Name: piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: למד שיטת טרנספורמציה של תאי זרע בתולעת צבא הסתיו Spodoptera frugiperda באמצעות מערכת piggyBac. הטכניקה משפרת יעילות ההנדסה הגנטית בחרקים ותורמת לפיתוח שיטות בקרה גנטית במזיקים חקלאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר שדווח נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע I/UCRC, המרכז לטכנולוגיות ניהול פרוקי רגליים, תחת Grant No IIP-1821936 ועל ידי שותפים בתעשייה, חקלאות ויוזמת מחקר מזון מענק תחרותי מס ' 2019-67013-29351 והמכון הלאומי למזון וחקלאות, משרד החקלאות האמריקאי (2019-67013-29351 ו- 2353057000).

1. סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA
הערה: רצף הקידוד המלא של רצף hyPBase היה מסונתז והוכנס לווקטור pTD1-Cas9 (ראה טבלת החומרים) כדי לייצר את מבנה בסיס ה- pTD1-hyPBase, המכיל קלטת הבעת hyPBase, מקדם T7: פוליהדרין-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). הרצף המלא של מבנה pTD1-hyPBase מסופק בחומר המשלים.
<ol><li>הכנת התבנית לסינתזה במבחנה<ol>
<li>בצע תגובת PCR כדי להגביר את הקלטת המביעה hyPBase באמצעות פריימר קדמי, 5'- atgctgtgaaataccgcacagatgcg-3', ו- פריימר הפוך 5'- tagaggccccaaggttatgtctag-3', פולימראז בעל נאמנות גבוהה ו- pTD1-hyPBase plasmid כתבנית. הערה: תגובת PCR (נפח סופי של 50 μL) מכיל 5.0 μL של 10x חיץ תגובה, 4.0 μL של 10 mM deoxynucleoside טריפוספט (dNTP), 1.0 μL של plasmid (50 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL של פולימראז אמינות גבוהה, 1.0 μL כל אחד של 10 מיקרומטר קדימה והפוך פריימרים, ו 33 μL של מים ללא נוקלאז. ההגדרות היו כדלקמן: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) במשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 98 °C (50 °F) במשך 10 מעלות צלזיוס, 60 °C (70 °F) במשך 15 °C (68 °F) למשך 2 דקות.</li>
		<li>בדוק את מוצר PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V טריס אצטט-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (TAE) חוצץ במשך 30 דקות לטהר את המוצר עם ערכת החילוץ ג'ל. הערה: אין להשתמש בערכת טיהור המוצר PCR. אפילו כמות זעירה של pTD1-hyPBase plasmid מקטין באופן משמעותי את היעילות של סינתזה במבחנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA באמצעות ערכה מסחרית<ol>
<li>להפשיר לחלוטין את הריאגנטים הקפואים, לשמור את האנזים ואת תמיסת 2x NTP /CAP על קרח, ולהשאיר את חיץ תגובה 10x מופשר בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להרכיב את התגובה בטמפרטורת החדר על ידי הוספת הרכיבים הבאים: פתרון 2x NTP / CAP: 10 μL; מאגר תגובה 10x: 2 μL; DNA תבנית: 0.1-0.2 מיקרוגרם; תערובת אנזימים: 2 μL; מים ללא נוקלאז עד 20 μL.</li>
		<li>מערבבים את הריאגנטים ביסודיות על ידי צנרת עדינה של התערובת למעלה ולמטה ודגרה ב 37 °C (2-4 שעות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>התאוששות של mRNA מסונתז על ידי משקעים ליתיום כלוריד<ol>
<li>הוסף 30 μL של פתרון משקעים LiCl, לערבב ביסודיות על ידי הבהוב הצינור, ולאחר מכן לשמור על -20 °C (50 °F) במשך ≥ 30 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות במהירות המרבית, ולהסיר בזהירות את supernatant.</li>
		<li>לשטוף את הכדור פעם אחת עם 1 מ"ל של 70% אתנול, מחדש צנטריפוגה, ולהסיר את supernatant בזהירות.</li>
		<li>יבש את הכדור בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות, ולאחר מכן resuspend הכדור עם 20-40 μL של מים ללא נוקלאז.</li>
		<li>לדלל 1 μL של פתרון mRNA עם 9 μL של מים ללא נוקלאז. קח 2 μL כדי לקבוע את ריכוז mRNA ולהשתמש 8 μL כדי לבדוק את איכות mRNA על ג'ל אגרוז 1% ב 100 V במאגר TAE טרי במשך 40 דקות.</li>
		<li>Aliquot פתרון mRNA ולאחסן קפוא ב -70 °C (70 °F) עד שנה אחת. הערה: אין לייבש לחלוטין את גלולה mRNA; זה עלול להיות קשה יותר להמיס אותו במים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מיקרו-ינון
<ol><li>אוסף ביצים<ol>
<li>מניחים 12 גלמים זכרים ו-12 גלמים נשיים בקופסה 15 ס"מ על 15 ס"מ על 10 ס"מ. מכסים את הקופסה במגבת נייר. מניחים 10% תמיסת סוכרוז בתיבה להאכלת מבוגרים.</li>
		<li>ביום 2 לאחר העיקול, לחשוף את המבוגרים לאור אינטנסיבי לילה.</li>
		<li>ביום 3 לאחר העיקול, העבירו את המבוגרים מצעד 2.1.2 למקום חשוך. לאסוף את העוברים בתוך 2 שעות לאחר oviposition.</li>
		<li>מוסיפים טיפות מים לחתיכת מגבת נייר עם ביצים טריות שנשמרות בצלחת פטרי על קרח. מעבירים את הביצים בעדינות למגלשת זכוכית עם מברשת עדינה ומיישרים אותן אחת אחת על מגלשת זכוכית. שמור את שקופיות הזכוכית עם הביצים המיושרות על קרח לפני microinjection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדרת מיקרו-ערך<ol>
<li>הזריקו תערובת של חלבון פלואורסצנטי ירוק מהונדס (EGFP) המבטא פלסמיד (200 ננוגרם/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ננוגרם/ μL), ומים מזוקקים סטריליים לתוך הביצים,תוך שימוש בלחץ הפיצוי של המיקרו-נג'ר האוטומטי (ראה טבלת החומרים ).</li>
		<li>שמור את הביצים המוזרקות ב 27 ± 1 °C (60),60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.</li>
		<li>האכילו את הזחלים בקעו בדיאטה מלאכותית, והעבירו כל זחל לכוס אחת קטנה בשלב ה-instar המוקדם שלה-3 (באורך של כ-6 מ"מ, וצבע הגוף הופך לשחור).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. סינון פלואורסצנטיות ומעבר גנטי
<ol><li>לאסוף את הגולם ומניחים ~ 150 גלמים נקבה ~ 150 גולם זכר בכלוב 35 ס"מ x 35 ס"מ x 35 ס"מ. לתלות כמה חתיכות של מגבות נייר (~ 30 ס"מ x 15 ס"מ) בכלוב כדי לאסוף את הביצים.</li>
	<li>לאסוף את מגבות הנייר עם ביצים מדי יום, ולשמור את הביצים ב 27 ± 1 °C (60°F), 60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.</li>
	<li>שמור את זחלי ניאון ב 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות כדי לשתק אותם, ולאחר מכן להעביר אותם על צלחת קרה כקרח.</li>
	<li>מסך זחלי ניאון משותקים תחת סטריאופיקום פלואורסצנטי. בחר את יילודים חיוביים EGFP, להעלות אותם לשלב הגועל ב ~ 2 שבועות ב 27 ± 1 °C (50 °F), ולהפריד אותם על ידי סקס על פי הבדלי פנוטיפ בקטעי הבטן הגחון. הערה: הגולם הנשי יש פתח איברי מין דמוי חריץ על קטע הבטן השמיני ואת השוליים cephalic של החלקים התשיעי והעשירי מתעקל לכיוון פתח איברי המין. פתיחת איברי המין של הגולם הגברי יש עלייה קלה על קטע הבטן התשיעי.</li>
	<li>מניחים את הגולם החיובי EGFP ואת הגולם הפראי של המין השני בזכר: יחס נשי של 1:1 בכלוב. Sib לחצות את המבוגרים ביטוי EGFP לייצר את הדורות הבאים.</li>
</ol>4. זיהוי PCR של החדרה מהונדסת
<ol><li>לחלץ DNA גנומי מן הסוג הפראי EGFP חיובי זחלים בודדים באמצעות כל ערכת מיצוי DNA גנומי מסחרי בעקבות הוראות היצרן.</li>
	<li>ביצוע תגובת PCR באמצעות ה- DNA הגנומי כתבנית; פריימר קדמי, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' הממוקם באזור האמרגן ie1; פריימר הפוך, 5'- aagcactgcacgegtaggtcag-3' הממוקם באזור EGFP של וקטור הטרנספורמציה.</li>
	<li>הגדר כל תגובת PCR (נפח סופי של 40 μL) כדי להכיל 20 μL של תערובת פולימראז, 1.0 μL של DNA גנומי (40 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL כל אחד של 10 μM קדימה ופריימרים הפוכים, ו 17 μL של מים ללא נוקלאז. השתמש בהגדרות הבאות: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) למשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 95 °C (70 °F) עבור 20 s, 56 °C (56 °F) עבור 20 s ו 68 °C (70 °F) עבור 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בדוק את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V במשך 30 דקות.</li>
</ol>5. קביעת אתר ההחדרה הטרנסגני
<ol><li>בצעו TAIL-PCR ביעילות גבוהה באמצעות DNA גנומי כתבנית לקביעת אתר האינטגרציה של החדרת טרנסג'נים בחרקים החיוביים ל- EGFP.<ol>
<li>בצע את תגובות PCR בעקבות השלבים המתוארים במקום אחר9.<ol>
<li>השתמש בשלושה פריימרים, P1: 5'-atcagtgtacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', ו- P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgatcgcgct-3', הספציפיים לווקטור piggyBac, בשלושת הסיבובים של תגובת PCR, בהתאמה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>רצף את מוצרי ה- PCR הסופיים כדי לקבוע את אתר האינטגרציה.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transformation+with+piggyBac%3A+getting+the+number+of+injections+just+right%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li>
<li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).</li>
<li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li>
<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
<li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיעור הנמוך של טרנספוזיציה וקושי בהעברת רכיבים מהונדסים לעוברים טריים מגבילים את ההצלחה של טרנספורמציה נבטים בחרקים רבים שאינם מודל, במיוחד אלה מהסדר, לפידופטרה. כדי להגדיל את קצב הטרנספורמציה של חיידקים, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase הנפוץ ביותר (hyPBase)פותחה 7,10. עד כה, טרנספורמציה חיידקית מוצלחת חרקים lepidopteran מדווח בעיקר במודל תולעת משי חרקים, Bombyx מורי11. עם זאת, ביצוע עבודות טרנסגנזה בחרקים לפידו...

תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, היא ילידת אזורים טרופיים וסובטרופיים של אמריקה. נכון לעכשיו, זהו אוכל עשב חרקים הרסני ביותר מ -100 מדינות ברחבי העולם1. זחלי FAW ניזונים מיותר מ־350 צמחים מארחים, כולל כמה גידולי מזון חשובים2. יכולת ההגירה החזקה של בוגרי FAW תורמת להתפשטות המהירה האחרונה שלה מיבשת אמריקה למקומות אחרים1,2. כתוצאה מכך, חרק זה מאיים כעת על ביטחון המזון ברחבי העולם. יישום טכנולוגיות חדשות עשוי להקל על מחקרים מתקדמים ב- FAW ולספק אסטרטגיות חדשניות לניהול מזיק זה.
שינוי חיידקי חרקים שימש לחקר תפקוד הגנים ולייצור חרקים מהונדסים לשימוש בשליטה גנטית3,4. בין השיטות השונות המשמשות להשגת טרנספורמציה גנטית בחרקים, השיטה המבוססת על אלמנט piggyBac היא השיטה הנפוצה ביותר5. עם זאת, בשל השיעור הנמוך של טרנספוזיציה, זה עדיין מאתגר לנהל טרנסגנזה בחרקים שאינם מודל. לאחרונה, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase (hyPBase) פותחה6,7. טרנספורמציה Germline הושגה לאחרונה FAW8, שהוא הדו"ח הראשון שהשתמש hyPBase חרקים lepidopteran. בדו"ח זה, מידע מפורט על שימוש hyPBase mRNA ביצירת FAW מהונדס מתואר. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשיג את השינוי של חרקים lepidopteran אחרים.

<table><tbody><tr><td>1.5 אינץ' לחמניות כותנה דנטליות</td><td>PlastCare ארה"ב</td><td>8542025591</td><td>מכסי</td></tr><tr><td>סופלה 1 גרם</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 oz כוסות סופלה</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>מעדנייה</td></tr><tr><td>48 אונקיות מיכלי מעדנייה מפלסטיק</td><td>Genpack</td><td>AD48</td> סט <td></td></tr><tr><td>מסנני תוסף (ירוק)</td> <td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>הקרנה</td></tr><tr><td>מכשירי סאטר</td> <td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>BF100-50-10</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח היקף</td><td>ניקון</td><td>SMZ745T</td><td>הקרנה</td></tr><tr><td>מלקחיים במשקל נוצה</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>מגן מרזב מגן מרזב</td><td>ThermWell מוצרי</td><td>VX620</td><td></td></tr><tr><td>היפוך מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>IX71</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשירי סאטר</td><td>P-1000</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>הזרקה</td></tr><tr><td>NightSea מערכת מלאה</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>הקרנת</td></tr><tr><td>גז חנקן</td><td>AWG/ סקוט-גרוס</td><td>NI 225</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>מגבות נייר</td><td>באונטי</td><td>&nbsp; 43217-45074</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Spodoptera frugiperda תזונה מלאכותית</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [בקשת מין/כמות]</td> <td>REARING</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Eggs</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [בקשת מין/כמות]</td> <td>REARING</td></tr><tr><td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td><td>תערובת פולימראז</td></tr></tbody></table>

piggybac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

החדרה יציבה של מטען גנטי לגנומי חרקים באמצעות אלמנטים הניתנים להחלפה היא כלי רב עוצמה למחקרים גנומיים פונקציונליים ולפיתוח אסטרטגיות לניהול מזיקים גנטיים. האלמנט הנפוץ ביותר לשינוי חרקים הוא piggyBac, ושינוי נבטים מבוסס piggyBacנערך בהצלחה בחרקים לדוגמה. עם זאת, עדיין קשה להשתמש בטכנולוגיה זו בחרקים שאינם מודל הכוללים מזיקים חקלאיים. מאמר זה מדווח על טרנספורמציה נבט של מזיק חקלאי גלובלי, תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, באמצעות piggyBac transposase היפראקטיבי (hyPBase).
בעבודה זו, ה- hyPBase mRNA יוצר ושימש במקום פלסמיד עוזר במיקרו-בייג'ציות עובריות. שינוי זה הוביל לדור המוצלח של FAW מהונדס. יתר על כן, מתוארים גם שיטות הסינון של בעלי חיים מהונדסים, זיהוי מהיר מבוסס PCR של החדרת טרנסג'נים וקביעה אסימטרית תרמית של PCR (TAIL-PCR) של אתר האינטגרציה. לפיכך, מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור FAW מהונדס, אשר יקל על transgenesis מבוסס piggyBacב- FAW וחרקים לפידופטרנים אחרים.

מבנה לביטוי של מקדם T7 המכיל hyPBase: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: אות פולי (A) נוצר (איור 1A) והוגבר כשבר PCR ~ 2.2 kb כדי לסנתז hyPBase mRNA במבחנה (איור 1B). לאחר מכן, ה- hyPBase mRNA יוצר ונחשף לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. ה- mRNA בגודל הצפוי (כ- 1.1 kb band) זוהה על ג'ל אגרוז 1% (איור 1C).
לאחר מכן הוכן מבנה ביטוי EGFP המבוסס על piggyBac(איור 2A).<...

טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

פרוטוקול זה מראה ייצור של תולעת צבא סתיו מהונדסת באמצעות מערכת טרנספורמציה מבוססת piggyBac. אנו מקווים כי שיטות אלה יועילו לשיפור השינוי, לא רק בתולעת צבא הסתיו, אלא גם חרקים lepidopteran. השיטה המתוארת כאן הופכת את הטרנספורמציה הנבטית של חרקי מזיקים לפידופרנים ליעילה.מדגים את ההליך יהיה ד"ר שין חן, פוסט דוקטורט במעבדה שלי. התחל על ידי הצבת 12 גלמים זכר ו 12 גלמים נקבה בקופסה. מניחים פתרון 10% סוכרוז בתיבה להאכלת מבוגרים.מכסים את הקופסה במגבת נייר. ביום השני לאחר ההסתה, לחשוף את המבוגרים לאור אינטנסיבי בן לילה. ביום השלישי לאחר ההסתה, העבירו את המבוגרים למקום חשוך.לאסוף את העוברים בתוך שעתיים לאחר מעל המיקום. מוסיפים טיפות מים לחתיכת מגבת הנייר עם ביצים טריות שנשמרות בצלחת פטרי על קרח. מעבירים את הביצים בעדינות למגלשת זכוכית עם מברשת עדינה ומיישרים אותן אחת אחת על מגלשת זכוכית.שמור את שקופיות הזכוכית עם הביצים מיושרות על קרח לפני microinjection. הזריקו תערובת של 200 ננוגרם לכל מיקרוליטר piggyBac מבוסס EGFP מבטא plasmid, 200 ננוגרם לכל microliter piggyBac transposase mRNA, ומים מזוקקים סטריליים לתוך הביצים באמצעות לחץ הפיצוי של microinjector האוטומטי. שמור את הביצים המוזרקות ב 27 פלוס או מינוס תואר אחד צלזיוס, 60 פלוס או מינוס 10% לחות יחסית עד הבקיעה.מאכילים את הזחלים בקעו בדיאטה מלאכותית, ומעבירים כל זחל לכוס אחת קטנה בשלב ההקלה והכוכבים המוקדמים. לאסוף את הגולם ומניחים כ 150 נקבה ו 150 גלמים זכר בכלוב. לתלות כמה חתיכות של מגבות נייר 30 ס"מ על 15 ס"מ בגודל בכלוב כדי לאסוף את הביצים.לאסוף את מגבות הנייר עם ביצים מדי יום, ולשמור את הביצים בתנאים המתאימים עד הבקיעה. שמור את זחלי הניאון בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לשתק אותם, ולאחר מכן להעביר אותם על צלחת קרה כקרח. מסך זחלי ניאון משותק תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי.בחר את יילודים חיוביים EGFP, להעלות אותם לשלב הגולי, בסביבות שבועיים ב 27 פלוס או מינוס תואר אחד צלזיוס. piggyBac hyperactivesase mRNA מסונתז במבחנה זוהה באמצעות ג'ל אגרוז 1%. העוברים שהוזרקו ל-PDS לא הראו אות EGFP, ואילו הפלסמיד המבטא EGFP ו- piggyBac transposase עוברים מוזרקים מ- mRNA הראו פלואורסצנטיות EGP, מה שמצביע על כך שבניית piggyBac הצליחה.זחלי G1 שהתקבלו מביצים הנובעות מצלב עצמי של מבוגרים G0 הראו אות EGFP חזק. קטע המכיל את האמרגן ואת שבר EGFP הוגבר בהצלחה באמצעות ה- DNA הגנומי המבודד מהזחלים החיוביים ל- EGFP כתבנית. עם זאת, אותו שבר לא זוהה כאשר DNA גנומי היה מבודד מן הזחלים מסוג בר כמו התבנית.הביצים למיקרו-ינון צריכות להיות טריות ככל האפשר ויש לשמור עליהן תמיד על קרח לפני המיקרו-יז'ק כדי להאט את התפתחותן. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לענות על שאלות בגנומיקה תפקודית של חרקים מזיקים ולפתח שיטות בקרה גנטיות למזיק העולמי הזה.

hyperactive-piggybac-transposase-mediated-germline-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך...

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

ב אורגניזמים מודל, transgenesis יכול לתפעל פונקציות גן בעוד RNAi יכול מציאה תעתיקי mRNA ספציפי 1-2. פרוטוקול זה נועד להמחיש את טכניקות צורך להציג DNA מועבר ביציבות וחולפת RNA גדילי כפול לתוך נמטודות...

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

כאן אנו מציגים פרוטוקול להזריק ביצי קריקט, טכניקה המשמשת כשיטה היסוד בניסויים רבים בקריקט, כולל, אך לא מוגבל, הפרעה RNA ומניפולציה גנומית.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

ערכת הכלים הגנומית הפונקציונלית עבור הנמטודות הטפיליות סטרונגילואידים סטרקורליס וסטריונגילודים ראטי כוללת טרנסגנזה, מוטגנזה בתיווך CRISPR/Cas9 ו-RNAi. פרוטוקול זה ידגים כיצד להשתמש במיקרו-איניג'קציה תוך-גונדלית כדי להכניס טרנסג'נים ורכיבי קריספר לתוך S. stercoralis ו - S. ratti.

יצירת חומרים מהונדסים ונוקאאוטים במינים סטרונגילואידים על ידי מיקרו-אינטגרציה

למד שיטת טרנספורמציה של תאי זרע בתולעת צבא הסתיו Spodoptera frugiperda באמצעות מערכת piggyBac. הטכניקה משפרת יעילות ההנדסה הגנטית בחרקים ותורמת לפיתוח שיטות בקרה גנטית במזיקים חקלאיים.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

גלה סרטונים נוספים