Name: ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: למד כיצד להרכיב תא לחץ גבוה ולהפעיל ניסויי NMR בלחץ גבוה לניתוח מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבונים. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי קיפול חלבונים ויציבות מבנית בביוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי כספים מקרן הצדקה רוי ג'יי קארבר לג'וליאן רוש. אנו מודים לג'יי.די. לבנגוד ו-ב.ס. טולברט על שסיפקו בחביבות את דגימת RRM2.

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן דורש (i) משאבה בלחץ גבוה ותא עם צינור זירקוניהאלומיניום 18בדירוג אלומיניום 2.5, (ii) התוכנה SPARKY19 לניתוח ספקטרום NMR, ו - (iii) תוכנה להתאמת עקומה.
1. הכנה לדוגמה, הרכבה של התא בלחץ גבוה, והקמת הניסויים.
<ol><li>בחירת חוצץ: השתמש בתערובת שווה של מאגרים אניוניים וקטיוניים, כגון פוספט וטרייס20,21. הערה: pKa של מאגרים אניוניים כגון פוספט ו MES קשורה לנפח תגובה משמעותי (כלומר, ההבדל בנפחי המותח החלקיים של החומצה והמוצרים המייננים). ה- pH של מאגרים כאלה יכול אפוא להיות מושפע באופן משמעותי על ידי שינוי של לחץ (~ 0.25-0.5 יחידת pH / kbar).</li>
	<li>ודא כי נפח המדגם הנדרש דומה לזה של צינור NMR סטנדרטי בקוטר 3 מ"מ (~ 300μL).</li>
	<li>הציגו את המדגם 15N-שכותרתו עם פיפטה זכוכית לתוך צינור זירקוניה. ודא את המושבים לדוגמה בתחתית הצינור. להשלים עם 200 μL של שמן מינרלי כדי למנוע את המדגם מערבוב עם נוזל השידור (למשל, מים). מלא את שאר הצינור בנוזל שידור.</li>
	<li>שים טבעת O חד פעמית על גבי צינור הזירקוניה והחלק את הצינור לבסיס(איור 1A,B). לאחר מכן, חבר את הצינור לקו הרצועה בלחץ גבוה והידק את הבסיס לתא תחילה ביד. לאחר מכן, יש למרוח 14.7 ננומטר של המומנט כדי למנוע דליפות בלחץ נמוך יותר(איור 1C,D).</li>
	<li>כדי לבדוק את שלמות הרכבת תא הלחץ, לחץ על הצינור עד 300 בר מחוץ לספקטרומטר באמצעות תמיכה בתא וכלי בלימה. המתינו 15 דקות, אפסו את הלחץ לבר אחד ובדקו אם יש דליפות עם מגבון נקי ללא מוך.</li>
	<li>הכנס את הצינור הלא בלחץ לספקטרומטר על-ידי הנחיית קו הרצועה בזהירות. החלק את הצינור בספקטרומטר עד להגעה לתנוחת הישיבה לדוגמה(איור 1E).</li>
	<li>לנעול, shim, להתאים, ולכוון את ערוצי 1H ו 15N כרגיל. הערה: Shims עבור צינורות זירקוניה מדורגים בלחץ גבוה שונים מאוד צינורות NMR סטנדרטיים. מומלץ לשמור את shims ממוטב לשימוש עתידי.</li>
	<li>הגדר 1H-15N-HSQC או TROSY-HSQC ורשום ניסוי ייחוס בתנאים אטמוספריים (1bar).</li>
</ol>2. הקלטת ניסויי NMR בלחץ גבוה
<ol><li>להגדיל בהדרגה את הלחץ מ 1 בר ל 2.5 kbar עם 500 תוספת בר כדי לבדוק את היציבות הכוללת של החלבון. הגדר את המהירות של משאבת הלחץ כברירת מחדל ב- ~ 18 בר /s. אם שיעורי הקיפול/פתיח המדויקים אינם ידועים, תן לדגימה להתיק 15-20 דקות לאחר כל תוספת של 500 ברים. הקלט ספקטרום ב 2.5 kbar.</li>
	<li>בהדרגה להקטין את הלחץ בחזרה 1 בר עם 500 צעדי בר כדי לבדוק את הפיך של הלחץ מוטרד. להקליט ספקטרום אחר בתנאים אטמוספריים ולהשוות את השינויים הכימיים ואת עוצמות שיא עם זה של ספקטרום הייחוס שנרשם בעבר באותם תנאים. הערה: אם ההצלבות המקומיות אינטנסיביות יותר לאחר ריצת הלחץ, זה עשוי להצביע על כך שאגרפים קטנים הנמצאים בתמיסה בלחץ אטמוספרי עשויים להתנתק ולתפתח מחדש כראוי. מצד שני, אובדן בעוצמה או שינויים משמעותיים בשינויים כימיים מצביעים על כך שהחלבון עלול לחוות טעות בלתי הפיכה בתנאי לחץ גבוה.</li>
	<li>הקלט סדרה של ניסויים 2D מ 1 בר ל 2.5 kbar כל 500 בר. מומלץ להקליט ניסויים נוספים ליד נקודת ההטיה של המעבר המתקפל/נפתח כדי לשפר את דיוק ההתאמה.</li>
</ol>3. ניתוח שינויים בעוצמת השיא
<ol><li>עבד את כל הספקטרום והעבר את הקצאת עמוד השדרה מקשת הייחוס ב- 1 סרגל לספקטרום שנרשם ב- 500 bar ולאחר מכן העבר את המשימה מ- 500 בר ל- 1 kbar וכן הלאה. הערה: מכיוון שלחץ נעשה שינוי לא אחיד של משמרותכימיות של שעה ו- 15N, אל תעתיקו את משימת עמוד השדרה מקשת אחת לאחרת. להתאים אותו באופן ידני.</li>
	<li>בתפריט Sparky, לחץ על שיא &gt; רשימת שיא (lt). בחלון רשימת שיאים, לחץ על אפשרויות ובחר באפשרות להציג הן תדרים (ppm) והן גובה נתונים. שמור את הרשימה המתקבלת עבור כל ספקטרום.</li>
	<li>בתוכנה המתאימה לעקומה, העתק את זהות ההצלבה וערכי עוצמת שיא כדי שערכי הלחץ (בסרגל) ימותנו את משתנה ציר ה- X ואת העוצמה כמשתנה ציר ה- Y.</li>
	<li>אם נצפה התגלגלות מלאה או כמעט מלאה (&gt;80%), התאם את פרופילי עוצמת השיא הבודדים כדי לחלץ את האנרגיה החופשית ושינוי הנפח עם התפתחותם, בהתאמה, באמצעות מודל פשוט של שתי מדינות: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62701/62701eq01.jpg">א"ק 1 איפה, "אני" הוא העוצמה הנצפית של crosspeak בלחץ נתון p ו- IF הוא העוצמה של אותו crosspeak במצב מקופל לחלוטין. R הוא קבוע הגז, T הוא הטמפרטורה המוחלטת, ΔGU0 הבדל האנרגיה החופשית של גיבס הסטנדרטי בין המצבים המפותחים והממוספלים בלחץ אטמוספרי p0 (1 בר), ו- ΔVu שינוי הנפח עם התפתחותו. עם הלחץ p בבר וטמפרטורה T בקלווין, R = 1.987 cal / K, ΔGU0 הוא ב cal / מול, ו ΔVU הוא ב cal / מול / בר. הכפל את ערכי ΔVU המתקבלים מההתאמה ב- 41.84 כדי להמיר ל- mL / mol. ערכי ΔVU נמצאים בדרך כלל בטווח של -50 עד -150 מ"ל / מול עבור חלבונים כדוריים22. כאן, כל הפרמטרים באים לידי ביטוי לגבי התגובה המתפתחת אך ניתן להמיר בקלות לפרמטרים של תגובה מתקפלת (ΔGU0 = -ΔGF0 ו- ΔVU = -ΔVF).</li>
</ol>4. ניתוח שינויים כימיים במשמרות
<ol><li>סדר את העמודות בתוכנה כדי לקבל נקודות לחץ כמשתנה ואת 1 H משמרותכימיות שחולצו מרשימות Sparky כציר Y.</li>
	<li>התאם את תלות הלחץ של 1H כימי עובר למשוואה ריבועית פשוטה: δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2 איפה, δ(p)הוא 1H כימי shift של crosspeak ב p לחץ נתון δ0(p0) משמרות כימיות 1H של אותו crosspeak בספקטרום הייחוס שנרשם ב 1 בר. B1 ו- B2 מייצגים את הפרמטרים מסדר ראשון ושני המתבטאים ב- ppm/ bar ו- ppm / bar2, בהתאמה.</li>
</ol>

<ol><li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probing+invisible%2C+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+An+application+to+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li>
<li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li>
<li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMG+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li>
<li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+exchange+saturation+transfer+%28CEST%29%3A+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins%27+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li>
<li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li>
<li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561(2017).</li>
<li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244(2018).</li>
<li>Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li>
<li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li>
<li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li>
<li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure%3A+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li>
<li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li>
<li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state%3A+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li>
<li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-contained+high-pressure+cell%2C+apparatus%2C+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101(2005).</li>
<li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoddard%2C+TD+%22Sparky+3%22">Sparky 3</a>. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).</li>
<li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li>
<li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Solution+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li>
<li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li>
<li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li>
<li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+The+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics%2C+folding+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li>
</ol>

כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד. הם לא מצהירים על ניגודי אינטרסים.

מחקר זה מפרט פרוטוקול המיושם לבדיקת תגובות מבניות ותרמודינמיקה של חלבון ללחץ. הניסויים בלחץ גבוה שנרשמו כאן ב- RRM2 מראים כי וריאציות גדולות בערכי ΔVU, המעידות על שיתוף פעולה לא מלא, ניתן למצוא בחלבון תחום יחיד קטן יחסית. תמונה דומה עולה מניתוח שינויים בשינויים כימיים של 1H תחת לחץ. יש לציין כי קלביצר ושותפיו לעבודה הוכיחו כי ניתן לבצע ניתוח מעמיק יותר של שינויים במשמרות כימיות המקשר בין המקדחים הלא ליניאריים והליניאריים (B2/B1) לבין היחס בין השינוי בדחיסה ובנפח (Δβ/ΔV)<sup cla...

זה זמן רב מוכר כי אנרגיה גבוהה יותר, מאוכלס בדלילות מצבים קונפורמציה של חלבונים ומתחמי חלבון לשחק תפקיד מפתח במסלולים ביולוגיים רבים1,2,3. הודות לניסויים המבוססים על קאר-פרסל-מייבום-גיל (CPMG)4, העברת רוויית חילופי כימיקלים (CEST)5,והעברת רוויית חילופי מצב כהה (DEST)6 רצפי פעימה (בין היתר), ספקטרוסקופיית NMR פתרון התגלתה כשיטת בחירה לאפיון מצבי קונפורמציה ארעיים7. יחד עם ניסויים אלה, perturbations כגון טמפרטורה, pH, או denaturants כימי ניתן להציג כדי להגדיל את האוכלוסייה היחסית של תת-מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה יותר. באופן דומה, חלבון שיווי משקל יכול גם להיות מוטרד על ידי הפעלת לחץ הידרוסטטי גבוה. בהתאם לעוצמת השינוי בנפח הקשור לשינויים הקונפורמציה המתאימים, עלייה בלחץ בכמה מאות עד כמה אלפי ברים יכולה לייצב באופן משמעותי מצבאנרגיהגבוה יותר או לגרום לחלבון להתפתח לחלוטין 8,9,10. ספקטרום NMR חלבון מציג בדרך כלל שני סוגים של שינויים עם לחץ הידרוסטטי: (i) שינויים בשינויים כימיים ו-(ii) שינויים בעוצמת השיא. שינויים בהזזה כימית משקפים שינויים בממשק מי פני השטח של החלבון ו/או דחיסה מקומית של מבנה החלבון בסולם זמן מהיר (יחסית לסולם הזמן של NMR)11. הצלבות המציגות משמרות כימיות גדולות שאינן ליניאריות תלות בלחץ יכולות להצביע על נוכחות של מצבים קונפורמציה באנרגיה גבוהה יותר12,13. מצד שני, שינויי עוצמת שיא מצביעים על מעברים קונפורמיים משמעותיים בסולם זמן איטי, כגון שינויים באוכלוסיות המצב המקופלות/נפרשות. נוכחות של ביניים מתקפלים או מצבי אנרגיה גבוהים יותר ניתן לזהות מ וריאציות גדולות בסדר הגודל של שינוי נפח על התגלגלות נמדד עבור שאריות שונות של חלבון נתון14,15,16,17. בהתבסס על הניסיון שלנו, אפילו חלבונים קטנים המסווגים בדרך כלל כתיקיות של שתי מדינות מציגים תגובות לא אחידות ללחץ, המספק מידע שימושי על היציבות המתקפלת המקומית שלהם. מתואר כאן פרוטוקול לרכישה וניתוח של עוצמת שיא amide 1H כימי מעביר תלות בלחץ, באמצעות חלבון מודל מוטיב זיהוי RNA מבודד 2 (RRM2) של ribonucleoprotein גרעיני הטרוגניים A1 (hnRNPA1).

<table><tbody><tr><td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>NMRCELL-B</td><td></td></tr><tr><td>Sparky3</td><td>אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו, CA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Xtreme-60 משאבת מזרק</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>XTREME-60</td><td></td></tr></tbody></table>

ניסויי nmr בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

לחץ גבוה הוא שיטת סוטה ידועה שניתן להשתמש בה כדי לערער חלבונים כדוריים ולנתק מתחמי חלבון באופן הפיך. לחץ הידרוסטטי מניע שיווי משקל תרמודינמי לכיוון המדינה(ים) עם נפח הטוחנת התחתונה. לחץ גובר מציע, אם כן, את ההזדמנויות לכוונן היטב את היציבות של חלבונים כדוריים ואת שיווי המשקל אוליגומריזציה של מתחמי חלבון. ניסויי NMR בלחץ גבוה מאפשרים אפיון מפורט של הגורמים המסדירים את היציבות של חלבונים כדוריים, מנגנוני הקיפול שלהם ומנגנוני האוליגומריזציה על ידי שילוב יכולת כוונון היציבות העדינה של סטיית לחץ ורזולוציית האתר המוצעת על ידי ספקטרוסקופיית NMR פתרון. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לחקור את היציבות המתקפלת המקומית של חלבון באמצעות קבוצה של ניסויי 2D 1H-15N שנרשמו מ 1 בר ל 2.5 kbar. השלבים הנדרשים לרכישה וניתוח של ניסויים כאלה מודגמים בנתונים שנרכשו בתחום RRM2 של hnRNPA1.

הפרוטוקול המתואר כאן שימש כדי לחקור את התלות בלחץ של RRM2, מוטיב זיהוי הרנ"א השני של hnRNPA1 (שאריות 95-106), אשר נפרש כמעט לחלוטין בטווח 2.5 kbar (&gt;90%). 1 ספקטרוםH-15N נאספו בבר אחד, 500 בר, 750 בר, 1 kbar, 1.5 kbar, 2 kbar ו 2.5 kbar(איור 2). מכיוון שאף אחד מהצלבים המקוריים לא נראה מעל רמת הרעש ב-2.5 ק"מ, כל השאריות המתאימות יוחסו לערך עוצמה של 0 בלחץ זה (איור 3A). סה"כ 45 פרופילי עוצמת לחץ בודדים הותקנו על פי משוואה 1 (Eq. 1) כדי להש...

אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים הנדרשים כדי להרכיב תא בלחץ גבוה, להגדיר ולתעד ניסויי NMR בלחץ גבוה, ולבסוף לנתח הן את עוצמת השיא והן שינויים במשמרות כימיות תחת לחץ. ניסויים אלה יכולים לספק תובנות חשובות על המסלולים המתקפלים והיציבות המבנית של חלבונים.

ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

לחץ גבוה הוא שיטת הבחירה לשינוי האוכלוסייה היחסית של מדגם קונפורמציה חלבון. זה מאוד שימושי לבידוד ואפיון מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה. בהשוואה לכל שיטות ההסתעפות, כמו pH או טמפרטורה, הלחץ של perturbation קל ליישם והפכה לחלוטין.זהו גם הפרעה מקומית, המשפיעה בעיקר על אזורים עם חללי זכוכית או נפחים ריקים. כדי להתחיל, להציג את מדגם חנקן-15-תווית לתוך צינור זירקוניה באמצעות pipette זכוכית, ולהבטיח את המושבים מדגם בתחתית הצינור. כדי למנוע את המדגם מערבוב עם נוזל השידור, לכסות את המדגם עם 200 microliters של שמן מינרלי, ולאחר מכן למלא את שאר הצינור עם נוזל שידור.שים טבעת O חד פעמית על גבי צינור הזירקוניה ולהחליק את הצינור לתוך הבסיס. לאחר מכן חברו את הצינור לקו הרצועה בלחץ גבוה והידקו את הבסיס לתא ביד. לאחר מכן להחיל 14.7 ניוטון מטר המומנט כדי למנוע דליפות בלחץ נמוך יותר.כדי לבדוק את שלמות הרכבת תאי הלחץ, לחץ על הצינור עד 300 פסים מחוץ לספקטרומטר באמצעות תמיכה בתא וכלי בלימה. לאחר 15 דקות, לאפס את הלחץ לבר אחד ולבדוק דליפות עם ניגוב נקי ללא מוך. הכנס את הצינור הלא בלחץ לספקטרומטר על-ידי הנחיית קו הרצועה בזהירות.החלק את הצינור לתוך הספקטרומטר עד שהצינור מגיע לתנוחת ישיבה לדוגמה. נעל, שים, התאם וכוון את ערוצי הפרוטיום והחנקן ושמור את ה- shims הממוטב לעתיד. הגדירו ספקטרוסקופיה ממוטבת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיה קוהרנטית חד-קוונטית הטרו והמשיכו בהקלטת ניסוי ייחוס בתנאים האטמוספריים.הקלט סדרה של ניסויים 2D מבר אחד כדי 2.5 קילובר עבור כל 500 ברים. אם ידועים שיעורי הקיפול או ההתקפה המדויקים, לאחר כל תוספת של 500 עמודות, אפשרו לדגימה להתפרק במשך 15 עד 20 דקות. כאשר נקודת ההטיה של המעבר המתקפל או המתפתח מגיעה, תעד ניסויים נוספים כדי לשפר את דיוק ההתאמה.פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את תלות הלחץ של RRM2, מוטיב זיהוי הרנ"א השני ריבונוקליאופרוטאין גרעיני A1. ספקטרוסקופיה מותאמת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיית קוהרנטיות חד-קוונטית הטרוסקסואלית נאספה בבר אחד, 1.5 קילובר, שני קילובר ו-2.5 קילובר. ה- RRM2 נפתח כמעט לחלוטין בטווח של 2.5 קילו-ביבר. פרופילי עוצמת לחץ בודדים הותקנו על פי המשוואה המוצגת כאן, כדי להשיג את השינויים המתאימים באנרגיה החופשית והנפח הרגילים של גיבס הקשורים לתגובה המתפתחת.כאשר מופה על מבנה הדומיין, שאריות עם הגודל הגדול ביותר של שינוי נפח נמצאו בתוך הליבה המבנית של הדומיין, בעוד אלה עם הגודל הקטן ביותר של שינוי נפח היו ממוקמים בעיקר בלולאות החיבור בין גדילי ביתא ו גדיל בטא לסליל מסוף C. כדי לחקור את מידת הדחיסה וההטרוגניות הקונפורמציה של הרכב המצב המקופל, נותחו השינויים הכימיים של הפרוטיום. פרופילים בודדים של משמרות כימיות פרוטיום כפונקציה של לחץ הותקנו באמצעות המשוואה המוצגת, כדי לחלץ את מקדמים ליניאריים ולא ליניאריים ספציפיים לאתר.השאריות עם הקדם הלא ליניארי הגדול ביותר נמצאו בעיקר בליבה המבנית של התחום, בעוד שאריות עם מקדמים לא ליניאריים הקטנים ביותר היו ממוקמים בעיקר בתוך לולאות המחברות את המוטיבים המבניים השונים. חשוב להגדיר את הצינור כמו לחץ להגדיר כראוי, כדי למנוע דליפות. אם תתרחש דליפה, הגשוש כנראה יצטרך להיות מוסר כדי לנקות כל זכר של שמן מינרלי.

high-pressure-nmr-experiments-for-detecting-protein-low-lying

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את טכניקת ספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בין 15חלבוני אנבופלקין מסוג פרא ומוטציה המסומנים N לבין חלבון וימנטין ללא תווית. האינטראקציה המוצלחת בין אנבופלקין פראי לווימנטין מובילה להרחבת קווים נרחבת ולהיעלמות שיא בספקטרום ה-NMR, בעוד שהיעדר אינטראקציה בין האנבופלקין המוטציה לווימנטין מביא לשיאים פתורים היטב בספקטרום ה-NMR.

תהודה מגנטית גרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית

תהודה מגנטית גרעינית היא אחד הכלים הספקטרוסקופיים החשובים ביותר. כאן מוצגת התפתחות של גישה חדשה בלחץ גבוה, כיום עד 10.1 GPa. זה פותח צוהר חדש לפיזיקה ולכימיה של חומר מעובה, שם יש חשיבות רבה לחקר לחץ גבוה.

רגישות גבוהה תהודה מגנטית גרעינית בחצי Giga-פסקל: כלי חדש לבדיקת מאפיינים אלקטרוניים והכימיים של חומר מעובה בתנאים קיצוניים

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.

שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט רכישה, עיבוד וניתוח של סדרת ניסויי NMR שמטרתם לאפיין אינטראקציות חלבון-גליקן בתמיסה. מתוארות רוב המתודולוגיות הנפוצות המבוססות על ליגנדות וחלבונים, אשר ללא ספק תורמות לתחומי הגליקוביולוגיה המבנית ומחקרי הזיהוי המולקולרי.

התרת אינטראקציות גליקן-חלבון: תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להצלה

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לאפיין דינמיקה מבנית של חלבונים באופן ספציפי לשאריות. אנו מספקים פרוטוקול מעשי להקלטת NMR 15N R1 ו- R2 הרפיה ו {1H}-15N אפקט Overhauser הטרוגרעיני (hetNOE), רגיש לפיקושניות לציר הזמן של ננו-שניות.

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

פרוטוקול מבוסס NMR זה חוקר אינטראקציות חלבון-גליקן חלשות באמצעות ציאנובירין-N ו-D-מאנוז. בשילוב שיטות זיהוי ליגנד וחלבון, הוא ממפה אתרי קשירה, מזהה השפעות אלוסטריות ומזהה קומפלקסים של מפגשים. הגישה מתארת הכנת דגימה וניתוח נתונים, ומציעה תובנות מבניות ודינמיות בעלות ערך עבור מנגנוני אבחון וזיהוי ספציפיים לגליקן.

חקר אינטראקציות חלבון-גליקן: התקדמות בתהודה מגנטית גרעינית

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג דגם ברזולוציה נמוכה ab initio ופרטים מבנית של חלבון הממברנה solubilized-חומרי ניקוי בתמיסה באמצעות פיזור ניוטרון זווית קטנה עם התאמת ניגודיות של הנוזל.

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

למד כיצד להרכיב תא לחץ גבוה ולהפעיל ניסויי NMR בלחץ גבוה לניתוח מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבונים. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי קיפול חלבונים ויציבות מבנית בביוכימיה.

ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון

גלה סרטונים נוספים