Name: הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: למדו להעריך ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב באמצעות מבחני תנועה רדיאליים ושחייה. שיטות אלו מאפשרות כימות מדויק של תנועת התולעים ומסייעות בחקר תפקוד עצבי ושרירי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסוקרים על הערות והצעות מועילות. אנו מודים לאלין סקסטון, ברנדון הנדרסון וג'ייד סטיר על הסיוע הטכני יוצא הדופן. אנו מודים לבריאן קריימר ורבקה קו על הסיוע בפיתוח המעשים הללו. חומר זה הוא תוצאה של עבודה הנתמכת במשאבים ושימוש במתקנים במערכת הבריאות של VA Puget. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מארה"ב (ארה"ב) המחלקה לענייני יוצאי צבא (VA) מעבדה ביו-רפואית מחקר ופיתוח שירות [מענק סקירת הצטיינות #I01BX004044 N.F.L.]

<ol><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3(2009).</li>
<li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li>
<li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+genetics%2C+mechanisms%2C+and+therapeutics%3A+Where+are+we+now%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310(2019).</li>
<li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS%2FFTLD%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li>
<li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrthoList+2%3A+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transaction+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li>
<li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li>
<li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G%28o%29%2FG%28q%29+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+track+of+worm+trackers%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li>
<li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRingstad%2C+N+%22WormBook%22">WormBook</a>. Hart, A. C. , 1551(2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם גילויים.

קטר רדיאלי: הרזולוציה של מעש זה נשלטת בקלות על ידי שינוי משתנה הזמן. הגדלת משך הזמן מקלה על התבוננות בהבדלים בין בעלי חיים עם פנוטיפים חמורים, ובכך מזהה הבדלים עדינים. עם זאת, מכיוון שניסיון זה מודד עקירה, אם זמן ההסתה הוארך זמן רב מדי, בעלי חיים עם תנועתיות נורמלית, כגון N2, ייסעו לשולי הצלחת, והתנהגות חיפוש מזון תוביל לנסיגה. זה יקטין באופן מלאכותי את מדידת המרחק שעבר. פרקי זמן ארוכים מדי עלולים לגרום להיעלמותם של הבדלים בין זנים, במיוחד בין בעלי חיים עם פנוטיפים מוטוריים פחות חמורים, כמו בעלי חיים להיות מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת. קיצור משתנה הזמן ימנע מתולעים פעילות יותר למצוא את קצוות הלוח. שיטה זו אינה עוקבת אחר המרחק הכולל שעבר עבור כל תולעת, אלא דוחסת את המרחק שעבר עבור כל תולעת למרחק ליניארי ממרכז הצלחת. ככזה, הוא מטבעו פחות חזק מאשר שיטה המתעדת את אורך המסלול הכולל של תולעים בודדות. עם זאת, הבדיקה של הקטר הרדיאלי דורשת מעט מאוד הכשרת חוקרים, משתמשת בריאגנטים זולים יחסית הזמינים בדרך כלל ברוב מעבדות התולעים, והיא רגישה מספיק כדי לייצר תוצאות משמעותיות וניתן לשחזור. עבור מעבדות המעדיפות מעקב אוטומטי אחר וידאו, הוקמו בעבר מספר שיטות כדי לעקוב ולנתח תנועות סריקה12, או שניתן לשנות את פרמטרי התוכנה המשמשים לבדיקת השחייה במאמר זה כדי לאפשר זיהוי וניתוח סריקה.
ניסוי זה נעשה בדרך כלל בשכפולים עצמאיים משולשים, עם קבוצה של 30-40 תולעים לכל שכפול. כל שכפול מחולק לשתי לוחות שונים של 100 מ"מ או 150 מ"מ, עם 15-20 תולעים לצלחת. שימוש ביותר תולעים מהמומלץ לכל צלחת יכול להקשות על הניקוד ביעילות. מספר כולל של 90+ מופעל מספיק כדי לקבוע משמעות לפגיעה קלה, בינונית או חמורה בתנועתיות. להיות עקבי עם תזמון בין זנים ציון חיוני לדיוק רבייה. 30 דקות זה בדרך כלל מספיק זמן כדי ליצור הבדלים בין פנוטיפים בינוניים עד חמורים כמו זנים מהונדסים המבטאים מוטציה אנושית TDP-43 בהשוואה לתולעים מסוג בר (איור 4). אם משתנה הזמן יוארך, מומלץ גם להגדיל את גודל הצלחת מ 100 מ"מ ל 150 מ"מ. גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה ולחות יכולים להשפיע על בדיקת ישבן זו, אשר מתבצעת בדרך כלל בטמפרטורת החדר הסביבה, ולכן חשוב תמיד להשתמש בבקרה מסוג בר (N2) בעת השוואה בין שכפולים. בנוסף, זה בדיקות יכול למדוד את תנועתיות של כמה זנים שאינם מפגינים התנהגות שחייה נורמלית בנוזל (חבטות), מה שהופך אותו השלמה שימושית כדי assay השחייה.
שחייה: השימוש במערכת ההדמיה והרכישה כדי להפוך את המעקב והניתוח של שחייה בתולעים לאוטומטיים מאפשר נתונים קפדניים ובלתי משוחדים. עם זאת, ישנם מספר גורמים במהלך ההתקנה הראשונית של הניסוי כי צריך להיות נשלט בין דגימות. אלה כוללים את הזמן להתאקלם לנוזל לפני תחילת ההקלטה, תנאי סביבה (כלומר, טמפרטורה, לחות), והגדרות אור והקלטה עקביות. בשלב ההקלטה, ישנן מספר תכונות המסייעות להפחית את השונות בין הצלחות. אלה כוללים מצלמה משולבת המותקנת על מסלול ושלב שדה בהיר שהופך את הקלטת הווידאו לעקבית בין לוחות, סיכוך סביב הבמה המונע השתקפויות, בוהק ותנועות אוויר בזמן ההקלטה, וחבילת תוכנה חזקה המזהה באופן אמין תולעים ומאפשרת תיקון ידני של רצועות בעיבוד וידאו. בפרוטוקול זה, קטעי וידאו של צלחת 35 מ"מ עם תולעים נרשמים במשך 1 דקה ולאחר מכן מעובד באמצעות חבילת התוכנה. לאחר העיבוד, תיקון ידני של רצועות מבטיח שהתנהגויות תולעת תירשם במדויק מבלי לבלבל שגיאות מעקב. נתוני ספירת הספירה והמעקב משמשים לקביעת תורות לדקה כהקראה סופית. כדי להבטיח רבייה, הנתונים נאספים על פני מינימום של 3 ניסויי שכפול עצמאיים, כל אחד עם 40-50 בעלי חיים ציון, כדי להשיג מספר סופי משולב של בעלי חיים 120-150. מספר זה מספיק כדי להפלות הבדלים קטנים בהתנהגות השחייה מתולעי בקרה. לחלק מהתולעים יש ליקויים מוטוריים חמורים מכדי להיתפס על ידי עשייה שוחה. לדוגמה, אם בעלי החיים ממוקמים בתלתל בינוני נוזלי במקום לבצע את התגובה החבטות הצפויה, תם זה לא לתעד תנועות אלה במדויק ובוחן תנועה אחר, כגון תנועה רדיאלית, עשוי ללכוד טוב יותר את פגמי תנועתיות אלה. הפרוטוקול שסופק משתמש במערכת הדמיה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים נוספים), אך מערכות מעקב אחר תולעים אחרות עשויות לספק כלי דומה, כאשר חלקן מקורות פתוחים12. שיטות שפורסמו בעבר מתארות ניקוד ידני של תולעת thrashing13. בעוד שהניתוח האוטומטי מייצר מספר מדדים עבור כל תולעת בודדת, זיהוי כיפופי גוף הנמדדים בתהכים לדקה, מספק תוצאות עקביות בין ניסויים ומעקבים היטב עם ניקוד קונבנציונלי של תולעים thrashes בעין.

טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא מחלה נוירודגנרטיבית מתישה הקשורה להזדקנות עם השפעה מיוחדת על נוירונים מוטוריים. המחלה כוללת אובדן נוירונים מוטוריים במוח ובחוט השדרה ופגיעה מוטורית מתקדמת. התוצאה היא נכות תפקודית גדולה ומוות בטרם עת, בדרך כלל בתוך 3-5 שנים לאחר האבחון1. מוטציות בלפחות 38 גנים יכולות לגרום ל- ALS; עם זאת, רוב החולים עם ALS לצבור בכל מקום תכלילים של חלבון TDP-43 כמו הפתולוגיה העיקרית שלהם נוירונים ותאי גליה2,3,4. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים הגורמים או תורמים ALS in vivo (נבדק ב5). ב- C. elegans, מודלים אלה כוללים מוטציות גנטיות של אובדן תפקוד בהומולוגים של גנים הגורמים ל- ALS או ביטוי מהונדס של גנים אנושיים של ALS. ישנם יתרונות רבים לדגמן ALS ב C. elegans. C. elegans הם חיה פשוטה ומתיחה עם מערכת עצבים מובחנת, פרדיגמות התנהגותיות מאופיינות היטב, והומולוגיה גנטית ניכרת לבני אדם6,7. קיימים כלים רבים לעבודה עם C. elegans, כולל יכולות עריכת גנום חזקות, בכתבים פלואורסצנטיים של ניוון עצבי, פרדיגמות סינון RNAi, גנטיקה מתיחה, ובדיקות התנהגותיות ופנוטיפיות מבוססות. ג. מודלים אלגנס של ALS recapitulate היבטים של מחלות אנושיות, כולל הצטברות של חלבון מסיס, ניוון עצבי, ומוות מוקדם8,9. יתר על כן, תפקוד מוטורי הכולל הפרעה של התנהגויות זחילה ושחייה קיים במודלים רבים של C. elegans ALS.
פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לאפיון פנוטיפים מוטוריים C. elegans : בחן הקטר הרדיאלי להערכת זחילה על משטח מוצק והערכת שחייה בנוזל (חבטות) באמצעות מעקב וניתוח אוטומטיים של WormLab. שיטות רגישות אלה לאפיון ליקויים מוטוריים מאפשרות השוואות של חומרה ומציעות כלים למדידת דיכוי ושיפורים של פנוטיפים מוטוריים. תנועת הקטר הרדיאלית מסמיכה הבדלים בתנועתיות זוחלת (תנועה סינוסורלית על משטח מוצק) בין אוכלוסיות של תולעים. בדיקה זו מנצלת את התנהגות המחקר הטבעית של C. elegans unstimulated על ידי הצבת תולעים במיקום אחד על צלחת וסימון מיקומם הסופי לאחר פרק זמן נתון10. לחלופין, שחייה בנוזל (חבטות) ספירת כיפופי גוף של תולעים בודדות לאורך פרק זמן מוגדר. הספירה הידנית של כיפופי הגוף על ידי העין האנושית היא עתירת זמן ובדרך כלל מציגה שונות ניכרת בין הנסיינים. השימוש במעקב וניתוח אוטומטיים בסיוע מחשב יכול לחסל חלק גדול מההשתנות הזו. בנוסף לאפיון של פגיעה מוטורית בסיסית של דגמי ALS, הן קטר רדיאלי והן בדיקות שחייה יכולות לזהות אפנון של פנוטיפים לוקומוטוריים מובחנים מהתערבויות גנטיות או קטנות של מולקולות. שיטות אלה יש תועלת ללימוד מודלים ALS וכל זן C. elegans המציג תנועתיות שונה.

<table><tbody><tr><td>C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>-</td><td>קבל את הזנים שלך כרצונך, N2 הוא זן בקרה שימושי</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר חד פעמיות, זכוכית בורוסיליקט</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>צינור זכוכית המשמש ליצירת פיק תולעים - החזק פיפטת זכוכית ביד אחת ו~1 אינץ' של חוט פלטינה (מוחזק על ידי צבת) ביד השנייה מעל להבה כדי להצטרף.</td></tr><tr><td>צלחות פטרי חד פעמיות, 35x10 מ"מ</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td>צלחות בדיקה למערכת הדמיה של WormLab</td></tr><tr><td>צלחות פטרי חד פעמיות, 60x15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25384-090</td><td>צלחות מלאי לתולעים</td></tr><tr><td>צלחות פטרי חד פעמיות, 100x15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>צלחת בדיקת תנועה רדיאלית סטנדרטית</td></tr><tr><td>צלחות פטרי חד פעמיות, 150x15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>מסגרת זמן רדיאלית ארוכה יותר לוחית בדיקת תנועה</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>M80</td><td>היקף לשמירה על תולעים והקמת מבחני תנועה רדיאליים</td></tr><tr><td>סמנים עדינים</td><td>VWR</td><td>52877-810</td><td>צריך לפחות 2 צבעים לבדיקות תנועה רדיאליות. טיפים עדינים נדרשים לדיוק.</td></tr><tr><td>סורק שטוח</td><td>Amazon</td><td>Epson Perfection V850</td><td>אופציונלי לבדיקת תנועה רדיאלית. הפרוטוקול מניח רזולוציה של 300dpi, רוב הסורקים יעבדו בסדר ImageJ</td></tr><tr><td></td><td>NIH-תוכנה</td><td></td> <td>חופשית אופציונלית המסופקת על ידי ה-NIH - https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>M9 buffer</td><td>VWR</td><td>IC113037012</td><td>Medium המשמש לבדיקת שחייה. ניתן להכין מאפס, ראה WormBook: Maintenance of C. elegans</td></tr><tr><td>NGM (Nematode Growth Medium)</td><td>VWR</td><td>76347-412</td><td>מדיום המשמש לגידול C. elegans. ניתן להכין מאפס, ראה WormBook: תחזוקת חיידקי C. elegans</td></tr><tr><td>OP50&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td>מקור מזון עיקרי עבור C. elegans</td></tr><tr><td>p1000 פיפטור</td><td>VWR</td><td>76207-552</td><td>פיפטור המשמש בבדיקת שחייה</td></tr><tr><td>p1000 טיפים</td><td>VWR</td><td>83007-384</td><td>טיפים לפיפטטור, המשמש בבדיקת שחייה</td></tr><tr><td>חוט פלטינה, קוטר 0.2032 מ"מ</td><td>VWR</td><td>BT136585-5M</td><td>חוט פלטינה בקנה מידה עדין המשמש ליצירת פיק תולעת - החזק פיפטת זכוכית ביד אחת ו~1 אינץ' של חוט פלטינה (מוחזק על ידי צבת) ביד השנייה מעל להבה כדי להצטרף.</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>VWR</td><td>56510-001</td><td>צריך לקלוע מבחני תנועה רדיאלית</td></tr><tr><td>WormLab Imaging System</td><td>MBF Bioscience</td><td>WormLab</td><td>מערכת ההדמיה כוללת חומרת WormLab (במת שדה בהיר, מצלמה ודיור) ותוכנת WormLab. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td></tr></tbody></table>

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי c. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

המחלה הנוירודגנרטיבית אמיוטרופית אמיוטרופית טרשת לרוחב (ALS) תכונות אובדן הדרגתי של נוירונים מוטוריים מלווה בחולשת שרירים ופגיעה מוטורית המחמירה עם הזמן. בעוד התקדמות ניכרת נעשתה בקביעת מניעים גנטיים של ALS עבור תת קבוצה של חולים, רוב המקרים יש אטיולוגיה לא ידועה. יתר על כן, המנגנונים שבביסת תפקוד לקוי של נוירון מוטורי והתנוונות אינם מובנים היטב; לכן, יש צורך מתמשך לפתח ולאפיין מודלים מייצגים ללמוד תהליכים אלה. אלגנים Caenorhabditis יכול להתאים את תנועתם לאילוצים הפיזיים של סביבתם, עם שתי פרדיגמות תנועה עיקריות נחקרו בסביבת מעבדה - זוחל על משטח מוצק ושוחה בנוזל. אלה מייצגים יחסי הגומלין מורכבים בין תחושה, נוירונים מוטוריים ושרירים. ג. מודלים אלגנס של ALS יכולים להפגין ליקוי באחת פרדיגמות התנועה האלה או בשתיהן. פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להערכת תנועתיות ב - C. elegans: מתקן קטר רדיאלי ממוטב המודד זחילה על משטח מוצק ושיטה אוטומטית למעקב וניתוח שחייה בנוזל (חבטות). בנוסף לאפיון של פגיעה מוטורית בסיסית של דגמי ALS, בדיקות אלה יכולות לזהות דיכוי או שיפור של הפנוטיפים מהתערבויות גנטיות או קטנות של מולקולות. לכן, שיטות אלה יש תועלת ללימוד מודלים ALS וכל זן C. elegans המציג תנועתיות שונה.

פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להפלות בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם תועלת כללית לזני C. elegans , עם תנועתיות שונה.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

הפרוטוקול שלנו מציג שתי גישות, כימות תנועת C.elegans. שיטות אלה להעריך פנוטיפים תנועתיות כגון אלה המוצגים על ידי מודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב, או ALS. הפחתת הקטר הרדיאלית היא שיטה חסכונית וקלה לזיהוי זחילה על משטח מוצק.ה-Swimming Assay משתמש במעקב מבוסס מחשב לגילוי לא משוחד של תנועות חבטות בנוזל. שיטות אלה שימושיות לכימות הבדלי תנועה ב- C.elegans. למרות שאנו לומדים ALS, הם יכולים לשמש עבור כל זן עם תנועתיות שונה.הפוך את לוחות ההסתה של NGM. ולסמן את התחתית עם מזהה לזני C.elegans שיש לתייג. הפוך נקודה קטנה עם הסמן במרכז הצלחת ההפוכה.תוך כדי עבודה עם מיקרוסקופ מנתח, העבר תולעים למרכז צלחת ה- assay. ותקבע שעון שעון במשך 30 דקות. מניחים את המכסה בחזרה על הצלחת ומניחים אותו בצד.ממשיכים להעביר תולעים עד שכל הזנים נמצאים על לוחות ההסתה המיועדים. לאחר 30 דקות, להתחיל להבקיע את הצלחת הראשונה על ידי הסרת המכסה והנחת הצלחת עם הפנים כלפי מטה תחת המיקרוסקופ הניתוח. כוונן את מוקד המיקרוסקופ עד שכל התולעים ייראות דרך האוגר.באמצעות עט קצה לבד בצבע אחר מנקודת המרכז, שים נקודה קטנה במיקום של כל תולעת. בדוק את קצה הצלחת כמו כמה תולעים עלולות בסופו של דבר שם. כמו כן, לספור ולתעד כמה תולעים לא זזו מנקודת המרכז.מדוד את המרחק מנקודת המרכז לסימוני המיקום הסופיים עבור כל תולעת, ותיעד את המרחק באמצעות סרגל. נקודת התולעת הראשונה מסומנת בלוח דש. תעד נתוני אורך עבור כל נקודה ברציפות על-ידי סיבוב הלוח בצורה בכיוון השעון.פתח את התוכנה המשויכת כדי להגדיר ולהקליט את סרטוני הווידאו. לחץ על סמל לכידת הווידאו. לחץ על ידית העמעום וסובב אותה בכיוון השעון כדי לכוונן את האור.בחלון לכידת הווידאו, לחץ על כרטיסיית ההגדרות והתאם את מצב הווידאו 2456x2052_Mono8, קצב הפריימים ל- 14, פלט כמונוכרום. חשיפה של 0.00300 שניות. רווח ל-1 די.בי.גמא לאחד. ותסובב ל-180. חזור לכרטיסיה לכידה, בחר את תיקיית ההקלטה והקצה שם קובץ על-ידי הזנתו לתיבת הטקסט של קידומת הקובץ.הגדר הגדרות לכידה אחרות כגון מאגר, ל- 128 מסגרות ומשך דקה אחת. הנח את צלחת בדיקת ה- assay מוארת על במת המכשיר ומרכז אותה במסך לכידת הווידאו ולאחר מכן הסר את המכסה. השתמש micropipette לשטוף כ 50 תולעים ב 1 מ"ל של M9 על צלחת בדיקות.מערבבים בעדינות את הצלחת כדי להביא את בעלי החיים למרכז, או להשתמש micropipette להוסיף כמה טיפות של M9 כדי להפריד את בעלי החיים. הגדר טיימר במשך 60 שניות כדי לאפשר לתולעים להתאקלם לשחייה. התאם את ידית האור כך שהצג יהיה בהיר ככל האפשר ללא חשיפת יתר.כוונן ידנית את מוקד המצלמה על-ידי הפיכת טבעת המיקוד על גוף העדשה של המצלמה, תוך כדי צפייה בתצוגה. לאחר 60 שניות לחץ על לחצן הרשומה, בחר את הלחצן הראשון בתפריט זרימת העבודה ייבוא רצף תמונות", ומצא ולחץ פעמיים על וידאו. מתפריט זרימת העבודה בחר הגדר פרטי רצף"בחלון התפריט החדש בדוק את ערכת מתן השמות, הוסף הערות ואמת מטה-נתונים.בחרו 'התאם תמונה' ותפריט נפתח חדש בשם 'התאמות תמונה'. התאם את הגדרות עיבוד התמונה על-ידי הגדרת החלקת הרקע ל- 10, החלקה גסית לחמש, מילוי חורים לשניים, מסנן אובייקט קטן לאפס ודילוג על פילוח נגזר אינטגרלי. התאם את רמת הסף כך שבעלי החיים מלאים לחלוטין בירוק, אך עדיין נבדלים מהרקע.לאחר מכן לחץ על החל"מתפריט זרימת העבודה, בחר זהה ועקוב", בחר שלוש עד שבע תולעים ולחץ על לחצן זיהוי תולעים" בכרטיסיית הזיהוי. עבור לכרטיסיה מעקב. בפרמטרים של המעקב, סמן את השתמש במעקב לאחור" ובטל את הסימון לעקוב אחר תולעים בקצה התמונה.הגדר את ההשערה המרבית למעקב לחמש. הגדר את מצב המעקב לשחייה. מעבר למקטע ההגדרות המתקדמות והגדר את המסגרות תולעים יכולות לגעת בגבול ל- 50.תולעי מסגרות יכולות לחפוף ל-500. מיקום עמידות ל 0.50. וסובלנות צורה ל-0.50.שמור הגדרות אלה ופרוס אותן עבור כל סרטוני הווידאו בניסוי על-ידי שמירתן כתצורה. נווט אל מנהל התצורה בתפריט הסמל הימני העליון ולחץ על סמל שמור". תן לתצורה זו שם ותיאור.ולחץ על אישור"בתפריט זרימת העבודה, לחץ על שמור פרוייקט"עקוב אחר קטעי הווידאו על ידי הולך לתפריט זרימת העבודה ולחץ על סמל אצווה". לחץ על לחצן הוסף", תחת המקטע בחירת קבצים בתפריט עיבוד אצווה זה. נווט אל כל קבצי הפרוייקט שיש לעבד ובחר אותם.לאחר מכן לחץ על פתח"לחץ על לחצן התחל", ושים לב למחוון ההתקדמות הירוקה בקובץ הראשון. אפשר עיבוד של כל הקבצים. לאחר סיום כל הקבצים שנקראו, סגור את התוכנה.בחר ניתוח נתונים"נווט לסיכום הרצועה. והשתמש בלחצן ייצוא בפינה השמאלית התחתונה כדי לייצא נתונים בתבנית הניתנת לקריאה בגיליון אלקטרוני. השתמש בספירת הסיבובים ובמשך המעקב כדי לחשב תורות לדקה עבור כל רצועה באמצעות פונקציות יריעות כפולות.פיזור לא מוגדר של זחל L4 מבוים התפתחותית של חמישה זנים שונים, נמדד באמצעות אסיית הקטר הרדיאלי. וגרף כמו מיקרו מטר לדקה נסע. הנתונים המוצגים תרשימי עמודות מבהירים את ההבדלים היחסיים בין הזנים.בעוד שהעקירה הסופית של כל תולעת המתוותת בתוך הגרף, מאפשרת לדמיין טוב יותר את השונות בתוך האוכלוסייה. שיעורי השחייה במונחים של חבטות או תדירות גלגול בנוזל, נמדדו באמצעות ניקוד וניתוח לא משוחדים בסיוע מחשב. וגרף כמו חבטות לדקה.נתוני גרף העמודות הופכים את ההבדלים היחסיים בין זנים לקלים יותר לצפייה. בעוד שנתונים מכל תולעת בודדת שציון שלהם מתווים בתוך הגרף, ומאפשרים לדמיין טוב יותר את השונות בתוך האוכלוסייה. ב- Radial Locomotion Assay, זן TDP-43 קל לא היה שונה באופן משמעותי מזן N2 מסוג בר.עם זאת, בשחייה Assay, הן זני TDP-43 מתון וחזק לא רק שונים באופן משמעותי מן N2 סוג פראי, אלא גם אחד מהשני. זן TDP-43 מוטציה ALS יש ליקוי זחילה חמור על ידי קמצנות רדיאלית, והם לא חבטות בנוזל. לזן הטא-מבטא יש ליקויים חמורים בקטר רדיאלי, אך הוא עלול להכות באסי השחייה.ההיבט החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון בשיטות אלה, הוא שמירה על פקדים עקביים בין שכפולים. זה מבטיח כי וריאציות תנועתיות נגרמות על ידי הבדלים פנוטיפיים ולא תנאים סביבתיים. שיטות אלה מספקות הערכה מקיפה של שתי פרדיגמות תנועתיות ראשיות של C.elegans.שיטות מעקב יכולות לכלול אפיון התנהגותי נוסף, ניתוח ביוכימי או חקירה של תפקוד שרירים או נוירונים.

evaluation-motor-impairment-c-elegans-models-amyotrophic-lateral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) נבחן קלינית התנהגותית. כתנאי ניתוח immunohistological נלווה להכנת חוט השדרה מתואר בפירוט.

בדיקה קלינית הסרת חוט השדרה במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)

סרטון זה מדגים את התהליך של הערכת תפקוד מוטורי לקוי במודל עכברי באמצעות מתן רעלן שעלת וחיסון המכיל פפטידים ואדג'ובנטים המחקים מיאלין, ולאחר מכן בדיקות הליכון להערכת תפקוד מוטורי והערכת הנזק העצבי הנובע כתוצאה מהפעלה חיסונית ודה-מיאלינציה.

הערכת תפקוד מוטורי במודל ניסיוני של עכבר נוירוטיס אוטואימוני

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת תנועה רדיאלית כדי להעריך תפקוד לקוי של מוטוריקה ב-C. elegans המבטא חלבון TDP-43 אנושי מסוג פרא או מוטנטי ALS. תולעים עם רמות שונות של ביטוי TDP-43 מסוג בר או מוטנטי מורשות לזחול, ותנועתן נמדדת על ידי המרחק הרדיאלי שעובר מהנקודה המרכזית על לוחית הבדיקה. הבדיקה מבחינה בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים על סמך המרחק שעברו הזנים השונים C. elegans.

הערכת ליקוי מוטורי במודלים של C. elegans באמצעות בדיקת תנועה רדיאלית

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

אנו מציגים פרוטוקולים מעודנים המאפשרים ניטור vivo של פונקצית יחידת מנוע בעכבר. טכניקות למדידת פוטנציאל פעולת שרירים מתחם (מבנה מפת צבעים) והערכת יחידת מנוע מספר (mune) בשרירי הגפיים האחורי עכבר מעוצבבים על ידי גיד הנשה מתואר.

אלקטרו מנוע יחידת מספר הערכה (mune) מדידת פוטנציאל פעולה שרירים מתחם (מבנה מפת צבעים) בשרירי העכבר Hindlimb

פרוטוקול וידאו זה מתאר שיטה רגישה, אמינה ומהירה להערכת הליקויים העצביים-שריריים במודל עכבר טרנסגני של טרשת אמיוטרופית צידית.

שיטת ניקוד מהירה פנוטיפי נוירולוגיות להערכת מחלת התקדמות בSOD1-G93A מודל העכבר של ALS

המדד של תסמונת גיאן הוא כלי שימושי כדי להעריך את העכבר דגמי הקשורים ניוון מוחיים אך לעתים קרובות הוא להחיל רק כדי לגרות בעצב הירך ב- hindlimbs. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת השריר מורכבים פוטנציאל הפעולה (CMAP) ויוו בשרירי forelimb העכבר innervated על ידי מקלעת הזרוע.

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאל הפעולה השריר מורכב מ Forelimbs העכבר דגמים של ניוון מוטורי נוירון

במחקר זה, נדגים את השימוש קנטית והרצתי ניתוח המבוסס על הגחון המטוס הדמיה לעקוב אחר שינויים עדינים קואורדינציה, כמו גם את ההתקדמות של הקשורים ניוון מוחיים עם הגיל במודלים של העכבר (למשל, endophilin מוטציה קווים העכבר).

והרצתי ניתוח של ליקויים מוטוריים תלויי-גיל בעכברים עם הקשורים ניוון מוחיים

מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס

פרוטוקול זה מפרט בדיקת הצואה הכמותית ב-Caenorhabditis elegans צעירים מ-RAC1/CED-10, ומספק מודל פשוט לחקר שלבי מחלת פרקינסון פרודרומליים. היא מתגברת על מגבלות של מודלים בעלי חיים אחרים ומקלה על בדיקות אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות בפתולוגיה פרקינסונית מוקדמת.

הערכת תנועתיות מערכת העיכול במוטנטים CAENORHABDITIS elegans RAC1/CED-10 ככלי לחקר מחלת פרקינסון מוקדמת

למדו להעריך ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב באמצעות מבחני תנועה רדיאליים ושחייה. שיטות אלו מאפשרות כימות מדויק של תנועת התולעים ומסייעות בחקר תפקוד עצבי ושרירי.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

גלה סרטונים נוספים