מחקר של התפתחות תאים דנדריטיים על ידי קצר סיכות ראש RNA מתווך RNA נוקאאוט גזע הגבעול Hematopoietic וקו תא האב הקדמה במבחנה
7 במרץ 2022
כאן אנו מספקים פרוטוקול לסינון גורמי שעתוק פוטנציאליים המעורבים בפיתוח של תא דנדריטי (DC) באמצעות transduction lentiviral של shRNA כדי להשיג קווי תא נוק-אאוט יציבים עבור בידול במבחנה DC.
תאים דנדריטיים, או DCs, הם תאי חיסון מרכזיים המקשרים את מערכת החיסון המולדת והנרכשת. בעוד DCs הם הטרוגניים, שיטה זו מסייעת לנו להבין אילו גנים, כולל גורמי שעתוק, עשויים לווסת את התפתחות DC. טכניקה זו מספקת דרך פשוטה ומהירה לזהות גן השולט בהתפתחות DC מן האב הקדמה שלהם במבחנה.
כדי להתחיל, לשמור על גזע hematopoietic מונצח ותאי אב או iHSPCs במדיום RPMI 1640 מלא, בתוספת 100 ננוגרם למיליליטר של ליגנד FLT3 ו אסטרדיול בטא מיקרומולרי אחד. עבור transduction lentiviral, צלחת iHSPCs ב 12 צלחות היטב בצפיפות של אחד פעמים 10 לתאים החמישיים לכל באר ומיליליטר אחד של מדיום מלא המכיל את ליגנד FLT3, בטא אסטרדיול, פוליברן. לאחר מכן, מוסיפים את lentivirus נושא את RNA סיכת הראש הקצרה בכל באר בריבוי של זיהום של 100.
לאחר מכן, לסובב את הצלחת ב 1100 פעמים g ו 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, ולאחר מכן לדגור על התאים הנגועים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את polybrene על ידי איסוף התאים לתוך 15 צינורות מיליליטר בצנטריפוגה, לאחר החלפת התקשורת עם מדיום מלא טרי המכיל את ליגנד FLT3 ו בטא אסטרדיול. לאחר 24 שעות נוספות, להוסיף שישה מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין למדיום כדי לבחור את התאים הנגועים.
החלף את מדיום הבחירה כל שלושה ימים ושמור על התאים למשך שבוע אחד לפחות כדי להרחיב את ה- iHSPCs שהועברו ביציבות. צור ולשמור על iHSPCs נוקאאוט יציב עבור LacZ, Tcf4, ו- Id2 במדיום מלא בתוספת עם ליגנד FLT3 אסטרדיול בטא. כדי ליזום בידול במבחנה לאסוף את iHSPCs מובחן לתוך 15 צינורות מיליליטר גלולה התאים על ידי צנטריפוגה.
לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS. לאחר השטיפה השנייה, resuspend התאים במדיום מלא המכיל רק את ליגנד FLT3 ואז לזרוע אותם בצפיפות של פעמיים 10 עד החמישי מוכר לכל מיליליטר לתוך צלחת 12 באר. לאחר שלושה ימים, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום שלם טרי המכיל את ליגנד FLT3.
לאחר יומיים נוספים, המשך לנתח את התאים המובחנים על ידי cytometry זרימה. לניתוח ציטומטרי זרימה, פיפטה התאים למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים בצלחת ולאחר מכן לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגות הצינורות ולהשליך את supernatant לפני resuspending התאים ב 50 מיקרוליטרים של מאגר פקס.
לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של אנטי CD16 על ידי 32 היברידית supernatant ודגור במשך חמש עד 10 דקות על קרח. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים מצומדים בצבע פלואורסצנטי ישירות לתאים ודגרו במשך 15 דקות על קרח בחושך. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר פקס צנטריפוגה המדגם.
לאחר צנטריפוגה, resuspened התאים ב 100 מיקרוליטרים של מאגר פקס ולנתח את הדגימות על ידי cytometry זרימה. לאחר נוקאאוט קצר בתיווך RNA של LacZ, Tcf4, ו- Id2 ב- iHSPCS, אישור של יעילות נוקאאוט על ידי RTQ-PCR הראה כי הביטוי של Tcf4 ו- Tcf4 לדפוק iHSPCs הופחת בהשוואה לזה ב- iHSPCs נוקאאוט LacZ. תוצאות דומות נצפו עבור ביטוי Id2 ב- iHSPCs הנוקאאוט Id2.
לאחר פולחן LacZ לדפוק iHSPCs במשך חמישה ימים, התדירות של תאים חיוביים CD11c, המייצגים את אוכלוסיית התאים הדנדריטיים, היה סביב 95%עם זאת, להפיל Tcf4 או Id2 מעט הפחית את הדור של תאים דנדריטיים CD11c חיובי. ניתוח נוסף של תאים דנדריטיים חיוביים CD11c נגזר iHSPCs נוקאאוט LacZ גילה כי 70% היו תאים דנדריטיים קונבנציונליים בעוד 22% היו תאים דנדריטיים פלזמה. IHSPCs נוקאאוט Tcf4 יצר אחוז נמוך משמעותית של תאים דנדריטיים פלסמציטויד כי בקרת הנוקאאוט LacZ.
לעומת זאת, iHSPCs נוקאאוט Id2 יצרו אחוז נמוך משמעותית של תאים דנדריטיים קונבנציונליים מאשר בקרות הנוקאאוט של LacZ, אך אחוז גבוה יותר של תאים דנדריטיים פלסמהציטואידים. זיהומים ספין להגדיל את יעילות ההמרה של shRNA נושאת lentivirus לתוך iHSPCs. טכניקה זו מתייחסת לתפקידם של גורמי שעתוק ומאפשרת את המחקר של גנים אחרים בציטוקינים איתות טרנסדוקציה או חילוף חומרים, אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח DC.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לסריקת גורמי שעתוק המשפיעים על התפתחות תאי דנדריטיים (DC) באמצעות טרנסדוקציה לנטיבירילית של shRNA. השיטה מאפשרת יצירה של תאי שורות בעלי knockdown יציב לצורך בידול של DCs in vitro.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- בקרה שעתוקית
רקע
- תאי דנדריטיים הם קריטיים לקישור בין החסינות המולדת לחסינות הנרכשת.
- הבנת התפתחותם של תאי DC עשויה לחשוף תובנות לגבי תגובות חיסוניות.
- מחקר זה מתמקד בזיהוי גנים המווסתים את הגביית (differentiation) של תאי DC.
- השיטה משתמשת בתאי גזע ותאי פרוגניטורים המטופויטיים מומתים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לסריקת גורמי שעתוק בהתפתחות של DC.
- יצירת קווי תאים עם knockdown יציב למחקרים פונקציונליים.
- הסבב של בידול in vitro של DC מתאי מקור.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תחזוקה של iHSPCs במצע RPMI 1640 מלא.
- תוספת של ליגנד FLT3 ובטא-אסטרדיול.
- טרנסדוקציה לנטיויראלית של iHSPCs באמצעות shRNA.
- שימוש ב-polybrene לשיפור יעילות הטרנסדוקציה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של קווי תאים יציבים עם knockdown.
- זיהוי גורמי שעתוק המעורבים בהתפתחות DC.
- הדגמה של יכולות התמיינות in vitro.
- תובנות לגבי ויסות גנטי של התפתחות תאי חיסון.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר התפתחות תאי DC.
- ניתן להשתמש בו לזיהוי גנים רגולטוריים מרכזיים באימונולוגיה.
- גישה זו עשויה לשפר את ההבנה של תגובות חיסוניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בחינה סיסטמטית של תפקידם של גורמי שעתוק בהחלטת שורת התאים של תאי דנדריטיים, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בתוכניות גילוי ממוקדות אימונולוגיה. על ידי קישור הפרעה גנטית לתוצר פנוטיפי במערכת in vitro הניתנת לשחזור, היא מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית עבור היפותזות של מטרות בשלבים מוקדמים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בתעדוף מטרות אימונו-מודולטוריות לפני מאמצים עתירי משאבים לזיהוי מובילים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה פונקציונלית של גורמי שעתוק כיעדים טיפוליים פוטנציאליים בפיתוח תאי דנדריטיים.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה ניתנת להרחבה לסריקת knockdown באמצעות הובלת shRNA לנטיוויראלית בתאי אב המטופויטיים מונחליים.
- ערך ניבויי: מקשר בין מודולציה של המטרה לבין התוצר של תתי-סוגי תאים דנדריטיים, ובכך תומך בהחלטות go/no-go המבוססות על נתוני הטיה של שורת התאים (lineage skewing).
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות של ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) עבור תאים חיוביים ל-CD11c והתפלגות תתי-אוכלוסיות (cDC לעומת pDC) לאחר השתקה (knockdown) של גורם שעתחילה.
- ערך תפעולי: מקים בדיקת דיפרנציאציה סטנדרטית עם תנאי ציטוקינים מוגדרים (FLT3 ligand, beta estradiol) וברירה באמצעות puromycin.
- מוכנות הבדיקה: מייצר קווי תאים יציבים עם השתקה המתאימים לשימוש חוזר בסריקת תרכובות או במחקרי מודולציה של מסלולים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: ממדל את השלב המוקדם של התמיינות תאי דנדריטיים מתאי אב, ובכך מספק מידע לאסטרטגיות של סממנים ביולוגיים הקשורות לרשתות של גורמי שעתוק.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר את תפקידו של Id2 בקידום גורל של תאים דנדריטיים קונבנציונליים ואת תפקידו של Tcf4 בתמיכה בפיתוח תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים.
- התאמה פרה-קלינית: תומך בהערכה של מטרות המשפיעות על התמיינות תאי מערכת החיסון הרלוונטית לתוכניות של עזרי חיסונים או מחלות אוטואימוניות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בשלב הביולוגיה הגילויית, ומאפשרת בדיקה של היפותזות לגבי מטרות לפני פיתוח בדיקה לזיהוי מובילים (leads), כאשר הנתונים מסייעים בבחירת מועמדים פרה-קליניים לאימונומודולציה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בניתוח מכניסטי של ווסתים תעתוקיים השולטים בהתמיינות תאי דנדריטיים מפרוגניטורים המטופוטיים.
- פיתוח בדיקות: מייצר נקודות קצה כמותיות וניתנות לשחזור של אימונופלורסצנציה וציטומטריית זרימה לניטור יעילות ההתמיינות והתפלגות תתי-האוכלוסיות.
- אנליטיקה: מספק תוצאות כמותיות (אחוזים של +CD11c, cDC, pDC) המאפשרות השוואה בין תנאי knockdown ותומכות בהערכה סטטיסטית של השפעת המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התמיינות פרוגניטורים מוקדמת לתפקוד חיסוני במורד, רלוונטי למידול תגובות במצבי זיהום או סבילות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לסריקה של גנים נוספים באותות ציטוקינים, מטבוליזם או רשתות תעתוק המשפיעות על התפתחות תאים דנדריטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי קישור השתקת גורמי שעתוק לשינויים מדידים ביצירת תתי-אוכלוסיות של תאי דנדריטים.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דיפרנציאציה ומדידה בין מעבדות באמצעות תנאי מצע מוגדרים וסמני ברירה.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בבחירת מטרות למודולציה חיסונית על ידי אספקת ראיות פונקציונליות מוקדמות להשפעות ספציפיות לשושלת תאים.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס לתיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על השפעתן על החלטות גורל של תאי דנדריטים, ובכך תומך בהקצאה יעילה של משאבים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסדוקציה לנטיוויראלית, תרביות תאי המטופואטיים וציטומטריית זרימה.
- תלוי בגישה לספריות shRNA לנטיוויראליות, סלקציה באמצעות puromycin ומצעים המועשרו בציטוקינים (FLT3 ligand, beta estradiol).
- מצריך סטנדרטיזציה של יעילות הטרנסדוקציה (למשל, באמצעות spin infection) ומשך הסלקציה ליצירת knockdown יציב.
- כולל אופטימיזציה של תזמון הדיפרנציאציה ושל פאנלים של נוגדים לצורך זיהוי מדויק של תתי-סוגי תאי דנדריטים בציטומטריה.
- מוגבל למודלים in vitro; הממצאים דורשים תיקוף במערכות ראשוניות אנושיות או של עכברים לצורך רלוונטיות תרגומית.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
