דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo
20 בנובמבר 2021
פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.
כלי המוח הוא רשת מורכבת של עורקים חודרים, נימים וצמחייה עולה. כלי דם אלה עטופים בתאי קיר, כגון pericytes ensheathing, אשר מבטאים אקטין שריר חלק אלפא, ונמצאים בתוך ארבעת הענפים הראשונים מן חודר עורקים. אנו משתמשים בעכברים מהונדסים Acta2-RCaMP 1.07, כדי לדמיין סידן חולף בתאים אלה, באמצעות הביטוי של מחוון סידן מקודד גנטית RCaMP.
סידן ממלא תפקיד חזק בהתכווצות של תאים אלה ובקרת זרימת הדם. pericytes נימי נמצאים במורד הזרם ברשת כלי הדם והוא יכול להיות מתויג במודלים מהונדסים אחרים. עם זאת, אנו מתמקדים בהקשת pericytes בשיטה זו.
העכברים שלנו הושתלו בניתוח עם חלון גולגולת כרוני המאפשר גישה לערימה במוח להדמיה. כאן, אנו מתארים את שלבי ההכנה הדרושים ואת הזרקת וריד הזנב ואחריו שתי הדמיית פוטון ושיטות אנליטיות הדרושות לרכישת נתוני סידן pericyte ומידע על זרימת הדם בבעלי חיים מרדים. הפריטים הבאים נדרשים להזרקת קטטר וריד זנב:מזרקי אינסולין, חתיכה 15 ס"מ של צינורות PE10, מחטים 30 מד, גזה, מלוחים, מלקחיים, צבע דקסטרן פלואורסין ירוק, צבת ומספריים.
יש לנו גם מחט עם הרדמה קסילסין קטמין כי נזריק לפני הדמיה כפי שהוא טוב יותר איזופלוראן למדידות זרימת הדם. באמצעות צבת, לשבור מחט 30 מד מהרכזת. בזהירות להכניס את המחט לתוך הקצה של חתיכת צינורות PE10 מחובר מזרק מלא מלוחים.
זה הצנתר להזרקה. יש להעשיר עכבר עם איזופלוראן ולהחיל ג'ל I-Lube. מניחים שדה כפפות עם מים חמים על הזנב כדי להרחיב את הווריד לרוחב.
לאחר ניקוי הזנב עם אתנול, להכניס את המחט לתוך הווריד בעדינות להזריק מלוחים דרך הקטטר כדי להבטיח את המחט ממוקמת כראוי. החליפו את המזרק על הקטטר למזרק מלא בצבע דקסטרן פלואורסצ'ין. לאט לאט להזריק את הצבע כדי לוודא שאין בועות להיכנס לצינור.
החלף את מזרק dextran עם מזרק מלוחים ולשטוף את הצינורות עד שלא נשאר צבע בצינור. הסר את המחט ולחץ עם גזה. הזריקו הרדמה של קטמין קסילן להדמיה.
עם ראש העכבר קבוע על כרית חימום, לנקות את החלון הגולגולתי עם אפליקטורים דנטליים. החל ג'ל אולטרסאונד על החלון ולהתמקד דרך המטרה שני מיקרוסקופ פוטון. עבור שתי הדמיות פוטון, אנו משתמשים במיקרוסקופ עם לייזר טיטניום ספיר ניתן לכוונון עבור צינורות פלואורסצנט, עירור ופוטמולטיפלייר לזיהוי פליטה.
בתוכנת המיקרוסקופ, להגדיר את אורך הגל ל 990 ננומטר כדי לרגש הן RCaMP והן פלואורסצין דקסטרן. לאחר מכן להגדיר את כוח הלייזר על ידי התאמת מתח תא pockel ואת הרגישות גלאי PMT. סריקה חיה עם פרמטרים אלה ורזולוציה גבוהה יותר, RCaMP תאי ציור קיר חיוביים ואת פלזמת הדם שכותרתו פלואורסצנטית ניתן לראות.
רכישת מחסנית עומק מומלץ לאתר כראוי pericytes ברשת כלי הדם. כאשר ממוקד בחלק העליון של הרקמה ליד כלי PO, להגדיר את זה כמו נקודת האפס ואת החלק העליון של מחסנית סדרת Zed, ואז להתמקד למטה ברקמה לעומק הרצוי ולהגדיר את זה כמו החלק התחתון של הערימה. כוח הלייזר חייב להיות מותאם כדי להגדיל ככל שהמיקרוסקופ נע עמוק יותר דרך הערימה.
פתיחת סדרת Zed בתוכנת עיבוד תמונה, למזג את שני הערוצים כתמונות צבעוניות ולסרוק דרך הערימה עבור pericytes וכלי דם של עניין. בחר אזורים מעניינים המכילים פריקיטים ושמור את המיצ'ים כדי לסייע באיתור נקודות אלה שוב בהפעלות הדמיה עתידיות. כדי לאסוף ולהזיז אירוע סידן pericyte, להגדיל את קצב מסגרת הרכישה ליותר מ 10 פריימים לשנייה.
הגדר את משך ההדמיה ל- 60 שניות ועדכן את נתיב השמירה בשם קובץ ייחודי. זום אופטי על כלי השיט כדי להסביר את הרזולוציה הנמוכה יותר ולקבל תצוגה מקרוב של pericyte. לרכוש את סדרת T.
כדי למדוד את קוטר כלי הדם ואת מהירות תאי הדם האדומים, בחר סריקת קו כדי להתחיל סריקה חד ממדית עם המיקרוסקופ. הגדר תחילה את משך הסריקה באלפיות שניה. ואז למתוח קו שחוצה את כלי העניין ונע במקביל לאורך כלי השיט.
זה ייצור קימוגרף של קוטר הכלי בצד שמאל ופסים של תאי הדם האדומים הנעים דרך כלי הדם מימין. עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה מלאה של תוכניות וחבילות המשמשות בפרוטוקול זה. בחר תחילה אזורים מעניינים באופן ידני בתוכנת עיבוד תמונה.
טען את קובץ סדרת T, קח את הממוצע של הערימה והפוך תמונה צבעונית. בחרו בכלי המצולע וקווי המתאר של מבני ההשתתפות הנראים לעין כגון סומה ותהליכים. תן לכל אזור מעניין שם ייחודי ושמור אותם כתיקיית zip שניתן לטעון מאוחר יותר בתוכנת התכנות.
פתח את תוכנת התכנות וודא שהתיקיות עבור חבילות עיבוד התמונה נמצאות בנתיב. לייבא את סדרת סידן T לתוך תוכנת התכנות ולהגדיר מה הוא בכל ערוץ. במקרה זה, זהו אות סלולרי בערוץ 1 ופלזמת דם בערוץ 2.
התווה את הנתונים כסרט בתוך תוכנת התכנות כדי להקל על תצוגה חזותית. להסרת פלואורסצנטים ירוקים מ- fluorescein dextran המדמם דרך לתוך ערוץ RCaMP האדום, בטלו את ערבוב הערוצים בחבילת עיבוד התמונה. תחילה בחר אזור המכיל רק פלואורופור 1, RCaMP במקרה זה.
השני לבחור אזור המכיל רק פלואורופור 2, פלואורסצ'ין בפלזמה. לבסוף בחר אזור רקע שאין בו פלואורופור. פעולה זו יוצרת מטריצת תרומה ספקטרלית, המוחלת על כל פיקסל בכל ערוץ.
זה משפר באופן משמעותי את לוקליזציה של אות RCaMP, אשר ישפר את הזיהוי של אירועי סידן במבנים אלה. ישנן דרכים רבות שבהן ניתן לנתח את נתוני הדמיית הסידן בתוך חבילות עיבוד התמונה. ראשית להפעיל את ניתוח איתות הסלולר על סרט סידן לא מעורב לטעון את אזורי העניין מתיקיית zip שנבחרו מן pericytes ביד קודם לכן.
הגדר את גורם קנה המידה לאחד מכיוון שאין צורך לשנות את גודל האזורים. לאחר העיבוד, ליצור חלקות של כל ROY ואת עקבות סידן מנורמל בצבעים שונים. אם הקוד אינו מזהה את רוב אירועי הסידן במעקבים הבודדים, שנה את הפרמטרים המובנים בתוך תיבת המיטוב, כגון הפחתת הסף עבור הנתונים המסוננים במעבר הקצר פי שלושה מסטיית התקן של תקופת הבסיס, שהיא 30 המסגרות הראשונות של סדרת T.
על מנת לזהות ולסווג את האותות, עקבות הסידן המנורמלים עוברים מזמן ופס עובר מסונן, מה שעוזר להחליק את הנתונים למשרעת ועם הערכות, אך גם כדי לקבוע אם אותות הם פסגות בודדות, פסגות מרובות או מישורים. פלט הנתונים כקובץ CSV לניתוח סטטיסטי נוסף. הפעל את ניתוח האיתות התאי בפעם השנייה על סרט הסידן הלא מעורב ובחר את האזור האוטומטי של זיהוי עניין בהתבסס על הפעילות והשינוי בפלואורסצנטים בשלושה ממדים, X, Y וזמן.
התוויית תוצאות התהליך כדי להציג את אזורי העניין המזוהים היא צבעים שונים. אם האלגוריתם אינו מזהה ROYs הנראים בבירור בעין בסרט, שנה את הפרמטרים המובנים, כגון הגדלת המסנן הגאוסי המחליק את הנתונים בזמן והורדת הסף למציאת ROYs פי שלושה מסטיית התקן של קו הבסיס. התווה את ה- ROY כסרט להדמיה נוספת.
פלט הנתונים כקובץ CSV לניתוח סטטיסטי נוסף. יבא את קובץ הנתונים של סריקת הקו לתוכנת התכנות והגדר את מה שנמצא בכל ערוץ. הפעל את פונקציית ניתוח הקוטר בסריקת הקו, הפותחת תיבה לבחירת האזור המתאים לקוטר בקימולוגרפיה.
צייר קופסה מחוץ לגבולות הפלואורסצנטים של הקימולוגרפיה, המתאימה לקוטר כלי השיט. לעבד מחלקת נתונים זו על מנת למדוד את הרוחב המלא בחצי מקסימה עבור קוטר כלי וליצור חלקה. לאחר מכן הפעל את קצב המהירות על ניתוח טרנספורמציה ולצייר תיבה בתוך הגבול של פלואורסצנטים קימאוגרפיים.
עבד מחלקת נתונים זו כדי לחשב את המהירות, השטף והצפיפות הליניארית של תאי דם אדומים. פלט את תוצאות זרימת הדם כקובץ CSV לניתוח נוסף. בחירת מבנים תאיים ביד מאפשרת זיהוי של תנודות סידן באזורים אלה, כולל סוגים שונים של פסגות אותות, כגון פסגות בודדות ופסגות מרובות, לאחר שעקבות הסידן המנורמלות הן נמוכות לעבור ופס עובר מסונן.
בנוסף, אזורי עניין מזוהים על ידי קיבוץ פיקסלים פעילים יחד שבהם עוצמת הפלורסנטים משתנה עם הזמן באמצעות אלגוריתמים לעיבוד תמונה. ניתן להחיל זאת על כל אות סלולרי דינמי על-ידי התאמת הזמן, הסף והפרמטרים המרחביים כך שיכלול את הגודל והצורה הצפויים של האות. הפחתת הסף לזיהוי אותות מוצאת אזורים נוספים בעלי עניין.
ברור, קימאוגרפיות המודינמיות מנותחות כדי למדוד את מהירות תאי הדם האדומים בקוטר ובאדום בכלי הדם ליד גישוש פריציטים. הקוטר מחושב מהרוחב המלא בחצי מהלום של הפלואורסצנטים. מהירות תאי הדם האדומים משוערת מהפסים העשויים מתאי דם אדומים ללא תווית, שם הזווית היא קלט לשינוי ראדון כדי לחשב את המהירות.
קימאוגרפיות באיכות ירודה, שבהן יש רוויה פלואורסצנטית, יחס אות לרעש גרוע או תנועה של שדה ההדמיה, יוצרות חלקות לא אמינות עם נקודות שגיאה, המצוינות כצלבים אדומים, שבהם לא ניתן לקבוע נתונים. איכות הנתונים שנרכשו היא קריטית לתוצאה טובה ועקבות השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מבטיחות תוצאות טובות. בסרטון זה, אנו מתארים את ההליך להדמיית סידן משולבת של פריציטים משחיש מוח ומדידות זרימת דם על ידי שתי מיקרוסקופיה פוטונית.
טכניקות אלה שימושיות לטיפול בשאלות על פיזיולוגיה של תאי קיר ולוקליזציה בתוך רשת כלי הדם במוח, אך ניתן להתאים אותן לחקר חולפי סידן בכל סוג תא במוח או במערכת איברים אחרת.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הרכישה והניתוח של נתוני דימוי סידן פלואורסצנטי מתאי פריסייטים עוטפי המוח ומדידות של זרימת דם בעכברים תחת הרדמה. באמצעות שימוש בעכברים טרנסגניים מסוג Acta2-RCaMP 1.07 לצורך הוויזואליזציה, הפרוטוקול מאפשר לחוקרים לבחון תנודות של סידן בתאים מוראליים. השיטות המתוארות ניתנות להתאמה למחקר של סוגי תאים שונים ותפקידיהם הפיזיולוגיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- מערכת כלי הדם במוח מורכבת מעורקים, נימים וורידונים, העטופים על ידי תאי דופן (mural cells).
- פריציטים (pericytes) עוטפים המבטאים alpha smooth muscle actin ותורמים לוויסות זרימת הדם.
- שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של דינמיקת סידן בתאי דופן אלו ובכלי הדם הקשורים אליהם.
מטרת המחקר
- מתן מתודולוגיה מפורטת לדימוי של מעברים של סידן (calcium transients) בפריציטים.
- מתן אפשרות לחקר התפקידים הפיזיולוגיים של פריציטים בזרימת הדם במוח.
- ביסוס פרוטוקול הניתן להתאמה לסוגי תאים אחרים למחקרים דומים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי דו-פוטוני של דינמיקת סידן בעכברים טרנסגניים תחת הרדמה.
- ההכנה כוללת חלון גולגולת כרוני והחדרת קטטר לווריד הזנב להזרקת צבע.
- רכישת הנתונים כוללת מדידה של פעילות פריציטים וזרימת דם באמצעות טכניקות דימוי מתקדמות.
תוצאות עיקריות
- דימות מוצלח של אירועי סידן בפריציטים עוטפים יחד עם נתוני זרימת דם.
- מיקום משופר של אותות RCaMP באמצעות מטריצת תרומה ספקטרלית משפר את דיוק הנתונים.
- המתודולוגיה תומכת בויזואליזציה דינמית של תגובות כלי דם ואיתות סידן.
מסקנות
- מחקר זה מדגים פרוטוקול חסון להבנת התפקידים הפיזיולוגיים של תאי הקיר (mural cells).
- טכניקות הדימוג מספקות תובנות לגבי דינמיקת הסידן הרלוונטית לוויסות זרימת הדם.
- ההשלכות של המחקר חלות על יישומים רחבים יותר במכניזמים נוירונליים, פלסטיות וביולוגיה של כלי דם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
פרוטוקול זה מאפשר מדידה ישירה של דינמיקת סידן תוך-תאית בפריציטים (pericytes) במוח, סוג תאים מרכזי בצימוד נוירו-וסקולרי ובבקרת זרימת דם. באמצעות קישור פעילות הפריציטים לתוצרי המודינמיקה, הוא מספק קריאה מכניסטית לתיקוף מטרות בתגלי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים במטרות וסקולריות על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על איתות תאי ותפקוד כלי דם in vivo.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת תנודות סידן בפריציטים עוטפים, המווסתים את זרימת הדם בנימים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות בתאי דופן דרך קורלציה בין איתות סידן לבין קוטר כלי הדם ומהירות תאי דם אדומים.
- ערך חיזוי: תומך בביטחון במטרה על ידי קישור אירועי סידן בפריציטים לתפוקות המודינמיות, ובכך מסייע בסריקת תרכובות מבוססת מנגנון.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה המשכית על ידי קביעת חלון הדימות שמיש וניתן לשחזור ב-in vivo כרוני.
- פלטים כמותיים: מייצר נתוני עקיבה של סידן ומדדים המודינמיים (קוטר, מהירות) המתאימים לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולהשוואה בין מעבדות.
- סקביליות (יכולת הרחבה): תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מחקרים שונים על ידי אפשור מיפוי של אזורי עניין (region-of-interest) וגילוי אותות אוטומטי באמצעות אלגוריתמים של עיבוד תמונה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר דינמיקת סידן בתאי פריסייט (pericytes) לתפקוד נוירווסקולרי לקוי, מאפיין המופיע במודלים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים ומחלות איסכמיות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לעבודות פרה-קליניות על ידי אספקת מדד עקבי של פעילות תאי קירות כלי דם (mural cells) לאורך שלבי הניסוי.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחית עמימות בוויסות המטרה על ידי הקשר בין סיגנל תוך-תאי לתוצאות וסקולריות תפקודיות.
שילוב זרימת עבודה וקו עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על יעדים ועד לתיקוף פרה-קליני, ומספקת גשר תפקודי בין סיגנלינג תאי לבין פיזיולוגיה ברמת הרקמה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי מדידת דינמיקת סידן בפריציטים (pericytes), שהם רגולטורים מרכזיים של זרימת הדם המוחי었습니다.
- סריקה: מספק פלטי מוכנים לבדיקה, כולל עקומות סידן מנורמלות וקימוגרפים המודינמיים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליזה: מספק פלטי CSV מוכנים לניתוח סטטיסטי מאותות שעברו הפרדה (unmixed signals), המאפשרים השוואה כמותית של תדירות אירועי הסידן, האמפליטודה והקינטיקה שלהם.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לדימות אורך (longitudinal imaging) של אותו חלון גולגולתי לאורך נקודות זמן שונות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימות לשימוש חוזר באמצעות תהליכי עבודה סטנדרטיים של הכנה כירורגית, הזרקת צבע ועיבוד תמונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מעלה את ביטחון התחזיות על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במודולציה של מטרות נוירו-ווסקולריות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של קטטריזציה בווריד הזנב, הגדרות דו-פוטון והפרדה ספקטרלית (spectral unmixing).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים על מעורבות תפקודית של המטרה המקושרים למדדים המודינמיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) מותאם סיכון, בהתבסס על תגובתיות כלי דם המתווכת על ידי פריסייטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעכברים טרנסגניים, בניתוח לחלון קרניאלי ובמיקרוסקופיה דו-פוטונית.
- תלוי במערכות לייזר של טיטניום-ספיר עם כוונון, שפופרות מכפיל פוטו (photomultiplier tubes) ותוכנות לעיבוד תמונה לצורך הפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) וניתוח אותות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הרדמה (ketamine/xylazine) ונהלי הזרקת צבע כדי למזער ארטיפקטים של זרימה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לסוגי תאים או איברים אחרים, במיוחד בבחירת פרומוטר ובדיקת תאימות האינדיקטור.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הגבלות עומק הדמיה וזליגת אות (signal bleed-through), המטופלות באמצעות מטריצת תרומה ספקטרלית והחסרת רקע.
