיום התרבית בכל באר במיליליטר אחד של תמיסת הבדיקה המטבולית 10% ודגר ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי באורכי גל עירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר.תאי זרעים בגודל 5X10 עד הרביעי למיליליטר HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולחשוף את התאים 1 מיליליטר של רעלים כימיים, הכוללים 0.001% benzalkonium כלוריד, או BAK, 0.01% מי חמצן, ו 0.0025% נתרן דודציל סולפט ב PBS במשך 5 ו 15 דקות.לאחר חשיפה לרעלים הכימיים, הסר את הרעלים מהבארות, שטוף עם 1 מיליליטר של PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, בצע בדיקה מטבולית על ידי החלפת המדיום עם 1 מיליליטר של תמיסת בדיקה מטבולית 10% ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי בעירור של 530 ננומטר, ובאורכי גל של פליטה של 590 ננומטר.מעבירים את הסופרנאטנטים התאיים מהבארות לאחר הדגירה של 20 שעות לצינורות פוליפרופילן סטריליים נפרדים של 2 מיליליטר ומקפיאים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש באותה פלטפורמת מולטיפלקס המשמשת להערכת הציטוקינים מהתאים שטופלו ב- UV בהתאם להוראות הערכה לכימות אינטרלוקין 6, אינטרלוקין 8, אינטרלוקין-1 בטא ו- TNF-אלפא. זרעו תאים בגודל 1X10 עד 5 למיליליטר של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.לאחר הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים למיליליטר אחד של רעלים כימיים, כולל 0.001% BAK, 0.005% BAK ו- 0.01% BAK ב- PBS למשך 5 דקות. לאחר החשיפה, להסיר את הרעלים הכימיים, לשטוף את הבארות עם 1 מיליליטר של PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות דגירה, יש לצבוע את התאים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת חיץ מכתימה של אנקסין המכילה קלצאין, אתידיום הומדימר ואנקטין 5 למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.כוונן את המיקרוסקופ למדידת עוצמות באורכי גל עירור ופליטה של 630 ו-675 ננומטר עבור נספחים 5, 495 ו-515 ננומטר עבור calcein AM, ו-528 ו-617 ננומטר עבור צביעת אתידיום 1. לאחר מכן לרכוש תמונות של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ה- iHCECs נמצאו כתאים קטנים בטווח של 10 עד 20 מיקרומטר וה- pHCECs היו בטווח של 20 עד 50 מיקרומטר לאחר 24 שעות של גידול.הבדלים דומים בטווח הגדלים נצפו עבור iHCECs ו- pHCECs לאחר 48 שעות של צמיחה. בהשוואה לתאים שאינם חשופים לקרינת UV, הפעילות המטבולית של pHCECs מוקרנים הופחתה באופן משמעותי לאחר 20 דקות של חשיפה. עבור iHCECs, הפעילות המטבולית ירדה עבור תאים שהוקרנו הן 5 ו 20 דקות.לכן, לקח זמן חשיפה ארוך יותר כדי להפחית את הפעילות המטבולית של pHCECs מאשר iHCECs. שחרור הציטוקינים המרבי על ידי iHCECs היה 5 דקות של חשיפה לקרינת UV. שחרור הציטוקינים המרבי עבור pHCECs התרחש לאחר 20 דקות של חשיפה לקרינת UV.במונחים של הכמויות הכוללות של ציטוקינים דלקתיים ששוחררו, pHCECs שחררו הרבה יותר אינטרלוקין-1 בטא, אינטרלוקין 8 ו-TNF-אלפא מאשר iHCECs, ואילו iHCECs שחררו יותר אינטרלוקין 6. גם pHCECs וגם iHCECs הראו שינוי בשחרור אינטרלוקין 6 לאחר חשיפה לכל שלושת הכימיקלים. BAK גרם לירידה בשחרור אינטרלוקין 6 בהשוואה לביקורת עבור HCEC ראשוניים ומונצחים כאחד.מי חמצן גרמו לעלייה בשחרור אינטרלוקין 6 מ- iHCECs, ולירידה בשחרור מ- pHCECs. גם pHCEC וגם iHCECs ניזוקו באופן משמעותי ב-0.005% וב-0.1% של BAK. לאחר ביצוע הערכות חוץ גופיות של רעילות תאי העין, ניתן לבצע מודלים נוספים של רעילות עינית בבעלי חיים כדי לקבוע את ההשפעה של מוצר עיני על עצבי הקרנית או על מערכת החיסון העינית.טכניקות אלה חיוניות לקביעת המנגנונים של רעילות כימיקלים ופורמולציות מוצרים על העין ויסייעו למזער את השימוש בבעלי חיים לניסויים בפיתוח מוצרים.

determining-toxicity-uv-radiation-chemicals-on-primary-immortalized

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר בדיקה פלואורומטרית במבחנה להערכת ההשפעות של פורמולציות דמעות מלאכותיות על הפעילות המטבולית התאית של תאי אפיתל בקרנית באמצעות תמיסת Alamar blue מבוססת רזזורין. נוסחה לא רעילה שומרת על התאים במצב בריא, פעיל מטבולית, מה שמקל על הפחתת resazurin לתוך resorufin פלואורסצנטי מאוד.

alamarBlue Assay: שיטה פלואורומטרית רגישה לסינון ההשפעות ציטוטוקסיות של פורמולציות דמעות מלאכותיות על הפעילות המטבולית של תאי אפיתל בקרנית אנושיים

אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד - ו chloropicrin-induced פציעה אפיתל הקרנית.

תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה שני שלבים המבדילים הקרנית תאי גזע limbal אפיתל מתאי גזע pluripotent האנושי בתנאים ללא תא תרבות קסנו - ולא מזין. השיטות התרבות התא המוצג כאן מאפשרים חסכוניים, בקנה מידה גדול ייצור תאי איכות קליניים, החלים על שימוש טיפול תאי הקרנית.

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי הסימולטני של מינים חמצן תגובתי (ROS), תאים חיים, ותאים מתים בתרבויות הראשיות חי מפני העכבר משטח העינית תאים. 2 ', 7 '-diלורופלוט אצטט, propidium יודיד, וכתמים הופסט משמשים כדי להעריך את רוס, תאים מתים, ותאים חיים, בהתאמה, ואחריו הדמיה וניתוח.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך אם ניסוחים מלאכותיים שונים של קרע יכולים להגן על תאי אפיתל הקרנית האנושיים מפני התייבשות באמצעות מודל במבחנה. לאחר חשיפה לניסוחים מלאכותיים של קרעים והתייבשות, תאי אפיתל הקרנית האנושיים מוערכים לפעילות מטבולית.

ההשפעה של ניסוחים דמעה מלאכותית על הפעילות המטבולית של תאי אפיתל הקרנית האנושית לאחר חשיפה להתייבשות

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

פיתחנו מודל חולדה של דלקת קרנית חמורה באמצעות גרידת אפיתל בקרנית בשילוב עם תפרים בקרנית. המחקר העריך דפוסי דלקת בקרנית, התפשטות אפיתל ושינויים בתאי גזע לימבליים בתנאים דלקתיים.

ביסוס מודל דלקת קרנית חמורה בחולדות המבוסס על גרידת אפיתל בקרנית בשילוב תפרי קרנית

תרבית איברים של קרנית חזיר ex vivo וריפוי פצעי אפיתל מספקים אמצעי חסכוני, אתי, ניתן לשחזור וכמותי לבדיקת רעילות העין של כימיקלים. הם גם מסייעים בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות אפיתל ותיקון רקמות, ובהערכת טיפולים לטיפול בקרטופתיה סוכרתית ובריפוי פצעים מאוחר.

הערכת רעילות טיפולית וכימית באמצעות קרניות חזיר בתרבית איברים וריפוי פצעי אפיתל

כאן אנו מתארים את שיטת מפורט לגידול העיקרי בתאים אנושיים אפיתל הסימפונות מ explants של רקמה אנושית דרכי הנשימה הסימפונות כולל גידול הבדיל על ממשק אוויר נוזלי. שיטה זו מספקת מקור שופע של תאים ראשוניים על חקירת תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה בריאות מחלת ריאות האדם.

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

למדו הערכת רעילות של קרינת UV וכימיקלים בתאי אפיתל קרנית אנושיים ראשוניים ואימורטליים. שיטה זו מאפשרת לחקור בטיחות מוצרים אופתלמיים ולהפחית שימוש בבעלי חיים במחקר טוקסיקולוגי.

קביעת הרעילות של קרינת UV וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית

גלה סרטונים נוספים