4,302 Views
•
05:20 min
•
September 23, 2021
DOI:
פרוטוקול זה מראה ייצור של תולעת צבא סתיו מהונדסת באמצעות מערכת טרנספורמציה מבוססת piggyBac. אנו מקווים כי שיטות אלה יועילו לשיפור השינוי, לא רק בתולעת צבא הסתיו, אלא גם חרקים lepidopteran. השיטה המתוארת כאן הופכת את הטרנספורמציה הנבטית של חרקי מזיקים לפידופרנים ליעילה.
מדגים את ההליך יהיה ד”ר שין חן, פוסט דוקטורט במעבדה שלי. התחל על ידי הצבת 12 גלמים זכר ו 12 גלמים נקבה בקופסה. מניחים פתרון 10% סוכרוז בתיבה להאכלת מבוגרים.
מכסים את הקופסה במגבת נייר. ביום השני לאחר ההסתה, לחשוף את המבוגרים לאור אינטנסיבי בן לילה. ביום השלישי לאחר ההסתה, העבירו את המבוגרים למקום חשוך.
לאסוף את העוברים בתוך שעתיים לאחר מעל המיקום. מוסיפים טיפות מים לחתיכת מגבת הנייר עם ביצים טריות שנשמרות בצלחת פטרי על קרח. מעבירים את הביצים בעדינות למגלשת זכוכית עם מברשת עדינה ומיישרים אותן אחת אחת על מגלשת זכוכית.
שמור את שקופיות הזכוכית עם הביצים מיושרות על קרח לפני microinjection. הזריקו תערובת של 200 ננוגרם לכל מיקרוליטר piggyBac מבוסס EGFP מבטא plasmid, 200 ננוגרם לכל microliter piggyBac transposase mRNA, ומים מזוקקים סטריליים לתוך הביצים באמצעות לחץ הפיצוי של microinjector האוטומטי. שמור את הביצים המוזרקות ב 27 פלוס או מינוס תואר אחד צלזיוס, 60 פלוס או מינוס 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
מאכילים את הזחלים בקעו בדיאטה מלאכותית, ומעבירים כל זחל לכוס אחת קטנה בשלב ההקלה והכוכבים המוקדמים. לאסוף את הגולם ומניחים כ 150 נקבה ו 150 גלמים זכר בכלוב. לתלות כמה חתיכות של מגבות נייר 30 ס”מ על 15 ס”מ בגודל בכלוב כדי לאסוף את הביצים.
לאסוף את מגבות הנייר עם ביצים מדי יום, ולשמור את הביצים בתנאים המתאימים עד הבקיעה. שמור את זחלי הניאון בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לשתק אותם, ולאחר מכן להעביר אותם על צלחת קרה כקרח. מסך זחלי ניאון משותק תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.
בחר את יילודים חיוביים EGFP, להעלות אותם לשלב הגולי, בסביבות שבועיים ב 27 פלוס או מינוס תואר אחד צלזיוס. piggyBac hyperactivesase mRNA מסונתז במבחנה זוהה באמצעות ג’ל אגרוז 1%. העוברים שהוזרקו ל-PDS לא הראו אות EGFP, ואילו הפלסמיד המבטא EGFP ו- piggyBac transposase עוברים מוזרקים מ- mRNA הראו פלואורסצנטיות EGP, מה שמצביע על כך שבניית piggyBac הצליחה.
זחלי G1 שהתקבלו מביצים הנובעות מצלב עצמי של מבוגרים G0 הראו אות EGFP חזק. קטע המכיל את האמרגן ואת שבר EGFP הוגבר בהצלחה באמצעות ה- DNA הגנומי המבודד מהזחלים החיוביים ל- EGFP כתבנית. עם זאת, אותו שבר לא זוהה כאשר DNA גנומי היה מבודד מן הזחלים מסוג בר כמו התבנית.
הביצים למיקרו-ינון צריכות להיות טריות ככל האפשר ויש לשמור עליהן תמיד על קרח לפני המיקרו-יז’ק כדי להאט את התפתחותן. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לענות על שאלות בגנומיקה תפקודית של חרקים מזיקים ולפתח שיטות בקרה גנטיות למזיק העולמי הזה.
טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.
09:45
Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata
Related Videos
9066 Views
08:24
The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System
Related Videos
6998 Views
10:02
piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells
Related Videos
17347 Views
10:15
Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos
Related Videos
10612 Views
05:32
Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila
Related Videos
2036 Views
10:58
Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma
Related Videos
12972 Views
07:42
Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing
Related Videos
7497 Views
09:42
Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection
Related Videos
2755 Views
05:20
Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda
Related Videos
4.3K Views
02:09
PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System
Related Videos
1.4K Views
Read Article
Cite this Article
Chen, X., Palli, S. R. Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda. J. Vis. Exp. (175), e62714, doi:10.3791/62714 (2021).
Copy