Name: מודל מכרסם איסכמי שלם של קרום הלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: חקור מודל איסכמי שלם של קרום הלב בעכברים לשימור חלל הפריקרד ותכולתו. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקיד הקרום בתיקון הלב לאחר אוטם שריר הלב וזיהוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עכברי C57BL/6J זכרים ונקבות בגילאי 8-14 שבועות שימשו לניסויים אלה. פרוטוקול זה קיבל אישור אתי מוועדת הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קלגרי ועוקב אחר כל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים.
1. הכנת עכבר וניתוח
<ol><li>לעקר כלי ניתוח (באמצעות מעקר חרוזים או אוטוקלב).</li>
	<li>שקול עכבר למשקל טרום ניתוחי ומינון משכך כאבים.</li>
	<li>הניחו את העכבר בקופסת אינדוקציה עם 4% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן. אשר את מישור ההרדמה על ידי צביטה בהונות והתבוננות בבעל החיים מחוסר רפלקס.</li>
	<li>להזריק משכך כאבים תת עורית (0.1 מ"ג / ק"ג של Buprenorphine) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הניחו את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח ושמרו על הרדמה עם 3% איזופלוראן המועבר דרך חרוט האף. יש למרוח משחה אופטלמית כדי למנוע יובש בעיניים בכל עין.</li>
	<li>לגלח את השיער מאזורי הניתוח של החזה והצוואר.</li>
	<li>רסנו את כפות העכבר והניחו אותן על שולחן הניתוחים.</li>
	<li>אינטובציה של העכבר על ידי החדרת קטטר חלק של 23 גרם לתוך קנה הנשימה דרך הפה והלוע.<ol><li>לאוורר את העכבר לאחר אינטובציה עם 2% איזופלוראן ו-100% חמצן כגז נשא באמצעות מכונת הנשמה מסחרית (ראו טבלת חומרים) בקצב של 110 נשימות לדקה, נפח גאות של 250 μL, ולחץ סופי חיובי (PEEP) של 4 מ"מ כספית.</li>
	</ol></li>
	<li>גלגלו את העכבר 30% על צדו הימני כדי למקם את הצד השמאלי של החזה לניתוח.</li>
	<li>נקו את אזור הניתוח עם 3 פילינגים מתחלפים של 70% אתנול ובטאדין בתנועה מעגלית (ראוטבלת חומרים). הניחו וילונות כירורגיים סטריליים סביב אזור הניתוח.</li>
	<li>בצע חתך רוחבי של 2-3 ס"מ בעור החזה כדי לדמיין את שרירי החזה בצד שמאל. חותכים את החזה מז'ור ומינור באמצעות חתך של 1 ס"מ מקו האמצע כלפי חוץ כדי לדמיין את השרירים הבין-קוסטליים בין הצלעות השלישית והרביעית. הערה: יש להקפיד על מניעת דימום עודף משריר החזה באמצעות צריבה של כלי דם מדממים.</li>
	<li>בצע חתך של 2 ס"מ בשריר האינטרקוסטלי השמאלי כדי להכניס אוויר (על ידי תנועת אוויר פסיבית) לחלל החזה כדי לאפשר ללב ולריאות ליפול מהחתך הניתוחי. יתר על כן, להרחיב את הפתח בעזרת מכשיר צריבה (ראה טבלת חומרים) כדי להחדיר את intercostal ולמנוע דימום הערה: יש להפסיק את מכונת ההנשמה באופן זמני במהלך תקופת הצריבה כדי למנוע תגובות נפיצות עם חמצן. נזהרים שלא לפגוע בשק קרום הלב.</li>
	<li>באמצעות retractors, לסגת את הצלעות כדי לחשוף את הלב.</li>
	<li>התבונן בקרום הלב ובלב הבסיסי תחת סטריאומיקרוסקופ. הערה: קרום הלב של העכבר דק מספיק כדי לדמיין את כלי הדם של הלב.</li>
	<li>מניחים בעדינות מלקחיים על פני קרום הלב כדי להפחית את תנועתו ואת זו של הלב שמתחתיו.</li>
	<li>ציון חזותי של העורק הכלילי הקדמי השמאלי (LAD) על ידי התחקות אחר הופעתו מתחת לתוספת השמאלית.</li>
	<li>באמצעות דרייבר המיקרו-מחט, יש להנחות תפר מתאים (ראו טבלת חומרים) דרך קרום הלב, מתחת ל-LAD, כאשר התפר מופיע בצד השני של ה-LAD וקרום הלב. קשרו את התפר כדי להגביל את זרימת הדם דרך העורק הכלילי וחתכו את התפר העודף בעזרת מספריים (איור 1A). הערה: עם הגבלת זרימת הדם לעורק הכלילי, יש לראות את החלק הקדמי של החדר השמאלי. הליך זה מייצג מודל קשירת קבוע. עם זאת, ניתן ליישם בשלב זה גם גישת קשירה חולפת עם תקופות איסכמיה שונות.</li>
	<li>מתחת לאתר החתך בתוך האזור הסטרילי, יש להכניס קטטר 24 גרם מלעורי לחזה (להסיר את מחט המדריך לאחר הכניסה לחלל החזה). לאחר מכן, סגרו את הצלעות ואחריהן את שכבות השרירים והעור באמצעות תפר מתאים (מחט מחודדת לשריר, מחט חיתוך קונבנציונלית לעור).</li>
	<li>לאחר סגירת החזה, יש לפנות את האוויר שנותר מחלל החזה באמצעות קטטר 24 גרם באמצעות שאיבה עדינה עם מזרק 3 מ"ל ולחיצות חזה. לאחר הסרת האוויר, למשוך את קטטר 24 גרם.</li>
	<li>הפחיתו את האיזופלוראן ל-1%.</li>
	<li>כבה את האיזופלורן תוך שמירה על אוורור עם חמצן כדי לאפשר לעכבר להתאושש מההרדמה. ברגע שהחיה מראה סימני נשימה באופן עצמאי, הסר את צינור קנה הנשימה 23 G מהפה והנח את העכבר בכלוב התאוששות כדי להיות במעקב לחידוש הנשימה הרגילה.</li>
	<li>אפשרו לעכבר להתאושש בכלוב כאשר חלק מהכלוב מונח על כרית חימום כדי לספק מקור חום חיצוני.</li>
	<li>לספק זריקות תחזוקה של משכך כאבים (Buprenorphine 0.1 מ"ג / ק"ג, תת עורית) כל 12 שעות במשך 72 שעות לאחר הניתוח.</li>
	<li>עקוב אחר מצבם הבריאותי של עכברים מדי יום במשך 7 ימים, הכולל הערכת חתכים ואי נוחות של בעלי חיים. הערה: בשל הפולשנות של הליך זה (thoracotomy), הממשל של אנטיביוטיקה עשוי להיות נחוץ.</li>
</ol>2. הערכה תפקודית של תפקוד הלב על ידי אקוקרדיוגרפיה (ECG)
<ol><li>השרה ותחזק את העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן.</li>
	<li>הניחו את העכבר במצב שכיבה על משטח במה מחומם וחברו את הכפות למוליכי האק"ג.</li>
	<li>לגלח את החזה של העכבר.</li>
	<li>קבל תמונות אקוקרדיוגרפיה באמצעות בדיקה מתמר ליניארית של 40 MHz וג'ל מגע ונתח באמצעות התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>כבו את האיזופלוראן ואפשרו לעכבר להתאושש על משטח החימום לפני החזרת הכלוב למצב פעיל. הערה: הערכת אקוקרדיוגרפיה אינה פולשנית ולכן ניתן לבצע אותה לאורך כל הניסוי כדי לקבוע שינויים לפני ואחרי קשירת הכליליה.</li>
</ol>3. איסוף רקמות לב לצביעת פיברוזיס
<ol><li>הקריבו את העכברים בשאיפה של 100% CO2 ונתחו בזהירות את הלב. הערה: באמצעות מספריים ומלקחיים, זה מושג על ידי חיתוך דרך כלי הדם הגדולים הנכנסים (vena cava, וריד ריאתי) ויציאה (עורק ריאתי, אבי העורקים) את הלב כדי לשחרר אותו ממערכת הדם בחלל החזה.</li>
	<li>לקבע את הלב ב-10% פורמלין למשך 24 שעות לפחות.</li>
	<li>חתכו דגימות באמצעות סכין גילוח ישר דרך החדר הימני, המחיצה הבין-חדרית והחדר השמאלי, כדי להבטיח שהחתך יעבור דרך מרכז אזור האוטם. לאחר מכן נשלחות דגימות למתקן הליבה להטמעת פרפין.</li>
	<li>חותכים חלקי רקמה בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום ומניחים אותם על שקופיות זכוכית להכתמה.</li>
	<li>יש לבצע דה-פראפין באמצעות שטיפות קסילן מסחריות ואלכוהול מדורג (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) עם מים שעברו דה-יוניזציה, ולאחר מכן לייבש מחדש.</li>
	<li>כתם עם 0.1% סיריוס אדום בחומצה פיקרית למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף חלקים עם 0.5% חומצה אצטית במשך 3 דקות ולשטוף עם 70% אתנול במשך דקה אחת.</li>
	<li>ייבשו את החלקים באמצעות הסדר ההפוך של שטיפות המתוארות ב-3.4, כאשר ריכוזי האתנול עולים ומדורגים ואז הקסילן.</li>
	<li>מקטעי רקמת הרכבה עם תמיסת הרכבה (ראה טבלת חומרים) להערכה מיקרוסקופית.</li>
</ol>4. זרימה ציטומטריה של שטיפת לב וחלל קרום הלב
<ol><li>הקריבו את העכברים בשאיפה של 100% CO2 כדי להשפיע.</li>
	<li>הנח את העכבר על גבו וקבע את הידיים והרגליים ללוח ניתוח באמצעות סרט הדבקה.</li>
	<li>פותחים בזהירות את הצד השמאלי (צד ימין מנקודת המבט של הנסיין) של חלל בית החזה, החל מחיתוך הסרעפת לנקודת האמצע ולאחר מכן חותכים דרך הצלעות החיצוניות לכיוון עצם החזה. הערה: הימנעו מניקור של כלי דם גדולים, במיוחד אלה הפועלים במקביל לעצם החזה.</li>
	<li>החזירו את הצלעות באמצעות המוסטאט כדי לחשוף את הלב התחתון ואת קרום הלב. הערה: קרום הלב שביר מאוד, אז הקפד לא לתפוס אותו עם מספריים במהלך החיתוך.</li>
	<li>באמצעות צינור PE-10 (ראו טבלת חומרים) קטטר המוחדר לחלל קרום הלב בסמוך לצומת האטריום השמאלי והחדר השמאלי, מזריק 100 μL של מי מלח סטריליים לתוך חלל קרום הלב.<ol><li>אפשר מלח כדי בריכה לאסוף מן הצד האחורי של הלב, נזהר לא לנקב או לקרוע את קרום הלב בתהליך. חזור על שלב זה פעמיים והניח נוזל שטיפה על קרח תוך כדי עיבוד הלב.</li>
	</ol></li>
	<li>כריתת הלב על ידי חיתוך כלי הדם העיקריים (אבי העורקים, עורק הריאה, הווריד והווריד הוורידי) הנכנסים ויוצאים מהלב. הסר את האטריה הימנית והשמאלית ושקול את רקמת הלב החדרית.</li>
	<li>טחנו את הרקמה בחתיכות קטנות של 1 מ"מ2 באמצעות מספריים והניחו 10 מ"ל של חיץ עיכול המכיל 450 U/mL של קולגן I, 125 U/mL של קולגן XI, 60 U/mL של DNase I, ו-60 U/mL של היאלורונידאז ב-PBS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי.</li>
	<li>מעבירים הומוגניות של רקמת לב דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) ומסתובבים כלפי מטה ב-60 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים פרנכימליים לבביים.</li>
	<li>אספו את הסופר-נטנט, עברו דרך מסננת תאים בקוטר 40 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לתרחיף של תא בודד, והסתובבו מטה בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לזרוק את התאים.</li>
	<li>לבצע חסימת קולטן גבישית (Fc) והכתמה של סמנים תאיים על תאי קרום הלב ותאי הלב כפי שתואר קודםלכן 8.</li>
	<li>הפעל דגימות על ציטומטר זרימה.</li>
</ol>5. תיוג מקרופאגים פריקרדיאליים בשיטת הגישה הבין-קוסטלית למרחב הפלאורלי (ICAPS)9
<ol><li>יש לחטא כלי ניתוח (באמצעות מעקר חרוזים או אוטוקלב) ולרסס 70% אתנול לפני ההתחלה.</li>
	<li>השרה ותחזק את העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן. אשר את מישור ההרדמה על ידי צביטה בהונות והתבוננות בבעל החיים מחוסר רפלקס.</li>
	<li>להזריק משכך כאבים תת עורית (Buprenorphine 0.1 מ"ג / ק"ג).</li>
	<li>הנח את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח.</li>
	<li>לגלח את אזור החזה האנטרולטרלי הימני.</li>
	<li>נקו את אזור הניתוח עם אתנול ובטאדין.</li>
	<li>לעשות חתך באורך 3 ס"מ בעור, ועם מלקחיים לחשוף את כלוב הצלעות.</li>
	<li>טען 5 μL של חרוזים פלואורסצנטיים (מיקרוספרות פלואורסצנטיות זמינות מסחרית, 1 מיקרומטר, ראו טבלת חומרים) ו-45 μL של מלח לתוך קטטר מזרק צינורות PE-10 עם קצה משופע.</li>
	<li>יש להנחות את הצנתר לתוך החלל הבין-קוסטלי כפי שתואר קודםלכן 9, להזריק באיטיות את תמיסת החרוז ולהוציא את הצנתר בתנועה אחת.</li>
	<li>סגור את העור באמצעות סיכות. הערה: סיכות משמשות במקום תפרים כדי למזער פתיחה מחדש פוטנציאלית של החתך.</li>
	<li>כבה את האיזופלורן, הנח את העכבר בכלוב ההתאוששות ועקוב אחר סיבוכים במהלך 24 השעות הראשונות.</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141, 139(2020).</li>
<li>Iismaa, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+regenerative+mechanisms+across+different+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues.</a> NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).</li>
<li>Bayat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+heart+failure+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Progressive heart failure after myocardial infarction in mice.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. 52, 2581(2011).</li>
<li>De Villiers, C., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myocardial+infarction%3A+comparing+permanent+ligation+and+ischaemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion.</a> Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).</li>
<li>Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pericardium+in+heart+failure%3A+Implications+for+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment.</a> JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).</li>
<li>Pfaller, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+pericardium+for+cardiac+biomechanics%3A+from+physiology+to+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).</li>
<li>Deniset, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%28%2B%29+Pericardial+Cavity+Macrophages+Relocate+to+the+Injured+Heart+and+Prevent+Cardiac+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis.</a> Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).</li>
<li>Weber, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+targeting+of+the+pleural+space+by+intercostal+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune targeting of the pleural space by intercostal approach.</a> BMC Pulmonary Medicine. 15, 14(2015).</li>
<li>Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardium+of+rodents%3A+pores+connect+the+pericardial+and+pleural+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities.</a> The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).</li>
<li>Tyberg, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+pericardial+pressure+and+right+atrial+pressure%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study.</a> Circulation. 73, 428-432 (1986).</li>
<li>Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+left+and+right+pericardial+pressures+in+humans%3A+an+intraoperative+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).</li>
<li>Park, D. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericardial+proteoglycan+4+%28lubricin%29%3A+Implications+for+postcardiotomy+intrathoracic+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

גרימת MI בקרום לב סגור במכרסמים היא ייחודית ויכולה להיות בעלת יישומים משמעותיים פוטנציאליים. ההליך מסתמך במידה רבה על היכרותו של המנתח עם דגם המכרסם ועם אנטומיית הלב של המכרסמים. ההצלחה תלויה גם בטיפול שניתן במהלך שלושה שלבים קריטיים: חתך שריר אינטרקוסטלי ונסיגת צלעות (שלבים 1.11-1.13), יצירת אוטם (שלב 1.17 ), והתאוששות בעלי חיים (שלבים 1.22-1.24).
בית החזה חייב להיעשות בחריצות כדי למנוע ניקוב או שרוך קרום הלב. השלב המכריע ביותר בפרוטוקול זה הוא תפירת ה-LAD כדי לגרום לאוטם. כמו בכל מודלי הקשיר...

עד היום, מחלות לב וכלי דם (CVD) מוכרות כגורם המוות המוביל בעולם, וכתוצאה מכך נטל כלכלי משמעותי וירידה באיכות החיים של המטופלים1. מחלת עורקים כליליים (CAD) היא תת-סוג של CVD וממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות אוטם שריר הלב (MI), התורם העיקרי לתמותה. בהגדרה, MI נובע מפגיעה בלתי הפיכה ברקמת שריר הלב עקב תנאים ממושכים של איסכמיה והיפוקסיה. רקמת שריר הלב חסרה יכולת התחדשות, ולכן הפציעות הן קבועות וגורמות להחלפת שריר הלב בצלקת פיברוטית שיכולה להגן בתחילה אך בסופו של דבר תורמת לשיפוץ לב שלילי ובסופו של דבר לאי ספיקת לב2.
למרות שהטיפול בחולים עם CAD השתפר באופן דרמטי בעשורים האחרונים, אי ספיקת לב כרונית (CHF) משנית לאיסכמיה משפיעה על חולים רבים ברחבי העולם. כדי למנוע ולנהל מגיפה זו, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים באופן נרחב יותר ולפתח גישות טיפוליות חדשות. יתר על כן, ממצאי העבר מדגישים את מגבלות הטיפול המערכתי ואת הצורך בפיתוח חלופות מדויקות. בהתחשב בכך שחקירת ההמשך המולקולרי של MI בבני אדם מושפעת מהיכולת לגשת לרקמות אוטמות, מודלים של בעלי חיים המסכמים את המאפיינים וההתפתחות של MI אנושי ו- CHF הקשורים ל- CVD הם הכרחיים.
מכיוון שמודלים אידיאליים של בעלי חיים דומים מאוד להפרעה אנושית עבור מאפיינים מבניים ותפקודיים, אטיולוגיה של מחלות צריכה להנחות את תפיסתם. ב- CAD, זוהי היצרות טרשת עורקים כרונית של עורקים כליליים או חסימה טרומבוטית חריפה. שיטות שונות פותחו ויושמו במינים שונים של חיות מעבדה כדי לגרום להיצרות או חסימה של עורקים כליליים. ניתן לסווג אסטרטגיות כאלה באופן נרחב לשתי קבוצות: (1) מניפולציה מכנית של עורק כלילי כדי לגרום ל- MI ו- (2) זירוז טרשת עורקים כדי להקל על היצרות כלילית המובילה ל- MI. האסטרטגיה הראשונה כוללת בדרך כלל קשירת עורק כלילי או מיקום של סטנט בתוך העורק. הגישה השנייה נוטה להסתמך על שינוי התזונה של בעל החיים כך שתכלול מזון עתיר שומן/כולסטרול. חלק מהמגבלות של גישה אחרונה זו כוללות את חוסר השליטה על העיתוי והאתר של חסימות כליליות.
לעומת זאת, לאינדוקציה כירורגית של MI או איסכמיה במודל של בעלי חיים יש מספר יתרונות, כגון מיקום, תזמון מדויק והיקף האירוע הכלילי, מה שמוביל לתוצאות הניתנות לשחזור יותר. השיטה הנפוצה ביותר היא קשירה כירורגית של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD). מודלים אלה משחזרים תגובות אנושיות לפגיעה איסכמית חריפה, כמו גם את ההתקדמות ל- CHF3. ניתוח LAD בבעלי חיים קטנים כמו מכרסמים, שפותח בתחילה בבעלי חיים גדולים יותר, הפך אפשרי יותר עם התקדמות הטכנולוגיה4. בהקמת מודלים כאלה, עכברים הועדפו מסיבות שונות, כולל הזמינות היחסית שלהם, הוצאות נמוכות בדיור, ויכולתם למניפולציה גנטית.
מודלים כירורגיים עכשוויים של מחלת לב איסכמית באמצעות חסימת LAD מחייבים את החוקר לפתוח את קרום הלב כדי ללקות את העורק5 באופן זמני או קבוע. אסטרטגיות כאלה גורמות לשיבוש החלל הקרדיותי, הממלא פונקציה מכנית ושימון במהותה כדי להבטיח תפקוד לב תקין. חסרון נוסף בפתיחת קרום הלב הוא אובדן הנוזל הפריקרדיאלי הטבעי של החיה על מרכיביו התאיים והחלבונים השונים 6,7. בתגובה, פותחה שיטה להשראת MI תוך שמירה על קרום הלב שלם. בנוסף למזעור ההפרעה לסביבה הומאוסטטית זו, גישה זו מאפשרת תיוג ומעקב אחר תאים ספציפיים לאחר גרימת MI. בנוסף, גישה זו מייצגת טוב יותר פגיעה איסכמית שריר הלב בסביבה האנושית.

<table><tbody><tr><td>Steri-350 מעקר חרוזים</td><td>Inotech</td><td>NC9449759</td><td></td></tr><tr><td>10% פורמלין Millipore</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td>פלקון, 352340</td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>VWR</td><td>CA21008-952</td><td>פלקון, 352350</td></tr><tr><td>ACK מאגר ליזה</td><td>תרמו פישר</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte-W מחט קטטר 24 גרם X 3/4 אינץ'</td> <td>CDMV Inc</td><td>108778</td><td></td></tr><tr><td>בטדין (תמיסה מקומית של 10% פובידון-יוד)</td> <td>CDMV Inc</td><td>104826</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים קהים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>FST 11000-12</td><td></td></tr><tr><td>BNP משחת עיניים</td><td>CDMV Inc</td><td>17909</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo מחט נהג</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR103</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז XI</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 Polysorb תפר - מחט מתחדדת CV-11</td><td>מדטרוניק קנדה</td><td>GL-890</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 5-0 תפר פוליסורב - מחט חיתוך PC-13</td><td>מדטרוניק קנדה</td><td>SL-1659</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים קהים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>FST 11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Dako הרכבה בינונית</td><td>Agilen</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 100%</td> <td>Millipore סיגמא</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>אתיקון 8-0 תפר אתילון - BV-130-4 מחט מחודדת</td><td>Johnson & ג'ונסון בע"מ</td><td>2815G</td><td></td></tr><tr><td>סיבים אופטיים אור</td><td>ניקון</td><td>2208502</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>FST 11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite&reg; YG קרבוקסילט מיקרוספירות 1.00 ומיקרו; מ</td><td>פוליסיינסס בע"מ</td><td>15702</td><td></td></tr><tr><td>גייגר יחידת קאטריה</td><td>תרמית מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501293</td><td>דגם 150-ST</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אידוי איזופלואורן</td><td>הרווארד</td><td>75-0951</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן USP, 250 מ"ל</td><td>CDMV Inc</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>מערכת נסיגה מגנטית מקבע</td> כלים <td>מדעיים עדינים</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>MX550D- בדיקה 40 מגה-הרץ</td><td>Fujifilm- Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle</td><td>Driver Fine Science</td><td>Tools FST 12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 Tubing</td><td>Braintree Scienctific, Inc.</td><td>PE10 50 FT</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>FST 14184-09</td><td></td></tr><tr><td>SMZ-1B מיקרוסקופ סטריאו</td><td>ניקון</td><td>SMZ1-PS</td><td></td></tr><tr><td>VentElite מאוורר בעלי חיים קטנים</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>55-7040</td><td></td></tr><tr><td>וטרינרי (10 מ"ל, 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין))</td><td>CDMV Inc</td><td>124918</td><td>תרופה מבוקרת</td></tr><tr><td>Vevo 2100 תוכנה</td><td>Fujifilm-Visual סוניקס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מודל מכרסם איסכמי שלם של קרום הלב

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

פרוטוקול זה הראה כי קרום הלב ותכולתו ממלאים תפקיד אנטי-פיברוטי חיוני במודל המכרסם האיסכמי (קשירה כלילית לגרימת פגיעה בשריר הלב). רוב המודלים הפרה-קליניים של אוטם שריר הלב דורשים הפרעה של שלמות קרום הלב עם אובדן הסביבה התאית ההומיאוסטטית. עם זאת, לאחרונה פותחה על ידינו מתודולוגיה כדי לגרום לאוטם שריר הלב, אשר ממזער נזק קרום הלב ושומר על אוכלוסיית תאי החיסון של הלב. נצפתה התאוששות תפקודית לבבית משופרת בעכברים עם חלל קרום הלב שלם לאחר קשירה כלילית. שיטה זו מספקת הזדמנות לחקור תגובות דלקתיות בחלל קרום הלב לאחר אוטם שריר הלב. פיתוח נוסף של טכניקות התיוג יכול להיות משולב עם מודל זה כדי להבין את גורלם ותפקודם של תאי מערכת החיסון קרום הלב בוויסות המנגנונים הדלקתיים המניעים שיפוץ בלב, כולל פיברוזיס.

מודל קשירה כלילית שונה זה עבר אופטימיזציה כדי להשיג יכולת שכפול והישרדות בעלי חיים. עם זאת, בשל הפגיעה המשמעותית הנגרמת בלב, חלק מהתמותה התוך-ניתוחית והפוסט-ניתוחית הצפויה קשורה להליך. התמותה הסטנדרטית בדרך כלל גבוהה יותר אצל זכרים (~25-35%) מאשר אצל נקבות (~ 10-15%).
אינדוקציה מוצלחת של MI עם קשירת הכליליה המתוקנת צריכה להיות ניכרת על ידי שינויים בפרמטרים התפקודיים של הלב ובתכונות המבניות. עבור תפקוד, ירידה בפרמטרים כגון שבר פליטה של חדר שמאל (LV) כפי שהוערך על ידי אקוקרדיוגרפיה תורגש תוך 3-4...

פרוטוקול זה מתווה את השלבים לגרימת אוטם שריר הלב בעכברים תוך שמירה על קרום הלב ותכולתו.

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

שיטה זו תאפשר לנו להעריך את תפקידו של חלל קרום הלב המקיף את הלב ותכולתו בתיקון לב לאחר אוטם שריר הלב. בהשוואה לשיטות קשירה כליליות קונבנציונליות למידול אוטם שריר הלב, השיטה שלנו שומרת על חלל קרום הלב שלם, המאפשר קביעת תוכן ומעקב אחר תפקידיהם לאחר פגיעה איסכמית לבבית. הבנת התרומה של חלל קרום הלב ותגובת הפציעה של הלב תספק תובנות חשובות לגבי אסטרטגיות טיפוליות המכוונות אל קרום הלב כדי לשפר את ריפוי הלב.כדי להתחיל עם הרדמה, לרסן את כפות העכבר ולמקם אותו על שולחן הניתוחים. לאחר הכנת העכבר לניתוח כמתואר בכתב היד, אווררו את העכבר ב-2% איזופלוראן וב-100% חמצן כגז נשא באמצעות מכונת הנשמה מסחרית. לאחר מכן קבע קצב של 110 נשימות לדקה, נפח גאות של 250 מיקרוליטרים, ולחץ פקיעה חיובי של ארבעה מילימטרים של כספית.גלגלו את העכבר 30% על צדו הימני כדי למקם את צדו השמאלי של החזה לניתוח. לאחר מכן בצע חתך רוחבי של שניים עד שלושה סנטימטרים בעור החזה כדי לדמיין את שרירי החזה בצד שמאל. בצע חתך של סנטימטר אחד מקו האמצע כלפי חוץ לחיתוך החזה מז'ור ומינור.הימנע דימום מוגזם לאורך צריבה של כלי דימום. דמיינו את השרירים הבין-קוסטליים בין הצלעות השלישית והרביעית. בצע חתך של שני סנטימטרים בשריר האינטרקוסטלי השמאלי כדי להכניס אוויר לחלל החזה ולאפשר ללב ולריאות ליפול מהחתך.כדי לחדור את intercostal ללא דימום, לעצור באופן זמני את מכונת ההנשמה ולהרחיב את הפתח באמצעות מכשיר cautery. באמצעות retractors, לסגת את הצלעות כדי לחשוף את הלב. לאחר מכן התבונן בקרום הלב ובלב שמתחתיו תחת מיקרוסקופ סטריאו.הניחו בעדינות את המלקחיים על משטח קרום הלב כדי להפחית את קרום הלב ואת תנועת הלב הבסיסית. ציון דרך חזותית של העורק הכלילי LAD על ידי התחקות אחר הופעתו מתחת לתוספת השמאלית. באמצעות דרייבר microneedle, להנחות תפר מתאים דרך קרום הלב תחת LAD.שימו לב לתפר המגיח בצד השני של ה- LAD וקרום הלב. המייצגים את מודל הקשירה הקבועה, קושרים את התפר כדי להגביל את זרימת הדם דרך העורק הכלילי, מה שהופך את ההבלגה של החלק הקדמי של החדר השמאלי לגלויה. ואז לקצץ את התפר עודף בעזרת מספריים.לספק זריקות תחזוקה של משכך כאבים תת עורית כל 12 שעות במשך 72 שעות לאחר הניתוח. לאחר הפחתת האיזופלוראן ל-1% מכבים את האיזופלוראן תוך שמירה על אוורור עם חמצן. ברגע שהחיה מראה סימני נשימה, הסר את צינור קנה הנשימה בן 23 המדים מהפה והנח את העכבר בכלוב התאוששות כדי לפקח על חידוש הנשימה.אפשרו לעכבר להתאושש בכלוב כאשר חלק מהכלוב מונח על כרית חימום כדי לספק מקור חום חיצוני. עקוב אחר מצב הבריאות של העכבר מדי יום במשך שבעה ימים על ידי הערכת החתכים ואי הנוחות של בעלי החיים. במידת הצורך, לתת אנטיביוטיקה להחלמה מוצלחת לאחר הניתוח הפולשני.לאחר שמירה על העכבר תחת הרדמה כללית עם חמצן, מניחים את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמת במה מחוממת ומחברים את הכפות למוליכי האק"ג. ואז לשפשף את החזה. רכוש תמונות א.ק.ג. באמצעות בדיקה מתמר וג'ל מגע ונתח באמצעות התוכנה המתאימה.לאחר הערכת א.ק.ג. לא פולשנית, כבו את האיזופלורן והחזירו את העכבר לכלוב. יש לקבע את הלב ב-10% פורמלין למשך 24 שעות לפחות. חותכים את הדגימה באמצעות סכין גילוח ישר דרך החדר הימני, המחיצה הבין-חדרית והחדר השמאלי, כדי להבטיח שהחתך יעבור דרך מרכז אזור האוטם.ואז פרפין להטביע את דגימות הרקמה. לאחר מכן מניחים את החלקים החתוכים בקלטת הרכבה להטמעת פרפין נוספת ולחתכים הבאים למקטעים בעובי חמישה מיקרומטרים. לאחר מיקום של מקטעי רקמות על מגלשות, deparaffinize באמצעות טולואן ואלכוהול מדורג לשטוף עם מים deionized.ואז לייבש מחדש. לאחר מכן, מכתימים את הקטע ב-0.1% סיריוס אדום בחומצה פיקרית למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לשטוף את החלק עם 0.5% חומצה אצטית במשך שלוש דקות ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול במשך דקה אחת.יש לייבש את החלק באמצעות סדר הפוך של שטיפות עם ריכוזי אתנול עולים ומדורגים לפני העלייה לצורך הערכה מיקרוסקופית. השראת אוטם שריר הלב המוצלחת עם הקשירה הכלילית המתוקנת הוערכה על ידי בחינת הפרמטרים התפקודיים והתכונות המבניות של הלב. לצורך תפקוד, ירידה בשבר פליטת החדר השמאלי הוערכה על ידי אקוקרדיוגרפיה תוך שלושה עד ארבעה שבועות של אוטם לאחר שריר הלב.הכתמים ההיסטולוגיים הראו כי השינויים התפקודיים לוו בפיברוזיס משמעותי של דופן החדר השמאלי, אשר אושרו עוד יותר על ידי כימות של פיברוזיס מוכתם אדום picrosirius בחתכי הלב בארבעה שבועות לאחר אוטם עם מודלים קשירה כלילית קרום הלב משובש או שלם. שילוב שיטת תיוג החרוזים הפלואורסצנטיים עם ניתוח ציטומטריה של זרימה סיפק גישה למעקב אחר מקרופאגים פריקרדיאליים חיוביים של Gata6. חשוב לציין כי מעט מאוד תיוג זוהה בלב או בדם.לאחר אוטם שריר הלב, ניתן לעקוב אחר מיקום התאים על ידי ציטומטריה של זרימה והדמיה. כימות של חרוז פלואורסצנטי שכותרתו תאים מיאלואידים קרום הלב עם או בלי אוטם שריר הלב מוצג. יש צורך בזהירות כדי למנוע הפרעה או קרע בשוגג של קרום הלב הדק במהלך ההליך.שיטה זו יכולה להיות משולבת עם שושלת מעקב אחר מצור תאי או אפקטור, אשר יאפשר מעקב וקביעת ההשפעה של רכיב קרום הלב על תגובת הריפוי בלב האוטם. זיהינו את חלל קרום הלב מגן על הלב לאחר פציעה, אשר מתווכת בחלקה על ידי מקרופאגים קרום הלב המקומי. גישה זו פותחת תחום מחקר חדש למחלות לב וכלי דם.

an-intact-pericardium-ischemic-rodent-model

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

המודל של עכברוש אקוטי אוטם שריר הלב (AMI) כדאי ללמוד תוצאה של MI על תפקוד pathophysiological ופיזיולוגיות לב.

באוטם שריר הלב אצל חולדות

טראומה ניתוחית גורם לתגובה דלקתית. ציטוקינים ligands אנדוגניים ידועים לווסת את גודל האוטם בשריר הלב בעקבות איסכמיה ו reperfusion. אנו מציגים שונה סגור החזה מודל של איסכמיה reperfusion Murine באמצעות משקולות תלויות כדי למזער את ההשפעות של פתיחת בית החזה.

דגם Murine סגור החזה של איסכמיה של שריר הלב reperfusion

מטרת פרוטוקול זה להעריך הלם שריר הלב בעקבות דום לב איסכמי במכרסמים.

דגם לב מבודד עכברי של Associated מקסימה שריר הלב עם מעצר Cardioplegic

ניתן להשתמש במודלים מבודדים של לב עובד כדי למדוד את ההשפעה של תנאי העמסה, קצב לב ותרופות על ביצועי שריר הלב וצריכת החמצן. אנו מתארים שיטות להכנת מודל עבודה של לב שמאל של מכרסמים המאפשר מחקר של ביצועים סיסטוליים ודיאסטוליים וצריכת חמצן בתנאים שונים.

מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן

במהלך ניתוח איסכמיה/רפרפוזיה של שריר הלב בעכברים, מיקום נכון של הקשירה החוסמת מאושר בדרך כלל על ידי תצפית גלויה של חיוורון שריר הלב. כאן, שיטה לאישור אלקטרוקרדיוגרפי של איסכמיה ורפרפוזיה, להשלמת חיוורון שריר הלב שנצפה, מודגמת בעכברי C57Bl/6 זכרים.

אישור של שריר לב איסכמיה ופציעת reperfusion בעכברים באמצעות אלקטרוקרדיוגרפיה Pad Surface

כאן אנו מתארים הליך כירורגי המראה כיצד להשיג הארכה קבועה של עורק שמאלי הקדמי כלילית בעכברים. מודל זה הוא בעל רלוונטיות גבוהה לחקור את הפתופסולוגיה של אוטם שריר הלב ואת התהליכים הביולוגיים המקביל.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

מאמר זה מציג שיטה יעילה לבצע איסכמיה שריר הלב ואת reperfusion כרונית הבאים חולדות באמצעות גישה פולשנית מינימלית. בנוסף, הפונקציה השמאלית התפקוד התפקודי של חולדות מוערך על ידי הד ושיטות עבודה מבודדים לב.

חצי מינימלי שיטה פולשנית כדי לגרום אוטם שריר הלב בחולדות הערכה של תפקוד הלב על ידי מערכת לב עבודה מבודדת

מודל איסכמיה-רפרפוזיה שריר הלב של לב חולדה משופר על ידי שימוש ב- retractor מתוצרת עצמית, צינור פוליוויניל כלוריד ושיטת קשר ייחודית. אלקטרוקרדיוגרמה, טריפנילטרזוליום כלוריד וכתמים היסטולוגיים, ותוצאות ניתוח הישרדות באחוזים הראו כי לקבוצת המודל המשופרת יש שיעורי הצלחה והישרדות גבוהים יותר מאשר לקבוצת המודל הקיימת כבר.

מודל מכרסמים משופר של איסכמיה שריר הלב ופציעת רפרפוזיה

המחקר הנוכחי מדגים מודל בעל חיים בעל יכולת שחזור גבוהה של איסכמיה אזורית חריפה של שריר הלב ופגיעה ברפרפוזיה בארנבים באמצעות מיני בית חזה שמאלי למקרי הישרדות או עצם סטרנטומיה בקו האמצע למקרים שאינם הישרדותיים.

מודל של איסכמיה ופגיעה רפרפוזיה בארנבים

השיטה של ​​העברת גנים לטיפול באי ספיקת לב איסכמית מתואר באמצעות מודל החזירים של אוטם שריר הלב. שיטה פשוטה לשחזור שלנו מאפשר לנו בקלות להעריך את היעילות של העברת גנים שונים בצורה פשוטה מאוד לשחזור.

Gene Transfer לאי ספיקת לב איסכמי במודל פרה

חקור מודל איסכמי שלם של קרום הלב בעכברים לשימור חלל הפריקרד ותכולתו. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקיד הקרום בתיקון הלב לאחר אוטם שריר הלב וזיהוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

מודל מכרסם איסכמי שלם של קרום הלב

גלה סרטונים נוספים