Name: דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: למדו דימות סידן דו-פוטוני בפריסייטים מקיפים במוח עכברים מהונדסים גנטית. שיטה זו מאפשרת חקירת דינמיקת סידן וויסות זרימת דם בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ג'יי מזא נתמך על ידי מלגות מ-Mitacs ומחקר מניטובה. מימון עבודה זו ניתן על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות, מחקר מניטובה, קרן השירות הרפואי מניטובה, מימון סטארט-אפים מאוניברסיטת מניטובה ומוח קנדה באמצעות הקרן לחקר המוח בקנדה, בתמיכתם הכספית של Health Canada וקרן עזריאלי. הדעות המובעות כאן אינן מייצגות בהכרח את עמדותיהם של שר הבריאות או ממשלת קנדה.

<ol><li>Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+Developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Berthiaume, A. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+pericytes+in+vivo+maintains+capillary+coverage+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li>
<li>Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+compartmentalization+of+functional+hyperemia+from+the+synapse+to+the+pia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia.</a> Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li>
<li>Gonzales, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+pericytes+determine+the+direction+of+blood+flow+at+capillary+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).</li>
<li>Hartmann, D. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+structure+and+distribution+in+the+cerebral+cortex+revealed+by+high-resolution+imaging+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice.</a> Neurophotonics. 2 (4), 041402(2015).</li>
<li>Grant, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+hierarchy+and+structural+diversity+of+microvascular+pericytes+in+adult+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).</li>
<li>Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+blood+flow+in+the+normal+and+ischemic+brain+is+controlled+by+arteriolar+smooth+muscle+cell+contractility+and+not+by+capillary+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes.</a> Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).</li>
<li>28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jax.org/strain/028345">https://www.jax.org/strain/028345</a> (2021).</li>
<li>Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genetically+encoded+red+fluorescent+Ca2%2B+indicator+for+detecting+optically+evoked+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials.</a> PLoS ONE. 7 (7), (2012).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> JoVE. (12), e680(2008).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> JoVE. (143), e56297(2019).</li>
<li>Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).</li>
<li>Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIPS%3A+an+extensible+toolbox+for+cellular+and+hemodynamic+two-photon+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis.</a> Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (1), 55-60 (2014).</li>
<li>Nilsson, H., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotion%3A+mechanisms+and+physiological+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+interventions%22%5BJournal%5D)">Vasomotion: mechanisms and physiological importance.</a> Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).</li>
<li>Rungta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+arbors+in+layer+II+%2F+III+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex.</a> Communications Biology. , (2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה הנוכחית מספקת פרטים על הזרקת וריד זנב העכבר עם קטטר, רכישת תמונה מיקרוסקופ שני פוטון עבור ערימות עומק, סרטי איתות סידן תאים, יצירת קימאוגרפים המודינמיים, וניתוח סידן והמודינמי עם אלגוריתמי עיבוד התמונה שלנו17 (איור 1). ישנם מספר יתרונות לטכניקות אלה המשפרים את תוצאת ההדמיה in vivo ומפחיתים זמן, משאבים ומתח מן החי במהלך הפגישה. ראשית, השימוש של קטטר עבור הזרקת וריד הזנב מספק שליטה רבה יותר על המחט, המזרק ואת כמות החומר מוזרק לתוך זרימת של העכבר. בנוסף, זה מונע הזרקת צבע לתוך רקמת הזנב, חיסכון ריאגנטים יקרים. שנית, אנו משתמשים בעכברים מהונדסים המבטאים חיישני סידן מקודדים גנטית ב- pericytes ensheathing ומדגימים כיצד להתאים אותם לרשת כלי הדם במוח עם ערימת z עומק, המאפשרת זיהוי תאים והעתקה בפגישות הדמיה עוקבות לטווח ארוך. זהו גורם חשוב במחקרי פירוק ומבטיח סיווג תאים תקין6,7. שלישית, אנו מספקים את הפרמטרים שלנו לאיסוף סרטי סידן ותוני סריקת קו המודינמי שהם נקודת התחלה טובה למדידת אותות סלולריים דינמיים. לבסוף, אנו מציגים את אלגוריתמי עיבוד התמונה שלנו17, ארגז כלים מקיף לעיבוד תמונה המכיל גישות מרובות לעיבוד קדם תמונה (כגון ביטול ספקטרלי), ניתוח תמונת סידן וניתוח המודינמי (קוטר, מהירות וכו '). אלגוריתמים אלה יכולים ליצור התוויות להדמיה מהירה וקלה של הנתונים, תוך מזעור רמת המומחיות הנדרשת לניתוח תוצאות. יתר על כן, זה יכול להיות אוטומטי עם כמה שורות של קוד כדי לאצווה במהירות לעבד ערכות נתונים מרובות עם אותם פרמטרים. זה יכול לשפר את הדמיית הנתונים ואת ההשקעה בזמן של החוקר.
המפתח לאיסוף נתוני הדמיית סידן טובים הוא להתאים את עוצמת הלייזר ואת הגדרות PMT לרכישת אותות פלואורסצנטיות ברורה, אך גם לאסוף נתונים בקצב פריימים מספיק כדי ללכוד את כל אירוע הסידן. הנתונים בפרוטוקול זה נרכשו במהירות של 10-11 פריימים לשנייה, הלוכדת את תנודות הסידן האיטיות יותר בפריקיטים. ישנם גם מספר שלבים במהלך הניתוח שיכולים לשפר את תוצאת הניתוח. ראשית, ביטול ספקטרלי מועיל אם יש חפיפה משמעותית בין ספקטרום הפליטה של פלואורופורים(איור 2). פלואורסצ'ין-דקסטרן שימש בפרוטוקול זה מכיוון שהוא מצומד דקסטרן חסכוני וזמין מסחרית המשמש בדרך כלל למדידות המודינמיות5. ביטול ספקטרלי עוזר לנקות את הנתונים לגילוי משופר של אותות סידן, אך ניתן להשתמש גם בפלואורופורים חלופיים עם ספקטרום פליטה צר יותר. שנית, בחירת יד של מבנים תאיים כ- ROIs (איור 3) שימושית לסיווג אירועי סידן באזורים תת-תאיים שונים כגון ענפי סומה או תהליך. בחירת ROI מבוססת פעילות (איור 4)16 מספקת מידע מרחבי וטמפורלי יותר על אירועי סידן בודדים. זה יכול להיות מועיל בעת קביעת התדירות של אירועי סידן באזור נתון או הפצת אירועים לאזורים תאיים אחרים. השימוש בתוכנת תכנות לניתוח נתוני הדמיה יכול לחסוך לחוקרים שעות של זמן כאשר הנתונים מעובדים באצווה, אך נדרש השקעה ראשונית בזמן כדי להתאים את הפרמטרים לתוצאות אופטימליות. הגורמים החשובים ביותר הם הגודל הצפוי (ב- μm 2 ) של האזור הפעיל, כמו גם משך האות (יש להגדיר זמן אות מינימליוזמןאות מרבי). החוקרים חייבים לבחון תחילה כמה סרטי T-series לדוגמה כדי לקבוע בצורה הטובה ביותר אילו פרמטרים מתאימים לנתונים שלהם. לבסוף, נתונים באיכות ירודה שנרכשו במיקרוסקופ עלולים לעכב מאוד את ניתוח הסידן והמודינמיקה(איור 6). לכן, יש להקפיד כדי לייעל את הגדרות רכישת המיקרוסקופ בהתחלה. עם גורמים אלה בראש, פרוטוקול זה שניתן להתאים להדמיית סידן או ניתוח של אותות תאיים דינמיים אחרים (למשל, נתרן פלואורסצנטי, אשלגן, מטבוליט, או תנודות מתח) ברקמות או בסוגי תאים אחרים.
קיימות מספר מגבלות לפרוטוקול זה. ראשית, הנתונים נאספים תחת הרדמה, אשר משפיע על פעילות המוח ועלול להשפיע על זרימת הדם. הדמיה דומה יכולה להיעשות בעכברים ערים שאומנו לקבל קיבוע ראש לתוצאות פיזיולוגיות יותר. בנוסף, חשוב לזכור כי אנו אוספים תמונות דו ממדיות של תא תלת מימדי וכלי דם ב vivo. לכן, אנחנו יכולים ללכוד רק סיעה של אירועי הסידן בתוך תאים אלה או זרימת הדם בחלק אחד של כלי הדם בכל פעם.
מגבלה נוספת שיש לציין היא כי הדמיית סידן שני פוטון רגישה לממצאי תנועה, שבהם התנועה פנימה והחוצה של מישור המוקד יכולה לטעות בתנודות סידן. פרוטוקול זה בוצע תחת הרדמה, אשר מגביל את התנועה של החיה; עם זאת, ממצאי תנועה יכולים להיות הציגו על ידי קצב הנשימה של העכבר, קצב הלב, נפיחות רקמות אפשרית, ובמקרה של pericytes ensheathing, התכווצות כלי דם או vasomotion 4,6,18,19. חפצי תנועה יכולים להיות מקלים על ידי מספר אסטרטגיות. חבילות עיבוד התמונה המשמשות בפרוטוקול זה כוללות שלב אופציונלי לתיקון תנועה, המשתמש במנוע פיתול דו-ממדי כדי ליישר את התמונות בתוך סדרת T בהתבסס על כלי ההשנה הנראה לעין13,17. מסגרות עם שינויים משמעותיים במישור המוקד מזוהות על ידי אלגוריתם זה וניתן לא לכלול אותם בניתוח. בנוסף, ניתן להשתמש באסטרטגיות סטטיסטיות בתוך חבילות עיבוד ההדמיה, כגון ציון Z בעת יצירת עקבות פלואורסצנטיות כדי לנרמל את התנועה המושרה תנודות סידן20. הגישה החזקה ביותר להסביר ממצאי תנועה בהדמיה של שני פוטונים היא לשלב ביטוי של שני אינדיקטורים פלואורסצנטיים באותו תא, כגון מחוון סידן (למשל, GCaMP) וכתב פלואורסצנטי (למשל, mCherry) שאינו תלוי בסידן. לאחר מכן ניתן לייחס תנודות בכתב הפלואורסצנטי לתנועה והם מופחתים מאות מחוון הסידן כדי לנרמל חפצי תנועה.
מטרת פרוטוקול זה היא לספק הבנה ברורה כיצד לאסוף נתוני הדמיית סידן וזרימת דם אופטימליים ב- vivo ולהציג שיטות וכלי ניתוח חדשים שהחוקרים יכולים ליישם על מנת לשפר את תוצאותיהם. טכניקות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את התפקיד של אוכלוסיות pericytes שונים בשליטה על זרימת הדם או במצבי מחלות מוח שונים. פרמטרי הדמיה אלה יכולים לשמש גם לחקר סידן וזרימת דם בסוגי תאים אחרים ובמערכות איברים ועקרונות דומים חלים על טכניקות הדמיה דינמיות אחרות המאפשרות חיישנים אחרים המקודדים גנטית, מעבר לסידן.

כלי ההשמה של מערכת העצבים המרכזית מורכב מחדירה לעורקים, נימים וצמחייה עולה. בתוך רשת זו, תאי קיר כגון תאי שריר חלקים וסקולריים עטוף arterioles ו pericytes להרחיב תהליכים תאיים לאורך ענפי arteriole הראשון נימים1. Pericytes נראה שיש כמה תפקידים בתוך המוח כולל תחזוקה של מחסום הדם - מוח1,2, הגירה תנועתיות3, תכונות תאי גזע פוטנציאליים, ואת הרגולציה של זרימת הדם במוח4,5,6. רבים מהתפקידים התפקודיים של פריציטים נקשרו לתנודות בסידן תאי שעשויות לווסת את ההתכלחות או ההתכווצות של תאים אלה4,5,6.
מספר מחקרים אחרונים קבעו קריטריונים לזיהוי סוגים שונים של פריציטים במוח7,8. תאי קיר בתוך 4 הענפים הראשונים של עורקים חודרים הם ensheathing pericytes בהתבסס על הביטוי שלהם של חלבון התכווצות α שריר חלק אקטין (αSMA) שלהם בולט, סומטה בוצית עם תהליכים העוטפים את כלי הדם7,8,9. כדי לדמיין תנודות סידן pericytes ensheathing, פרוטוקול זה משתמש קו עכבר מהונדס רומן, Acta2-RCaMP1.07, הידוע גם בשם Tg (RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik / J10. עכברים אלה מבטאים את מחוון הסידן האדום המקודד גנטית, RCaMP1.07, בתאי αSMA המבטאים (תאי שריר חלקים וסקולריים ופריציטים). מושבות הרבייה נשמרות על ידי חציית בעלי חיים שאינם מקריים עם hemizygotes. RCaMP1.07 הוא חלבון פלואורסצנטי אדום עם תחום מחייב calmodulin, אשר מגביר פלואורסצנטיות בעת קשירה סידן תאי10,11. פרוטוקול זה מתאר את השלבים להדמיית סידן משולבת של פריציטים וזרימת דם על ידי שתי מיקרוסקופיות פוטון כולל הליכים להזרקת וריד זנב של צבעים פלואורסצנטיים, רכישת תמונת מיקרוסקופ בעכברים מרדים וניתוח נתונים עם פלטפורמות תכנות (איור 1). טכניקות אלה שימושיות לטיפול בשאלות על פיזיולוגיה של תאי קיר, אך ניתן להתאים אותן לחקר סידן ארעי בכל סוג תא במוח או במערכת איברים אחרת.
עכבר Acta2-RCaMP1.07 בן 10 חודשים שימש לניסוי שהוצג במאמר זה. העכבר עבר ניתוח לחלון גולגולתי כרוני ולהשתלת ראש חודשיים לפני כן. פרטים על הפרוטוקול הכירורגי נדונים במחקרים קודמים12,13 והליכים דומים בוצעו בפרוטוקולים אחרים שפורסמו בעבר14,15. כלי ההדבקה מסומן עם פלואורסצאין-דקסטרן ירוק (70,000 מגוואט, פתרון אניוני, 2.5% w/v) מוזרק תוך ורידי. צבע זה חסכוני וזמין ממקורות מסחריים, אך יש לו ספקטרום פליטה רחב יותר שעשוי לחפוף עם פליטת RCaMP ולדמם דרך במהלך רכישת תמונת מיקרוסקופ. צעדים לבחינת אי-קמיקס ספקטרלי מפורטים בסעיף 4 להלן כדי לעקוף זאת, אך ניתן להשתמש גם בצבעים ירוקים אחרים עם ספקטרום פליטה צר יותר, כגון אלה המבוססים על EGFP.

<table><tbody><tr><td>Acta2-RCaMP1.07</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>28345</td><td>בפרוטוקול הווידיאו המודל החייתי בו נעשה שימוש הוא עכבר נקבה בן 10 חודשים, יום אחד.</td></tr><tr><td>אפליקטורים (רגילים)</td><td>חבילת Bisco</td><td>X-80250P</td><td></td></tr><tr><td>BioFormats עבור MATLAB</td><td>NA</td><td></td><td>NA נקוב בפרוטוקול זה כ"חבילות עיבוד תמונה".&nbsp; זמין ב:</td></tr> <tr><td>ארגז הכלים https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ CHIPS MATLAB</td><td>NA</td><td></td><td>NA מוגדר בפרוטוקול זה כ"אלגוריתמים לעיבוד תמונה". בארט MJP, פרארי KD, סטובארט JL, הולוב מ, וובר ב. צ'יפס: ארגז כלים הניתן להרחבה לניתוח תמונות דו-פוטוניות סלולריות והמודינמיות. נוירואינפורמטיקה. 2018; 16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. זמין ב:</td></tr><tr><td>ג'ל אולטרסאונד שקוף https://github.com/EIN-lab/CHIPS, צמיגות בינונית</td><td>HealthCare Plus</td><td>UGC250</td><td></td></tr><tr><td>Dextern, פלואורסצאין, 70,000 מגה-וואט, אניוניק</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, טקסס אדום, 70,000 מגה-וואט, ניטרלי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>Eye Lube Plus</td><td>Optixcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>תמונה J</td><td>NA</td><td>מכונה בפרוטוקול זה "תוכנת מעבד תמונה".&nbsp; זמין ב: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>GCaMP6sfl/fl</td><td>פלטפורמת תיקון הפוסט</td><td></td><td></td>הראשי של מעבדת ג'קסון</tr><tr><td></td><td>אוניברסיטת ציריך</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>קטמין (Narketan 100 מ"ג/מ"ל)</td><td>Vetoquinol</td><td>440893</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2020b</td><td></td><td>NA</td><td>מכונה בפרוטוקול זה "פלטפורמת תכנות". זמין ב: https://www.mathworks.com/downloads/</td></tr> <tr><td>מחט 0.3 מ"מ x 25 מ"מ</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>מטרה XLUMPLFLN20XW</td><td>אולימפוס</td><td>NA</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/</td></tr> <tr><td>PDGFR&beta;-CreERT2</td> צינורות פוליאתילן <td>של מעבדת ג'קסון</td><td>30201</td><td></td></tr><tr><td>, PE10 מזהה 28 מ"מ (0.11 אינץ') OD 61 מ"מ (.024&rdquo;)</td><td>BD Intramedic</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Prairie View</td><td>Bruker מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td><td>NA</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td></tr><tr><td>Ultima במבחנה מיקרוסקופ מולטיפוטון</td><td>Bruker מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html מחמם מתחת למיכל</td><td>Reptitherm U.T.H</td><td>E169064</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין (Rompun 20 מ"ג/מ"ל)</td><td>Bayer HealthCare</td><td>2169592</td><td></td></tr></tbody></table>

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

ההתקדמות האחרונה בביולוגיה של חלבונים וגנטיקה של עכברים אפשרה למדוד תנודות סידן תאיות של תאי מוח ב-vivo ותיאם זאת עם המודינמיקה המקומית. פרוטוקול זה משתמש בעכברים מהונדסים שהוכנו עם חלון גולגולת כרוני ומבטאים את מחוון הסידן המקודד גנטית, RCaMP1.07, תחת מקדם אקטין שריר חלק α כדי לסמן במיוחד תאי ציור קיר, כגון תאי שריר חלקים וסקולרית ו pericytes ensheathing. השלבים מפורטים על איך להכין צנתר וריד זנב להזרקה תוך ורידי של צבעים פלואורסצנטיים כדי לעקוב אחר זרימת הדם, כמו גם כיצד למדוד סידן ריסייט במוח ואת המודינמיקה כלי הדם המקומי (קוטר, מהירות תאי דם אדומים, וכו ') על ידי שני מיקרוסקופיה פוטון ב vivo דרך החלון הגולגולתי בעכברים מרדימים קטמין / קסילאסין. לבסוף, פרטים מסופקים לניתוח של תנודות סידן וסרטי זרימת דם באמצעות אלגוריתמי עיבוד תמונה שפותחו על ידי בארט ואח '2018, בדגש על האופן שבו תהליכים אלה יכולים להיות מותאמים לנתוני הדמיה תאית אחרים.

לפלואורסצין-דקסטרן יש ספקטרום פליטה רחב שיכול לדמם דרך הערוץ האדום, מה שמשפיע על זיהוי RCaMP בפריקיטים מתנפחים(איור 2A). ביטול ספקטרלי לאחר רכישת נתונים בתוכנה מפחית את הדימום פלואורסצ'ין דרך (איור 2B, נמוך יותר), שיפור זיהוי אותות סידן בשלבי ניתוח הבאים.
ניתוח סידן עם אלגוריתמי עיבוד התמונה המשמשים בפרוטוקול זה מאפשר מספר גישות שונות לזיהוי ROIs ותנודות סידן תאיות (כלומר, אותות סידן). בחירת מבנים תאיים ביד מאפשרת זיהוי של תנודות סידן באזורים אלה (איור 3A), כולל סוגים שונים של פסגות אותות, כגון פסגות בודדות ורב-פסגות, לאחר שעקבות הסידן המנורמלות הן בעלות מעבר נמוך ומסונן על פסים (איור 3B). בנוסף, ROIs מזוהים על ידי קיבוץ פיקסלים פעילים יחד שבו עוצמת הפלואורסצנטיות משתנה עם הזמן באמצעות אלגוריתמים לעיבוד תמונה שפותחו על ידי Ellefsen et al. 201416 ו Barrett et al. 201817 (איור 4). ניתן להחיל זאת על כל אות סלולרי דינמי על-ידי התאמת הזמן, הסף והפרמטרים המרחביים כך שיקיף את הגודל והצורה הצפויים של האות. הפחתת הסף לזיהוי אותות מוצאת אזורים מעניינים יותר (איור 4B).
ניתן לנתח קימאוגרפיות המודינמיות בהירות וברורות כדי למדוד קוטר ומהירות RBC בכלי הדם ליד פריציטים מתנפלים(איור 5A,B). הקוטר מחושב מהרוחב המלא בחצי מהערך המרבי של הפלואורסצנטיות(איור 5C). מהירות RBC משוערת מהפסים העשויים מ- RBCs ללא תווית, כאשר הזווית היא קלט לתוך טרנספורמציה Radon כדי לחשב את המהירות, השטף (תאים / s) וצפיפות ליניארית (תאים / מ"מ; איור 5D). קימאוגרפים באיכות ירודה שבהם יש רוויית פלואורסצנטיות, יחס אות לרעש גרוע או תנועה של שדה ההדמיה(איור 6A)יוצרים חלקות לא אמינות עם נקודות שגיאה (צלבים אדומים) שבהם לא ניתן לקבוע נתונים (איור 6B, C). איכות הנתונים שנרכשו היא קריטית לתוצאה טובה ועקבות השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מבטיחות תוצאות טובות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig01.jpg"> איור 1. סיכום הפרוטוקול. הפרוטוקול מציג את השלבים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים של גישוש מוח וזרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. הפרוטוקול מחולק ל-4 שלבים. 1) הכנת נוהל: הגדרת ציוד והכנת צנתר; 2) הזרקת וריד זנב; 3) רכישת נתונים על ידי מיקרוסקופיה דו פוטונית; 4) ניתוח נתונים עם אלגוריתמים לעיבוד תמונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig02.jpg"> איור 2. התיר ספקטרלי של פלואורופורים. A) תמונה ממוצעת מייצגת של RCaMP ensheathing pericyte ופלואורסצין-דקסטרן שכותרתו כלי דם מרכישה מסדרת T. סרגל קנה מידה= 10 מיקרומטר.B) עליון: כאשר בוחנים ערוצים בודדים, לדמם דרך מערוץ 2 ניכר בערוץ 1 (משמאל). נמוך יותר: לאחר ביטול ספקטרלי, הדימום מצטמצם והאות מ- RCaMP בולט יותר במבנה ההפריסיט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig03.jpg"> איור 3. ROIs שנבחר ביד ועקבות סידן ממוטבות. A) ניתן להשתמש באזורים בעלי עניין שנבחרו בתוכנת עיבוד התמונה המשמשת (צורות קשת בענן) כדי לזהות עקבות אותות סידן. ב) פסגות אותות מעקבים מנורמלים מזוהות על-ידי מעבר נמוך ועובר פס המסנן את הנתונים. הגדרנו את סף האות כפי 3 פעמים את סטיית התקן של התקופה הבסיסית (30 המסגרות הראשונות) וכל פסגות מעל סף זה נחשבו לאות (מעקב נמוך יותר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig04.jpg"> איור 4. בדיקות ROIs אוטומטיות מבוססות פעילות לניתוח סידן. אותם נתונים נותחו עם סף של פי 7 מסטיית התקן של קו הבסיס (A) ופי 3 מסטיית התקן של הבסיס (B). הקטנת הסף לזיהוי פיקסלים פעילים מוצאת שיאי ROIs (B) ואותות נוספים (תרשים עוגה) בתוך הפריטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig05.jpg"> איור 5. מדידות המודינמיות של קימאוגרפיה. A) סריקת קו לדוגמה דרך כלי השיט. B) דוגמה לקימאוגרפיות מוגדרות היטב לקוטר (משמאל) ומהירות (מימין). הפסים השחורים בתוך הרצועה הימנית של פלואורסצנטיות תואמים RBCs.C) ניתוח קוטר עם תנודות vasomotion ברור. D) ניתוח מהירות עם התוויות עבור ציר Y = שטף RBC (תאים/s), צפיפות קו (תאים/מ"מ), מהירות (mm/s) וזווית פסים (מעלה), יחס אות לרעש (יחידות שרירותיות, a.u.), ציר X = זמן (שניות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig06.jpg"> איור 6. ייצוג של מדידות המונמיות באיכות ירודה. A) דוגמאות לקימאוגרפיות באיכות ירודה עם רוויית פלואורסצנטיות, יחס אות לרעש גרוע או תנועה של שדה ההדמיה במהלך הרכישה. B ו- C) התוויות דומות לאיור 7 של נתוני קוטר ומהירות בעלי נקודות שגיאה (נקודות אדומות) בגלל האיכות הירודה של הקימאוגרפיות. (תמונה E, ציר Y= קוטר (מיקרומטר), ציר X =זמן (שני); תמונה F, ציר Y = שטף RBC (תאים/s), צפיפות קו (תאים/מ"מ), מהירות (mm/s) וזווית פסים (מעלות), יחס אות לרעש (a.u.), ציר X = זמן (שני). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

כלי המוח הוא רשת מורכבת של עורקים חודרים, נימים וצמחייה עולה. כלי דם אלה עטופים בתאי קיר, כגון pericytes ensheathing, אשר מבטאים אקטין שריר חלק אלפא, ונמצאים בתוך ארבעת הענפים הראשונים מן חודר עורקים. אנו משתמשים בעכברים מהונדסים Acta2-RCaMP 1.07, כדי לדמיין סידן חולף בתאים אלה, באמצעות הביטוי של מחוון סידן מקודד גנטית RCaMP.סידן ממלא תפקיד חזק בהתכווצות של תאים אלה ובקרת זרימת הדם. pericytes נימי נמצאים במורד הזרם ברשת כלי הדם והוא יכול להיות מתויג במודלים מהונדסים אחרים. עם זאת, אנו מתמקדים בהקשת pericytes בשיטה זו.העכברים שלנו הושתלו בניתוח עם חלון גולגולת כרוני המאפשר גישה לערימה במוח להדמיה. כאן, אנו מתארים את שלבי ההכנה הדרושים ואת הזרקת וריד הזנב ואחריו שתי הדמיית פוטון ושיטות אנליטיות הדרושות לרכישת נתוני סידן pericyte ומידע על זרימת הדם בבעלי חיים מרדים. הפריטים הבאים נדרשים להזרקת קטטר וריד זנב:מזרקי אינסולין, חתיכה 15 ס"מ של צינורות PE10, מחטים 30 מד, גזה, מלוחים, מלקחיים, צבע דקסטרן פלואורסין ירוק, צבת ומספריים.יש לנו גם מחט עם הרדמה קסילסין קטמין כי נזריק לפני הדמיה כפי שהוא טוב יותר איזופלוראן למדידות זרימת הדם. באמצעות צבת, לשבור מחט 30 מד מהרכזת. בזהירות להכניס את המחט לתוך הקצה של חתיכת צינורות PE10 מחובר מזרק מלא מלוחים.זה הצנתר להזרקה. יש להעשיר עכבר עם איזופלוראן ולהחיל ג'ל I-Lube. מניחים שדה כפפות עם מים חמים על הזנב כדי להרחיב את הווריד לרוחב.לאחר ניקוי הזנב עם אתנול, להכניס את המחט לתוך הווריד בעדינות להזריק מלוחים דרך הקטטר כדי להבטיח את המחט ממוקמת כראוי. החליפו את המזרק על הקטטר למזרק מלא בצבע דקסטרן פלואורסצ'ין. לאט לאט להזריק את הצבע כדי לוודא שאין בועות להיכנס לצינור.החלף את מזרק dextran עם מזרק מלוחים ולשטוף את הצינורות עד שלא נשאר צבע בצינור. הסר את המחט ולחץ עם גזה. הזריקו הרדמה של קטמין קסילן להדמיה.עם ראש העכבר קבוע על כרית חימום, לנקות את החלון הגולגולתי עם אפליקטורים דנטליים. החל ג'ל אולטרסאונד על החלון ולהתמקד דרך המטרה שני מיקרוסקופ פוטון. עבור שתי הדמיות פוטון, אנו משתמשים במיקרוסקופ עם לייזר טיטניום ספיר ניתן לכוונון עבור צינורות פלואורסצנט, עירור ופוטמולטיפלייר לזיהוי פליטה.בתוכנת המיקרוסקופ, להגדיר את אורך הגל ל 990 ננומטר כדי לרגש הן RCaMP והן פלואורסצין דקסטרן. לאחר מכן להגדיר את כוח הלייזר על ידי התאמת מתח תא pockel ואת הרגישות גלאי PMT. סריקה חיה עם פרמטרים אלה ורזולוציה גבוהה יותר, RCaMP תאי ציור קיר חיוביים ואת פלזמת הדם שכותרתו פלואורסצנטית ניתן לראות.רכישת מחסנית עומק מומלץ לאתר כראוי pericytes ברשת כלי הדם. כאשר ממוקד בחלק העליון של הרקמה ליד כלי PO, להגדיר את זה כמו נקודת האפס ואת החלק העליון של מחסנית סדרת Zed, ואז להתמקד למטה ברקמה לעומק הרצוי ולהגדיר את זה כמו החלק התחתון של הערימה. כוח הלייזר חייב להיות מותאם כדי להגדיל ככל שהמיקרוסקופ נע עמוק יותר דרך הערימה.פתיחת סדרת Zed בתוכנת עיבוד תמונה, למזג את שני הערוצים כתמונות צבעוניות ולסרוק דרך הערימה עבור pericytes וכלי דם של עניין. בחר אזורים מעניינים המכילים פריקיטים ושמור את המיצ'ים כדי לסייע באיתור נקודות אלה שוב בהפעלות הדמיה עתידיות. כדי לאסוף ולהזיז אירוע סידן pericyte, להגדיל את קצב מסגרת הרכישה ליותר מ 10 פריימים לשנייה.הגדר את משך ההדמיה ל- 60 שניות ועדכן את נתיב השמירה בשם קובץ ייחודי. זום אופטי על כלי השיט כדי להסביר את הרזולוציה הנמוכה יותר ולקבל תצוגה מקרוב של pericyte. לרכוש את סדרת T.כדי למדוד את קוטר כלי הדם ואת מהירות תאי הדם האדומים, בחר סריקת קו כדי להתחיל סריקה חד ממדית עם המיקרוסקופ. הגדר תחילה את משך הסריקה באלפיות שניה. ואז למתוח קו שחוצה את כלי העניין ונע במקביל לאורך כלי השיט.זה ייצור קימוגרף של קוטר הכלי בצד שמאל ופסים של תאי הדם האדומים הנעים דרך כלי הדם מימין. עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה מלאה של תוכניות וחבילות המשמשות בפרוטוקול זה. בחר תחילה אזורים מעניינים באופן ידני בתוכנת עיבוד תמונה.טען את קובץ סדרת T, קח את הממוצע של הערימה והפוך תמונה צבעונית. בחרו בכלי המצולע וקווי המתאר של מבני ההשתתפות הנראים לעין כגון סומה ותהליכים. תן לכל אזור מעניין שם ייחודי ושמור אותם כתיקיית zip שניתן לטעון מאוחר יותר בתוכנת התכנות.פתח את תוכנת התכנות וודא שהתיקיות עבור חבילות עיבוד התמונה נמצאות בנתיב. לייבא את סדרת סידן T לתוך תוכנת התכנות ולהגדיר מה הוא בכל ערוץ. במקרה זה, זהו אות סלולרי בערוץ 1 ופלזמת דם בערוץ 2.התווה את הנתונים כסרט בתוך תוכנת התכנות כדי להקל על תצוגה חזותית. להסרת פלואורסצנטים ירוקים מ- fluorescein dextran המדמם דרך לתוך ערוץ RCaMP האדום, בטלו את ערבוב הערוצים בחבילת עיבוד התמונה. תחילה בחר אזור המכיל רק פלואורופור 1, RCaMP במקרה זה.השני לבחור אזור המכיל רק פלואורופור 2, פלואורסצ'ין בפלזמה. לבסוף בחר אזור רקע שאין בו פלואורופור. פעולה זו יוצרת מטריצת תרומה ספקטרלית, המוחלת על כל פיקסל בכל ערוץ.זה משפר באופן משמעותי את לוקליזציה של אות RCaMP, אשר ישפר את הזיהוי של אירועי סידן במבנים אלה. ישנן דרכים רבות שבהן ניתן לנתח את נתוני הדמיית הסידן בתוך חבילות עיבוד התמונה. ראשית להפעיל את ניתוח איתות הסלולר על סרט סידן לא מעורב לטעון את אזורי העניין מתיקיית zip שנבחרו מן pericytes ביד קודם לכן.הגדר את גורם קנה המידה לאחד מכיוון שאין צורך לשנות את גודל האזורים. לאחר העיבוד, ליצור חלקות של כל ROY ואת עקבות סידן מנורמל בצבעים שונים. אם הקוד אינו מזהה את רוב אירועי הסידן במעקבים הבודדים, שנה את הפרמטרים המובנים בתוך תיבת המיטוב, כגון הפחתת הסף עבור הנתונים המסוננים במעבר הקצר פי שלושה מסטיית התקן של תקופת הבסיס, שהיא 30 המסגרות הראשונות של סדרת T.על מנת לזהות ולסווג את האותות, עקבות הסידן המנורמלים עוברים מזמן ופס עובר מסונן, מה שעוזר להחליק את הנתונים למשרעת ועם הערכות, אך גם כדי לקבוע אם אותות הם פסגות בודדות, פסגות מרובות או מישורים. פלט הנתונים כקובץ CSV לניתוח סטטיסטי נוסף. הפעל את ניתוח האיתות התאי בפעם השנייה על סרט הסידן הלא מעורב ובחר את האזור האוטומטי של זיהוי עניין בהתבסס על הפעילות והשינוי בפלואורסצנטים בשלושה ממדים, X, Y וזמן.התוויית תוצאות התהליך כדי להציג את אזורי העניין המזוהים היא צבעים שונים. אם האלגוריתם אינו מזהה ROYs הנראים בבירור בעין בסרט, שנה את הפרמטרים המובנים, כגון הגדלת המסנן הגאוסי המחליק את הנתונים בזמן והורדת הסף למציאת ROYs פי שלושה מסטיית התקן של קו הבסיס. התווה את ה- ROY כסרט להדמיה נוספת.פלט הנתונים כקובץ CSV לניתוח סטטיסטי נוסף. יבא את קובץ הנתונים של סריקת הקו לתוכנת התכנות והגדר את מה שנמצא בכל ערוץ. הפעל את פונקציית ניתוח הקוטר בסריקת הקו, הפותחת תיבה לבחירת האזור המתאים לקוטר בקימולוגרפיה.צייר קופסה מחוץ לגבולות הפלואורסצנטים של הקימולוגרפיה, המתאימה לקוטר כלי השיט. לעבד מחלקת נתונים זו על מנת למדוד את הרוחב המלא בחצי מקסימה עבור קוטר כלי וליצור חלקה. לאחר מכן הפעל את קצב המהירות על ניתוח טרנספורמציה ולצייר תיבה בתוך הגבול של פלואורסצנטים קימאוגרפיים.עבד מחלקת נתונים זו כדי לחשב את המהירות, השטף והצפיפות הליניארית של תאי דם אדומים. פלט את תוצאות זרימת הדם כקובץ CSV לניתוח נוסף. בחירת מבנים תאיים ביד מאפשרת זיהוי של תנודות סידן באזורים אלה, כולל סוגים שונים של פסגות אותות, כגון פסגות בודדות ופסגות מרובות, לאחר שעקבות הסידן המנורמלות הן נמוכות לעבור ופס עובר מסונן.בנוסף, אזורי עניין מזוהים על ידי קיבוץ פיקסלים פעילים יחד שבהם עוצמת הפלורסנטים משתנה עם הזמן באמצעות אלגוריתמים לעיבוד תמונה. ניתן להחיל זאת על כל אות סלולרי דינמי על-ידי התאמת הזמן, הסף והפרמטרים המרחביים כך שיכלול את הגודל והצורה הצפויים של האות. הפחתת הסף לזיהוי אותות מוצאת אזורים נוספים בעלי עניין.ברור, קימאוגרפיות המודינמיות מנותחות כדי למדוד את מהירות תאי הדם האדומים בקוטר ובאדום בכלי הדם ליד גישוש פריציטים. הקוטר מחושב מהרוחב המלא בחצי מהלום של הפלואורסצנטים. מהירות תאי הדם האדומים משוערת מהפסים העשויים מתאי דם אדומים ללא תווית, שם הזווית היא קלט לשינוי ראדון כדי לחשב את המהירות.קימאוגרפיות באיכות ירודה, שבהן יש רוויה פלואורסצנטית, יחס אות לרעש גרוע או תנועה של שדה ההדמיה, יוצרות חלקות לא אמינות עם נקודות שגיאה, המצוינות כצלבים אדומים, שבהם לא ניתן לקבוע נתונים. איכות הנתונים שנרכשו היא קריטית לתוצאה טובה ועקבות השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מבטיחות תוצאות טובות. בסרטון זה, אנו מתארים את ההליך להדמיית סידן משולבת של פריציטים משחיש מוח ומדידות זרימת דם על ידי שתי מיקרוסקופיה פוטונית.טכניקות אלה שימושיות לטיפול בשאלות על פיזיולוגיה של תאי קיר ולוקליזציה בתוך רשת כלי הדם במוח, אך ניתן להתאים אותן לחקר חולפי סידן בכל סוג תא במוח או במערכת איברים אחרת.

brain-pericyte-calcium-hemodynamic-imaging-transgenic-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הכנת רקמות מתואר עבור להדמיה של מניפולציה ניסויית בזרימת הדם החי. בעכברים מורדמים זכר, רזה, שרירי מאוד vascularized cremaster מוכן מיקרוסקופיה intravital ללמוד רשתות כלי הדם כולל arterioles, נימים venules. הכנה זו היא מותאמת בקלות לחולדות ואוגרים.

Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת פעילות. עצבית מבעד לחלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות 2-פוטון (2p) מיקרוסקופיה ויוו.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

pericytes נימי המוח הם שחקנים חיוניים ברגולציה של תכונות מחסום דם - מוח וזרימת דם. פרוטוקול זה מתאר כיצד pericytes נימות המוח יכול להיות מבודד, תרבותי, מאופיין ביחס לסוג התא והגיש בקשה לחקירות של סידן תאי איתות עם בדיקות פלורסנט.

תרבות של פריציטים נומי מוח למדידות סידן ציטוסולית מחקרי הדמיית סידן

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

למדו דימות סידן דו-פוטוני בפריסייטים מקיפים במוח עכברים מהונדסים גנטית. שיטה זו מאפשרת חקירת דינמיקת סידן וויסות זרימת דם בזמן אמת.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

גלה סרטונים נוספים