הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

הפרוטוקול שלנו מציג שתי גישות, כימות תנועת C.elegans. שיטות אלה להעריך פנוטיפים תנועתיות כגון אלה המוצגים על ידי מודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב, או ALS. הפחתת הקטר הרדיאלית היא שיטה חסכונית וקלה לזיהוי זחילה על משטח מוצק.

ה-Swimming Assay משתמש במעקב מבוסס מחשב לגילוי לא משוחד של תנועות חבטות בנוזל. שיטות אלה שימושיות לכימות הבדלי תנועה ב- C.elegans. למרות שאנו לומדים ALS, הם יכולים לשמש עבור כל זן עם תנועתיות שונה.

הפוך את לוחות ההסתה של NGM. ולסמן את התחתית עם מזהה לזני C.elegans שיש לתייג. הפוך נקודה קטנה עם הסמן במרכז הצלחת ההפוכה.

תוך כדי עבודה עם מיקרוסקופ מנתח, העבר תולעים למרכז צלחת ה- assay. ותקבע שעון שעון במשך 30 דקות. מניחים את המכסה בחזרה על הצלחת ומניחים אותו בצד.

ממשיכים להעביר תולעים עד שכל הזנים נמצאים על לוחות ההסתה המיועדים. לאחר 30 דקות, להתחיל להבקיע את הצלחת הראשונה על ידי הסרת המכסה והנחת הצלחת עם הפנים כלפי מטה תחת המיקרוסקופ הניתוח. כוונן את מוקד המיקרוסקופ עד שכל התולעים ייראות דרך האוגר.

באמצעות עט קצה לבד בצבע אחר מנקודת המרכז, שים נקודה קטנה במיקום של כל תולעת. בדוק את קצה הצלחת כמו כמה תולעים עלולות בסופו של דבר שם. כמו כן, לספור ולתעד כמה תולעים לא זזו מנקודת המרכז.

מדוד את המרחק מנקודת המרכז לסימוני המיקום הסופיים עבור כל תולעת, ותיעד את המרחק באמצעות סרגל. נקודת התולעת הראשונה מסומנת בלוח דש. תעד נתוני אורך עבור כל נקודה ברציפות על-ידי סיבוב הלוח בצורה בכיוון השעון.

פתח את התוכנה המשויכת כדי להגדיר ולהקליט את סרטוני הווידאו. לחץ על סמל לכידת הווידאו. לחץ על ידית העמעום וסובב אותה בכיוון השעון כדי לכוונן את האור.

בחלון לכידת הווידאו, לחץ על כרטיסיית ההגדרות והתאם את מצב הווידאו 2456x2052_Mono8, קצב הפריימים ל- 14, פלט כמונוכרום. חשיפה של 0.00300 שניות. רווח ל-1 די.בי.

גמא לאחד. ותסובב ל-180. חזור לכרטיסיה לכידה, בחר את תיקיית ההקלטה והקצה שם קובץ על-ידי הזנתו לתיבת הטקסט של קידומת הקובץ.

הגדר הגדרות לכידה אחרות כגון מאגר, ל- 128 מסגרות ומשך דקה אחת. הנח את צלחת בדיקת ה- assay מוארת על במת המכשיר ומרכז אותה במסך לכידת הווידאו ולאחר מכן הסר את המכסה. השתמש micropipette לשטוף כ 50 תולעים ב 1 מ"ל של M9 על צלחת בדיקות.

מערבבים בעדינות את הצלחת כדי להביא את בעלי החיים למרכז, או להשתמש micropipette להוסיף כמה טיפות של M9 כדי להפריד את בעלי החיים. הגדר טיימר במשך 60 שניות כדי לאפשר לתולעים להתאקלם לשחייה. התאם את ידית האור כך שהצג יהיה בהיר ככל האפשר ללא חשיפת יתר.

כוונן ידנית את מוקד המצלמה על-ידי הפיכת טבעת המיקוד על גוף העדשה של המצלמה, תוך כדי צפייה בתצוגה. לאחר 60 שניות לחץ על לחצן הרשומה, בחר את הלחצן הראשון בתפריט זרימת העבודה ייבוא רצף תמונות", ומצא ולחץ פעמיים על וידאו. מתפריט זרימת העבודה בחר הגדר פרטי רצף"בחלון התפריט החדש בדוק את ערכת מתן השמות, הוסף הערות ואמת מטה-נתונים.

בחרו 'התאם תמונה' ותפריט נפתח חדש בשם 'התאמות תמונה'. התאם את הגדרות עיבוד התמונה על-ידי הגדרת החלקת הרקע ל- 10, החלקה גסית לחמש, מילוי חורים לשניים, מסנן אובייקט קטן לאפס ודילוג על פילוח נגזר אינטגרלי. התאם את רמת הסף כך שבעלי החיים מלאים לחלוטין בירוק, אך עדיין נבדלים מהרקע.

לאחר מכן לחץ על החל"מתפריט זרימת העבודה, בחר זהה ועקוב", בחר שלוש עד שבע תולעים ולחץ על לחצן זיהוי תולעים" בכרטיסיית הזיהוי. עבור לכרטיסיה מעקב. בפרמטרים של המעקב, סמן את השתמש במעקב לאחור" ובטל את הסימון לעקוב אחר תולעים בקצה התמונה.

הגדר את ההשערה המרבית למעקב לחמש. הגדר את מצב המעקב לשחייה. מעבר למקטע ההגדרות המתקדמות והגדר את המסגרות תולעים יכולות לגעת בגבול ל- 50.

תולעי מסגרות יכולות לחפוף ל-500. מיקום עמידות ל 0.50. וסובלנות צורה ל-0.50.

שמור הגדרות אלה ופרוס אותן עבור כל סרטוני הווידאו בניסוי על-ידי שמירתן כתצורה. נווט אל מנהל התצורה בתפריט הסמל הימני העליון ולחץ על סמל שמור". תן לתצורה זו שם ותיאור.

ולחץ על אישור"בתפריט זרימת העבודה, לחץ על שמור פרוייקט"עקוב אחר קטעי הווידאו על ידי הולך לתפריט זרימת העבודה ולחץ על סמל אצווה". לחץ על לחצן הוסף", תחת המקטע בחירת קבצים בתפריט עיבוד אצווה זה. נווט אל כל קבצי הפרוייקט שיש לעבד ובחר אותם.

לאחר מכן לחץ על פתח"לחץ על לחצן התחל", ושים לב למחוון ההתקדמות הירוקה בקובץ הראשון. אפשר עיבוד של כל הקבצים. לאחר סיום כל הקבצים שנקראו, סגור את התוכנה.

בחר ניתוח נתונים"נווט לסיכום הרצועה. והשתמש בלחצן ייצוא בפינה השמאלית התחתונה כדי לייצא נתונים בתבנית הניתנת לקריאה בגיליון אלקטרוני. השתמש בספירת הסיבובים ובמשך המעקב כדי לחשב תורות לדקה עבור כל רצועה באמצעות פונקציות יריעות כפולות.

פיזור לא מוגדר של זחל L4 מבוים התפתחותית של חמישה זנים שונים, נמדד באמצעות אסיית הקטר הרדיאלי. וגרף כמו מיקרו מטר לדקה נסע. הנתונים המוצגים תרשימי עמודות מבהירים את ההבדלים היחסיים בין הזנים.

בעוד שהעקירה הסופית של כל תולעת המתוותת בתוך הגרף, מאפשרת לדמיין טוב יותר את השונות בתוך האוכלוסייה. שיעורי השחייה במונחים של חבטות או תדירות גלגול בנוזל, נמדדו באמצעות ניקוד וניתוח לא משוחדים בסיוע מחשב. וגרף כמו חבטות לדקה.

נתוני גרף העמודות הופכים את ההבדלים היחסיים בין זנים לקלים יותר לצפייה. בעוד שנתונים מכל תולעת בודדת שציון שלהם מתווים בתוך הגרף, ומאפשרים לדמיין טוב יותר את השונות בתוך האוכלוסייה. ב- Radial Locomotion Assay, זן TDP-43 קל לא היה שונה באופן משמעותי מזן N2 מסוג בר.

עם זאת, בשחייה Assay, הן זני TDP-43 מתון וחזק לא רק שונים באופן משמעותי מן N2 סוג פראי, אלא גם אחד מהשני. זן TDP-43 מוטציה ALS יש ליקוי זחילה חמור על ידי קמצנות רדיאלית, והם לא חבטות בנוזל. לזן הטא-מבטא יש ליקויים חמורים בקטר רדיאלי, אך הוא עלול להכות באסי השחייה.

ההיבט החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון בשיטות אלה, הוא שמירה על פקדים עקביים בין שכפולים. זה מבטיח כי וריאציות תנועתיות נגרמות על ידי הבדלים פנוטיפיים ולא תנאים סביבתיים. שיטות אלה מספקות הערכה מקיפה של שתי פרדיגמות תנועתיות ראשיות של C.elegans.

שיטות מעקב יכולות לכלול אפיון התנהגותי נוסף, ניתוח ביוכימי או חקירה של תפקוד שרירים או נוירונים.