ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון
29 ביוני 2021
אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים הנדרשים כדי להרכיב תא בלחץ גבוה, להגדיר ולתעד ניסויי NMR בלחץ גבוה, ולבסוף לנתח הן את עוצמת השיא והן שינויים במשמרות כימיות תחת לחץ. ניסויים אלה יכולים לספק תובנות חשובות על המסלולים המתקפלים והיציבות המבנית של חלבונים.
לחץ גבוה הוא שיטת הבחירה לשינוי האוכלוסייה היחסית של מדגם קונפורמציה חלבון. זה מאוד שימושי לבידוד ואפיון מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה. בהשוואה לכל שיטות ההסתעפות, כמו pH או טמפרטורה, הלחץ של perturbation קל ליישם והפכה לחלוטין.
זהו גם הפרעה מקומית, המשפיעה בעיקר על אזורים עם חללי זכוכית או נפחים ריקים. כדי להתחיל, להציג את מדגם חנקן-15-תווית לתוך צינור זירקוניה באמצעות pipette זכוכית, ולהבטיח את המושבים מדגם בתחתית הצינור. כדי למנוע את המדגם מערבוב עם נוזל השידור, לכסות את המדגם עם 200 microliters של שמן מינרלי, ולאחר מכן למלא את שאר הצינור עם נוזל שידור.
שים טבעת O חד פעמית על גבי צינור הזירקוניה ולהחליק את הצינור לתוך הבסיס. לאחר מכן חברו את הצינור לקו הרצועה בלחץ גבוה והידקו את הבסיס לתא ביד. לאחר מכן להחיל 14.7 ניוטון מטר המומנט כדי למנוע דליפות בלחץ נמוך יותר.
כדי לבדוק את שלמות הרכבת תאי הלחץ, לחץ על הצינור עד 300 פסים מחוץ לספקטרומטר באמצעות תמיכה בתא וכלי בלימה. לאחר 15 דקות, לאפס את הלחץ לבר אחד ולבדוק דליפות עם ניגוב נקי ללא מוך. הכנס את הצינור הלא בלחץ לספקטרומטר על-ידי הנחיית קו הרצועה בזהירות.
החלק את הצינור לתוך הספקטרומטר עד שהצינור מגיע לתנוחת ישיבה לדוגמה. נעל, שים, התאם וכוון את ערוצי הפרוטיום והחנקן ושמור את ה- shims הממוטב לעתיד. הגדירו ספקטרוסקופיה ממוטבת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיה קוהרנטית חד-קוונטית הטרו והמשיכו בהקלטת ניסוי ייחוס בתנאים האטמוספריים.
הקלט סדרה של ניסויים 2D מבר אחד כדי 2.5 קילובר עבור כל 500 ברים. אם ידועים שיעורי הקיפול או ההתקפה המדויקים, לאחר כל תוספת של 500 עמודות, אפשרו לדגימה להתפרק במשך 15 עד 20 דקות. כאשר נקודת ההטיה של המעבר המתקפל או המתפתח מגיעה, תעד ניסויים נוספים כדי לשפר את דיוק ההתאמה.
פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את תלות הלחץ של RRM2, מוטיב זיהוי הרנ"א השני ריבונוקליאופרוטאין גרעיני A1. ספקטרוסקופיה מותאמת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיית קוהרנטיות חד-קוונטית הטרוסקסואלית נאספה בבר אחד, 1.5 קילובר, שני קילובר ו-2.5 קילובר. ה- RRM2 נפתח כמעט לחלוטין בטווח של 2.5 קילו-ביבר. פרופילי עוצמת לחץ בודדים הותקנו על פי המשוואה המוצגת כאן, כדי להשיג את השינויים המתאימים באנרגיה החופשית והנפח הרגילים של גיבס הקשורים לתגובה המתפתחת.
כאשר מופה על מבנה הדומיין, שאריות עם הגודל הגדול ביותר של שינוי נפח נמצאו בתוך הליבה המבנית של הדומיין, בעוד אלה עם הגודל הקטן ביותר של שינוי נפח היו ממוקמים בעיקר בלולאות החיבור בין גדילי ביתא ו גדיל בטא לסליל מסוף C. כדי לחקור את מידת הדחיסה וההטרוגניות הקונפורמציה של הרכב המצב המקופל, נותחו השינויים הכימיים של הפרוטיום. פרופילים בודדים של משמרות כימיות פרוטיום כפונקציה של לחץ הותקנו באמצעות המשוואה המוצגת, כדי לחלץ את מקדמים ליניאריים ולא ליניאריים ספציפיים לאתר.
השאריות עם הקדם הלא ליניארי הגדול ביותר נמצאו בעיקר בליבה המבנית של התחום, בעוד שאריות עם מקדמים לא ליניאריים הקטנים ביותר היו ממוקמים בעיקר בתוך לולאות המחברות את המוטיבים המבניים השונים. חשוב להגדיר את הצינור כמו לחץ להגדיר כראוי, כדי למנוע דליפות. אם תתרחש דליפה, הגשוש כנראה יצטרך להיות מוסר כדי לנקות כל זכר של שמן מינרלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט את הרכבת תא בלחץ גבוה ואת ההגדרות לניסויי NMR בלחץ גבוה. הוא שם דגש על ניתוח עוצמת הפסגות ושינויים בהסחה כימית תחת לחץ, ומספק תובנות לגבי נתיבי קיפול של חלבונים ויציבות מבנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה מבנית
רקע
- לחץ גבוה משנה מצבים קונפורמציונליים של חלבונים.
- זוהי שיטה של הפרעה הפיכה.
- הלחץ משפיע בעיקר על אזורים בעלי נפחי חלל.
- שימושי לאפיון מצבים קונפורמציוניים באנרגיה גבוהה.
מטרת המחקר
- תיאור השלבים להרכבת תא בלחץ גבוה.
- הקמה והקלטה של ניסויי NMR בלחץ גבוה.
- ניתוח השפעות הלחץ על מבני חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- החדרת דגימות מסומנות בחנקן-15 לתוך צינור זירקוניה.
- כיסוי הדגימות בשמן מינרלי למניעת ערבוב.
- מילוי הצינור בנוזל העברה.
- ביצוע ניסויי NMR תחת לחץ גבוה.
תוצאים עיקריים
- מתודולוגיה מפורטת להקמת מערך NMR בלחץ גבוה.
- תובנות לגבי מסלולי קיפול של חלבונים.
- ניתוח של עוצמת שיאים ושינויים בהסחה כימית.
- אפיון של יציבות מבנית תחת לחץ.
מסקנות
- NMR בלחץ גבוה יעיל לחקר דינמיקה של חלבונים.
- מספק תובנות בעלות ערך לגבי מצבים קונפורמציוניים של חלבונים.
- ניתן ליישם את המתודולוגיה במגוון מחקרי חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
NMR בלחץ גבוה מאפשר לצוותי ביו-פרמה לבחון מצבים קונפורמציוניים בעלי אנרגיה גבוהה ואוכלוסייה נמוכה, שהם קריטיים להבנת קיפול חלבונים, יציבות ואוליגומריזציה. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ומפחיתה סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי חשיפת פרטים מכניסטיים שאינם נגישים בשיטות הפרעה סטנדרטיות. שילוב של NMR מבוסס לחץ בתהליכי עבודה של גילוי תומך במיון מושכל יותר של תיקי פיתוח ובקבלת החלטות על קידום מותאמות סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על מצבים קונפורמציוניים נדירים הרלוונטיים לתיקוף פונקציונלי של מטרה.
- תומך בהורדת סיכונים מכניסטית על ידי מיפוי יציבות ספציפית לאתר ומעברי קיפול.
- משפר את הביטחון החזוי בבחירת מטרה באמצעות כימות יציבות מקומית וגלובלית של החלבון.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מסייע בהכנת מערכות חלבונים מתוקפות לסריקות המשך באמצעות אפיון של שיווי משקל של קיפול ואוליגומריזציה.
- מספק קריאות כמותיות ברזולוציית אתר לצורך סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה.
- מאפשר השוואה חסונה של וריאנטים של חלבונים או השפעות של ליגנדים תחת הפרעה מבוקרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתונים על יציבות מבנית למנגנוני קיפול שגוי או אגרגציה של חלבונים הרלוונטיים למחלה, במידה ורלוונטי.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן מידע על הטרוגניות קונפורמציונית ודחיסות.
- מפחיתה סיכונים בתהליך התרגום (translational progression) על ידי הבהרת ליקויים ביופיזיקליים בשלבים מוקדמים של פיתוח התרופה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
NMR בלחץ גבוה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה להפרעה כמותית והפיכה לצורך אפיון חלבונים.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבחינת השערות על מנגנוני קיפול ושיווי משקל של אוליגומריזציה.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות הניתנות לשחזור של מעברים קונפורמציוניים לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מייצר פרופילי עוצמה והסטה כימית ספציפיים לאתר להשוואת מצבים מבניים.
- מחקר תרגומי: מספק מידע על הטרוגניות קונפורמציונית הרלוונטית למודלים של מחלות, כאשר מערכת החלבון תומכת בכך.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק יכולת אנליטית הניתנת לשימוש חוזר עבור מטרות חלבון ושאלות מנגנוניות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות חלבון.
- ערך תפעולי: מציע הפרעה סטנדרטית, הפיכה וניתנת להרחבה ליצירת נתונים הניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ויעילות הונית על ידי הבהרת ליקויים מבניים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום מטרות חלבון על בסיס נתונים ביופיזיקליים חזקים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרוסקופיית NMR ובמכשור בלחץ גבוה.
- דורש חומרה ייעודית, כולל תאי לחץ גבוה ומערכות הכלה.
- מחייב פרוטוקולים קפדניים להכנת דגימות ומניעת דליפות.
- עשוי לדרוש התאמה למערכות חלבונים שונות או לאסטרטגיות סימון שונות.
- מגבלות תפעוליות כוללות את טווח הלחץ ואת זמן ההגעה לשיווי משקל לצורך מדידות מדויקות.
