Name: מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: למד שיטה לצמצום וריאציות טכניות במחקרי מטבולומיקה בקנה מידה גדול באמצעות הכנת דגימות ונורמליזציה. פרוטוקול זה משפר את הדיוק בניתוחי GWAS ומאפשר זיהוי אסוציאציות בין תכונות לסמנים גנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.B. נתמך על ידי IMPRS-PMPG 'חילוף חומרים ראשוני וגידול צמחים'. A.R.F. ו- S.A. מכירים בתמיכה הכספית של תוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי Horizon 2020, פרויקט PlantaSYST (מס ' SGA-CSA מס '739582 תחת FPA מס ' 664620), ופרויקט הגדלת (GA 862862).

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

הן GC-MS והן LC-MS הם כלים הנמצאים בשימוש נרחב ליצירת פרופילים של תערובות מורכבות של מחלקות מטבוליט שונות. טיפול במערכי נתונים גדולים באמצעות כלים אלה קשור מטבעו לווריאציה לא ביולוגית, למשל, שונות אנליטית, אשר מפריעה ומוטה את הפרשנות של התוצאות. פרוטוקול זה מציג צינור מיצוי חזק ותפוקה גבוהה ליצירת פרופיל מטבולי מקיף כדי למנוע וריאציות של מקור לא ביולוגי ולערוך מחקרי "אומיקה" בקנה מידה גדול. הנפחים והריכוזים המשמשים בפרוטוקול זה הותאמו למיני קטניות ברקמות שונות. עם זאת, ניתן לשנות מעט פרמטרים אלה ולהשתמש בהם גם לדגימות מטבוליות בקנה מידה גדול ממיני צמחים אחרים.
ניתן להשתמש ב-15 המיצויים המבוססים על MTBE שתוארו קודם לכן כדי לנתח מטבוליטים נגזרים, מטבוליטים קוטביים למחצה וליפידים. ניתן להרחיב זאת עבור מיצויי חלבונים והורמונים צמחיים39, שהיו מחוץ לתחום פרוטוקול זה. פרוטוקולי מיצוי אחרים מסתמכים על תערובות דיכלורומתאן:אתנול40,41. מבין פרוטוקולי המיצוי הללו, פרוטוקול מיצוי MTBE:methanol מספק חלופה חיובית ופחות מסוכנת לפרוטוקולי המיצוי הקיימים המבוססים על כלורופורם42 ואינו גורם לכדור חלבון כאינטרפאזה בין שלב הקוטב לשלב השומנים. יתר על כן, שיטות MTBE כבר שימשו במספר מחקרים עבור דגימות ביולוגיות שונות 43,44,45.
פרוטוקול זה דן במספר שלבים חיוניים שעשויים להוביל לשונות פוטנציאלית תוך כדי טיפול במספר רב של דגימות, למשל, במהלךקצירת 12,13, מיצוי14, כמו גם אקראיות46. יתר על כן, ישנם נושאים נוספים שלא נדונו בפרוטוקול זה שיש לקחת בחשבון כדי להבטיח נתונים מטבוליים באיכות גבוהה, למשל, אפקט מטריצה ודיכוי יונים14.
העוצמה של שיטות נורמליזציה מבוססות QC תלויה מטבעה במספר דגימות QC בכל אצווה. כפי שצוין קודם לכן, למרות שהגדלת המספר תגדיל את ההספק, השונות התוך-אצווה של ה-QCs היא שולית יחסית בהשוואה לשונות בין-אצווה במערכות אנליטיות אלה, כפי שמודגם באיור 3. בסך הכל, ישנן שיטות נורמליזציה אחרות המבוססות על QC, כגון הסרת שגיאות מערכתית באמצעות יער אקראי (SERRF), אשר הוכחו כבעלות ביצועים טובים יותר מרוב שיטות הנורמליזציה האחרות כגון יחס מבחינת אצווה, נורמליזציה באמצעות בחירה אופטימלית של תקנים פנימיים מרובים (NOMIS), ונורמליזציה של מניין הסתברותי (PQN)47 . עם זאת, SERRF מסתמך על מספר דגימות QC בכל אצווה, למשל, כל דגימה עשירית, דבר שאינו אפשרי בעת טיפול במספר רב של דגימות. היתרון העיקרי של נורמליזציה מבוססת QC על פני שיטות מבוססות נתונים או מבוססות תקן פנימיות אחרות הוא שהיא שומרת על השונות הביולוגית החיונית תוך התאמה לשונות טכנית לא רצויה28. הקוראים יכולים להתייחס לסקירה זו על הטיפול בווריאציה28.
אחת הבעיות העיקריות ב-GWAS היא שיעור התוצאות החיוביות הכוזבות, שמקורן בעיקר בשל קישור של אתרים סיבתיים ולא סיבתיים 48,49. שנית, גישות התיקון הסטטיסטי השמרניות, למשל, Bonferroni ו- FDR, נכונות למספר הבדיקות הבלתי תלויות, שאינו שווה למספר ה- SNPs שנבדקו ב- GWAS בשל הקישור בין SNPs קרובים50,51 לכן, המספר בפועל של בדיקות עצמאיות הוא לעתים קרובות נמוך יותר. דרך נוספת להפחית את הסף הסטטיסטי השמרני תהיה להפחית את מספר ה-SNPs שנבדקו המשמשים ל-GWAS בהתבסס על דעיכת קישור על פני אזורים גנומיים מוגדרים52. לפלטפורמת המטבולומיקה המשולבת בתפוקה גבוהה של GWAS המתוארת בפרוטוקול זה יש מגוון רחב של יישומים. בפרט, זה יקל על שיפורים בגידול יבולים על ידי שינוי הרכב המטבוליט/שומנים לרמות הרצויות מבחינה תעשייתית ותזונתית. באופן כללי, המטבולומיקה סיפקה תובנה מעמיקה לגבי הארכיטקטורה הגנטית של שפע של מטבוליטים וגיוון מטבולי שהתרחשו במהלך ביות היבולים בעשורים האחרונים, מה שמצביע על הפוטנציאל העצום של רבייה הקשורה למטבולומיקה53. הגישות הביולוגיות המולקולריות לאימות QTL במורד הזרם כוללות יצירת קווים מוטנטיים של CRISPR/Cas954, קווי החדרת T-DNA55, קווי ביטוי יתר יציבים ו/או ארעיים56, VIGS, מטבוליזם ex vivo מתקרב57 לצד הגישה המקובלת ביצירת אוכלוסיות F2 צולבות וכן אימות צולב באוכלוסיות שונות.
על ידי ביצוע התיקון הדרוש עבור הווריאציות האנליטיות כפי שתוארו לעיל, ניתן לבצע מספר גישות משולבות בנוסף ל- GWAS, כגון מטבוליט-מטבוליט, ניתוח מתאם מטבוליט-ליפידים, ניתוח מתאם לנתונים פנומיים כדי לשפוך אור על תכונות מורכבות יותר, ו / או ניתוח ביטויים משותפים כדי לפענח עוד יותר את הבסיס של מערכות ביולוגיות58.

גישות "אומיקה" בקנה מידה גדול אפשרו ניתוח של מערכות ביולוגיות מורכבות 1,2,3 והבנה נוספת של הקשר בין גנוטיפים לבין הפנוטיפים שהתקבלו4. מטבוליקה באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC-MS) ו- GC-MS אפשרה זיהוי של שפע של תכונות מטבוליט, שרק חלקן מבוארות במידה מסוימת, וכתוצאה מכך שיעור גבוה של מטבוליטים לא ידועים. ניתן לחקור אינטראקציות מורכבות על ידי שילוב של מטבוליקה בקנה מידה גדול עם השונות הגנוטיפית הבסיסית של אוכלוסייה מגוונת5. עם זאת, טיפול בערכות מדגמים גדולות קשור מטבעו לווריאציות אנליטיות, המעוותות את ההערכה של שונות מטבולית לתהליכים נוספים במורד הזרם. באופן ספציפי, בעיות מרכזיות המובילות לווריאציות אנליטיות מבוססות על ביצועי מכונה וסחף אינסטרומנטלי לאורך זמן6. השילוב של שונות בין אצווה לאצווה הוא מאתגר ובעייתי במיוחד כאשר מנתחים אוכלוסיות צמחים מובנות בקנה מידה גדול. הליכי נורמליזציה מרובים הוצעו כדי לתקן עבור וריאציות לא ביולוגיות, למשל, שימוש בתקנים פנימיים, חיצוניים ובעלי תווית איזוטופית כדי לתקן שגיאות אנליטיות, שכל אחת מהן קשורה מטבעה לבעיות ידועות ולמלכודות 7,8,9,10.
בנוסף לשונות אנליטית, הבחירה בפרוטוקולי חילוץ משתנה בדרך כלל בהתאם לשיטה האנליטית. בסופו של דבר, הוא רוצה להפחית את עלויות החומר והעבודה, כמו גם את הצורך להשתמש במספר aliquots של אותו מדגם עבור תהליכים אנליטיים שונים על ידי ביצוע שיטות מיצוי מבוססות הפרדת פאזה. שיטות אלה הוצגו לראשונה באמצעות כלורופורם: ממיסי מתנול/מים כדי לפצל תרכובות קוטביות והידרופוביות11.
פרוטוקול זה מתאר צינור מהיר בעל תפוקה גבוהה עבור פלטפורמה מרובת אומיקות כדי ליצור פרופיל הן של מטבוליטים קוטביים והן של שומנים במינים של קטניות. יתר על כן, הוא מראה כיצד ניתן לתקן את מערכי הנתונים הללו כראוי לשונות אנליטית ולנרמל אותם לפני שילוב מידע גנוטיפי כדי לזהות מוקדי תכונות כמותיות מטבוליטים (QTL) על ידי ביצוע GWAS.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים ותקנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3- פוספוכולין (17:0 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>תקן פנימי לליפידים</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Supleco</td><td>67-66-3</td><td>FAME ממס</td></tr><tr><td>איזוביטקסין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>38953-85-4</td><td>תקן פנימי למטבוליטים</td></tr><tr><td>חומצה ליגנוצרית מתילסטר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>2442-49-1</td><td>FAME</td></tr><tr><td>מתנול (MeOH)</td><td>Biosolve כימיקלים</td><td>13684102</td><td></td></tr><tr><td>מתוקסיאמין -הידרוכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>593-56-6</td><td>מטבוליט deriviatization</td></tr><tr><td>מתיל לאורט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>111-82-0</td><td>FAME</td></tr><tr><td>מתיל מיריסטאט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>124-10-7</td><td>תהילה</td></tr><tr><td>מתיל פלמיטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>112-39-0</td><td>FAME</td></tr><tr><td>מתיל סטארט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>112-61-8</td><td>FAME</td></tr><tr><td>מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE)</td> <td>Biosolve Chemicals</td><td>13890602</td><td>HPLC כיתה</td></tr><tr><td>מתיל-קפראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>110-42-9</td><td>FAME</td></tr><tr><td>מתיל-קפרילט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>111-11-5</td><td>תהילה</td></tr><tr><td>Methyldocosanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>929-77-1</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Methyleicosanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1120-28-1</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Methyl-hexacosanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5802-82-4</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Methyl-octacosanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55682-92-3</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Methyl-pelargonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1731-84-6</td><td>FAME</td></tr><tr><td>N-Methyl-N-( טרימתילסיליל)טריפלואוראצטמיד (MSTFA)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>24589-78-4</td><td>דה-ריוויאטיזציה של מטבוליט</td></tr><tr><td>פירידין</td><td>סופלקו</td><td>110-86-1</td><td>דחיפת מטבוליט</td></tr><tr><td>ריביטול</td><td>סופלקו</td><td>22566-17-2</td><td>תקן פנימי למטבוליטים נגזרים</td></tr><tr><td>חומצה טריאקונטנואית מתיל אסטר</td><td>TCI כימיקלים</td><td>629-83-4</td><td>מי</td></tr> <tr><td></td><td>FAMEBiosolve Chemicals</td><td>23214102</td><td>ULC-MS</td></tr> <tr><td>כיתה<חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה נעילה בטוחה</td><td>Eppendorf</td><td>3120086</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה נעילה בטוחה</td><td>Eppendorf</td><td>3120094</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorius Corporation</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>DB-35ms, 30 מ', 0,25 מ"מ, 0,25 מ"מ ומיקרו; m</td><td>Aglient</td><td>123-3832</td><td>ניתוח מטבוליטים נגזרים</td></tr><tr><td>מערכת GC-MS Leco</td><td>Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td><td></td><td>ניתוח מטבוליטים נגזרים</td></tr><tr><td>כדורי שחיקה, נירוסטה</td><td>OPS DIAGNOSTICS</td><td>GBSS 196-2500-10</td><td></td></tr><tr><td>MS מערכת</td><td>אקטיבית, מסוג Orbitrap, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td>ניתוח של ליפידים</td></tr><tr><td>MS מערכת</td><td>Q מיקוד אקטיבי (Q Exactive ומסחר; פוקוס היברידית Quadrupol-Orbitrap וסחר; Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td>ניתוח מטבוליטים</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf, דגם 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>שלב הפוך (RP) מגשר אתיל היברידי מגשר (BEH) C8 עמודה (100 מ"מ ופעמים; 2.1 מ"מ המכיל 1.7 &mu; חלקיקים בקוטר m)</td><td>מים</td><td>186002878</td><td>ניתוח שומנים</td></tr><tr><td>RP סיליקה בעלת חוזק גבוה (HSS) T3 עמודה (100 מ"מ ופעמים; 2.1 מ"מ המכיל 1.8 &mu; חלקיקים בקוטר m)</td><td>מים</td><td>186003539</td><td>ניתוח מטבוליטים</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>USC 300 TH</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>טחנת מיקסר טחינת רקמות</td><td>Retsch, טחנת מיקסר MM 300</td><td>20.746.0001</td><td></td></tr><tr><td>מערכת UPLC</td><td>מערכת Waters Acquity UPLC (מים)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ואקום רכז</td><td>מהירות סריקה Maxi Vac Alpha Evaporators</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>Vortex-Genie 2, דגם G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetAlign</td><td></td><td></td><td>עיבוד כרומטוגרמה</td></tr><tr><td>MzMine</td><td></td><td></td><td>עיבוד כרומטוגרמה</td></tr><tr><td>R חבילה "data.table" </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חבילת R "fujiplot"</td><td></td><td></td><td>, מפה פליאוטרופית</td></tr><tr><td>חבילת R "גנטיקה"</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>חבילת R "Ime4"</td><td></td><td></td><td>חישוב BLUPs</td></tr><tr><td>חבילת R "LDheatmap"</td><td></td><td></td><td>עלילות LD</td></tr><tr><td>חבילת R "MASS"</td><td></td><td></td><td>טרנספורמציה</td></tr><tr><td>חבילת R "rMVP"</td><td></td><td></td><td>GWAS</td></tr><tr><td>R גרסה 4.0.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RefinerMS</td><td></td><td></td><td>עיבוד כרומטוגרמה</td></tr><tr><td>RefinerMS Genedata</td><td>Expressionist</td><td></td><td>עיבוד כרומטוגרמה</td></tr><tr><td>ציצית 5</td><td></td><td></td><td>סינון גנוטיפ</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td>עיבוד כרומטוגרמה</td></tr></tbody></table>

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (mo-gwas): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

הן ספקטרומטריית כרומטומטריית מסה-כרומטוגרפיית גז (GC-MS) והן ספקטרומטריית מסה-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) הן גישות מטבוליות הנמצאות בשימוש נרחב כדי לזהות ולכמת מאות אלפי תכונות מטבוליט. עם זאת, היישום של טכניקות אלה על מספר רב של דגימות נתון לאינטראקציות מורכבות יותר, במיוחד עבור מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים (GWAS). פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מטבולית אופטימלית, המשלבת הכנת דגימות יעילה ומהירה עם ניתוח של מספר רב של דגימות עבור מיני יבול קטניות. שיטת מיצוי שונה במקצת זו פותחה בתחילה לניתוח רקמות צמחים ובעלי חיים ומבוססת על מיצוי באתר מתיל טרט-בוטיל: ממס מתנול כדי לאפשר לכידה של מטבוליטים קוטביים ושומנים. בנוסף, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להפחתת וריאציות אנליטיות, החיוניות להערכת התפוקה הגבוהה של שונות מטבולית ב- GWAS.

ניסויי GWAS מוצלחים במטבולומיקה צריכים להתחיל בתכנון ניסויי נכון, ולאחר מכן באיסוף דגימות, חילוץ, איסוף נתונים ועיבודם, כפי שמודגם באיור 1. בפרוטוקול זה, שיטת MTBE15 שימשה לחילוץ וניתוח של מאות מטבוליטים השייכים למספר מחלקות מורכבות. הכרומטוגרפיה תלויה מאוד בתכונות של העמודה המנוצלת, כמו גם בתערובות של מאגרי אלוטיון. איור 2 מראה כרומטוגרמות של דגימות QC, מה שמצביע על דפוס האלוטציה של כמה מחלקות ליפידים עיקריות במערכת אנליטית זו. מעברי הצבע החלים עבור כל פלטפורמה מופיעים בטבלה 1. דגש רב הושם על טיפול בטעויות מערכתיות בניסויים רחבי היקף. ביצוע מטבוליזם בקנה מידה גדול קשור מטבעו לשגיאות מערכתיות. לצורך הדגמה, ניתחנו נתונים ליפידומיים על פני כמה מיני שעועית נפוצים. טבלה משלימה 1 מספקת את הנתונים הליפידומיים הגולמיים שחולצו לאחר עיבוד הכרומטוגרמה באמצעות התוכנה המצוינת בטבלת החומרים. בעקבות פרוטוקול זה אפשרה לנו לעקוף בעיות מרכזיות בהתמודדות עם נתוני omics, במיוחד תוך טיפול בערכות דגימה גדולות. הליך הנורמליזציה מניב תיקון מדויק של שגיאות אנליטיות מבחינת אצווה, כפי שהודגם באיור 3. למרות שהגדלת מספר דגימות ה- QC תגדיל את עוצמת הנורמליזציה, זה לא תמיד אפשרי בשל אילוצי עלות וזמן. עבור מטבוליקה בתפוקה גבוהה GWAS עם תכונות מטבוליות לא ממוקדות, חיוני להמחיש מספר גבוה יותר של קשר בין סמן תכונות כראוי. מפה פליאוטרופית38 המשלבת תוצאות GWAS מרובות יכולה לשמש כדי להדגיש את האזורים הגנומיים שאליהם מקושרות מספר תכונות (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה של GWAS מבוסס מטבוליקה בצמחים. מספר שלבים החל מתכנון הניסוי ועד לזיהוי QTL מוצגים בלוח השמאלי. בחלונית הימנית, מוצגים איורים מרובים התומכים במספר שלבים המוזכרים בחלונית השמאלית. החל מהחלק העליון הימני, (1) מוצג רצף מוצע של דגימות עבור LC-MS, (2) חלקות ניקוד לפני ואחרי מנורמל של PCA, כולל התפלגות תכונה מייצגת לפני ואחרי עיבוד, עם אדום המציין את עוצמות דגימת QC, ו-(3) מגרש במנהטן עם אסוציאציות משמעותיות שאליהן נוצרו התפלגויות LD והפלוטיפ. קיצורים: GWAS = מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים; QTL = תכונה כמותית loci; PCA = ניתוח רכיבים עיקריים; QC = בקרת איכות; LD = אי-שיווי משקל קישור; MS = ספקטרומטריית מסות; LC-MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה; GC-MS = כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה; LOESS = החלקת פיזור משוערת מקומית; MLM/MLMM = מודל ליניארי מעורב/מודל מעורב מרובה לוקוסים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg"> איור 2: עיבוד כרומטוגרמה. שתי כרומטוגרמות QC (שיא בסיס; נתוני שומנים) מאצוות שונות מדגימות את השונות מבחינת האצווה עבור מחלקות שומנים מסוימות בדגימות QC המאוגדות. ארבעה סוגי שומנים עיקריים מסומנים עם חלונות האלוטיון המתאימים שלהם במערכת LC-MS הפנימית. הכרומטוגרמות יוצאו מ-MzMine21. קיצורים: QC = בקרת איכות; LC-MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg"> איור 3: תיקון טעות שיטתית. ניתוח רכיבים עיקריים של נתונים ליפידומיים נרכשים, טרום- (שמאל, נתונים גולמיים) ולאחר תיקון עבור שגיאות מערכתיות (מימין, אצווה loess). הלוחות התחתונים ממחישים את התפלגות התכונה (Cluster_00005) על פני הדגימות (n=650) והאצוות (n=10) לפני התיקון (משמאל) ולאחר (ימין) לצורך וריאציה אנליטית. קיצורים: PCA = ניתוח רכיבים עיקריים; QC = בקרת איכות; LOESS = החלקת פיזור משוערת מקומית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg"> איור 4: מפה פליאוטרופית הממחישה את התוצאות המשולבות של GWAS. המפה הפליאוטרופית מדגישה אזורים בגנום כולו הקשורים למספר תכונות. המספרים בטבעות החיצוניות מציינים את הכרומוזומים המתאימים. כל עיגול מייצג תכונה אינדיבידואלית עם ה- SNPs הקשורים אליה באופן משמעותי. הצבעים מייצגים מחלקות מורכבות שונות (אפור = מחלקה מורכבת 1; ירוק = מחלקה מורכבת 2; סגול = תרכובת מחלקה 3; צהוב = מחלקה מורכבת 4). במקרה של אסוציאציות בין-מורכבות עם אותו אזור גנומי, מודגשים גנים. העיגול האפור הפנימי מציג את סכום כל ה- SNPs המשמעותיים הקשורים למיקום גנומי מסוים. האסוציאציות המוצגות באיור זה נוצרות באופן מלאכותי רק להמחשה. קיצורים: GWAS = מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים; SNPs = פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="5">הגדרות UHPLC-MS עבור שומנים</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן [מינימום]</td>
			<td>Eluent A עד B [%]*</td>
			<td colspan="3">מידע</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% א</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1% 1M NH4-אצטט, 0.1% חומצה אצטית במים (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 1% 1M NH4-אצטט, 0.1% חומצה אצטית באצטוניטריל/2-פרופנול 7:3 (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">
קצב זרימה: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">
נפח הזרקה: 2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% א</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">הגדרות UHPLC-MS/MS עבור מטבוליטים קוטביים וחצי-קוטביים</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן [מינימום]</td>
			<td>Eluent A ו-B [%]*</td>
			<td colspan="3">מידע</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% א</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 0.1% חומצה פורמית במים (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל (ציון UHPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">
קצב זרימה: 400 μL/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">
נפח הזרקה: 3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">הגדרות GC-MS עבור מטבוליטים נגזרים</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן [מינימום]</td>
			<td>טמפרטורה [°C]</td>
			<td colspan="3">מידע</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">
גז מוביל: הליום</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">
קצב זרימה: 2 מ"ל לדקה</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">
שיפוע טמפרטורה: 15 °C /min</td>
		</tr>
<tr>
<td>24.66</td>
			<td>קירור מהיר</td>
			<td colspan="3">
נפח הזרקה: 1 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הגדרות מעבר צבע עבור כל אחת מהפלטפורמות האנליטיות7. קיצורים: lg = גרדיאנט ליניארי; cw = שטיפת עמודים; eq = שיווי משקל; UHPLC-MS = ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית-מסה בעלת ביצועים גבוהים במיוחד; UHPLC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד- ספקטרומטריית מסה טנדם; GC-MS = כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה. * = ערך האחוז מתאים לאלוף A; ערך האחוז הנותר מתאים ל- B eluent.
טבלה משלימה 1: נתוני ליפידומיקה גולמית. מציין את עוצמות השיא עבור כל אחד מהאשכולות שזוהו מעל כל דגימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

בפרוטוקול זה אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת, המשלבת הכנת דגימות יעילה ומהירה של דגימות רבות. בנוסף, אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב להפחתת וריאציות אנליטיות להערכת תפוקה גבוהה של מחקרי GWAS מטבוליים.

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

חקירת אוכלוסייה גדולה יותר מגיעה עם וריאציה מונחית מכונה, אשר על ידי כך הווריאציה בפועל שמקורה במגוון הטבעי. כאן אנו מדגימים שיטה להפחתת השונות הטכנית לניתוח אינטגרציה במורד הזרם. היתרונות של טכניקה זו כוללים מיצוי מבוסס הפרדת פנים, המספק ניתוח של מטבוליטים שונים על הפלטפורמה האנליטית המתאימה, תוך הסרת השגיאה המערכתית ושמירה על השונות הביולוגית.לאחר קבלת המידע הגנוטיפי והפנוטיפי, ניתן ליישם שיטה זו על כל אוכלוסייה טבעית מגוונת בכל ממלכת חיים. כדי להתחיל לקחת צינורות קציר של 20 מיליליטר, להוסיף שניים חמישה מילימטר, ושני חרוזי מתכת בקוטר שמונה מילימטר להומוגניזציה ולתייג את הצינורות. לאחר מכן, מלאו דיואר בחנקן נוזלי, מיד לאחר חיתוך דגימות עלים טריים של עלים ורקמות שורש בחנקן נוזלי על ידי הקפאת הבזק.אחסנו את הדגימות הביולוגיות שנקטפו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד. קירור מראש של מחזיקי הצינורות בחנקן נוזלי. לאחר מכן, לטחון את הרקמות ב 25 הרץ במשך דקה אחת כדי לקבל אבקה הומוגנית.חוזרים על הקפאה, וטחינה אם הרקמה אינה נטחנת באופן הומוגני. שקלו 50 מיליגרם של חומר צמחי טרי בצינורות מיקרו-צנטריפוג' עם תווית מקוררת מראש עם נעילה בטוחה לשני מילימטרים, המבטיחים שהחומר הצמחי יישאר קפוא במהלך תהליך השקילה. הוסיפו מיליליטר אחד של תערובת מיצוי מקוררת מראש 1 עד 50 מיליגרם אליקווט של הדגימה, וסובבו את הצינור לזמן קצר לפני שהם שומרים על קרח.דגירה של הדגימות על שייקר מסלולי ב-800 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן sonication באמבט סוניקציה מקורר קרח במשך 10 דקות. השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 500 מיקרוליטרים של תערובת מיצוי גם לדגימות וערבבו את התמציות על ידי מערבולת קצרה, ואז צנטריפוגה בתערובת ב-11, 200 פעמים G למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, העברת 500 מיקרוליטרים של הפאזה המכילה שומנים עליונים מופרדים לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם תווית מוקדמת של 1.5 מיליליטר, הוסרה שאר הפאזה העליונה.בנפרד, 1.5 מיליליטר בטוח נעילה צינורות microcentrifuge להעביר 150 microliters של פאזה חצי קוטבית תחתונה ארבעה GCMS ו 300 microliters של פאזה חצי קוטבית ארבעה U-H-P-L-C MS ניתוח. השתמשו ברכז ואקום לאידוי ממסים כדי לרכז את כל השברים המופקים ללא חימום ולאחסן את השברים המיובשים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את הדגימה לביצועים גבוהים במיוחד, כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסות או H-P-L-C MS משעים מחדש את השברים הקוטביים למחצה המיובשים ב-180 מיקרוליטרים של תערובת של מתנול ומים.לאחר מכן צליל את הפאזה הקוטבית למחצה במשך 2 דקות, ואחריה צנטריפוגה ב 11, 200 פעמים G במשך דקה אחת. לאחר צנטריפוגה, מעבירים 90 מיקרוליטרים של הסופרנאטנט לבקבוקון זכוכית ומזריקים שני מיקרוליטרים של התמציות לתוך דגימת ה-LCMS שנמזגה. בצע את פיצול המטבוליטים בעמודת שלב C18 הפוכה המוחזקת ב-40 מעלות צלזיוס, וזרימה של 400 מיקרוליטרים לדקה עם שינויים הדרגתיים של שפכים A ו-B, רכשו את ספקטרום המסה של דגימות הבדיקה הריקות ובקרת האיכות במצב יינון שלילי עם טווח מסה של 102 1500 מסה ליחס מטען.עבור דגימות מטבוליטים קוטביים למחצה, הפעל דגימת QC מאוגדת בספקטרומטריית מסות טנדם תלוית נתונים במצבי יינון שליליים וחיוביים. השתמש בספקטרום המסה המתקבל עבור הביאור. בצע את הנורמליזציה של ערכת הנתונים על-ידי בדיקת התפלגות התקן הפנימי.נרמל את הנתונים על ידי תיקון האות של תקנים פנימיים בודדים או מרובים. לאחר מכן, תקן את עוצמות השיא המתקבלות מהכרומטוגרמה על פני משקל הדגימה המדויק. לתיקון סחף העוצמה על פני סדרות מרובות אצווה, בצע שיטות תיקון מבוססות QC כגון החלקת פיזור משוערת מקומית באמצעות R.לפני ביצוע מחקרי שיוך כלל-גנומיים או GWAS, סנן את הנתונים הגנוטיפיים עבור תדרי אלל קלים הנמוכים מ-5% ושיעור חסר של יותר מ-10% באמצעות ציצית.זה ימנע הטיה בתדר נמוך. כדי למנוע את ההטיה שמקורה בגורמים הסביבתיים, השתמש בחבילת R LME four וחשב את התחזיות או התחזיות הליניאריות והבלתי משוחדות הטובות ביותר עבור כל תכונה מנורמלת על פני החזרות הניסוייות. השתמש ב-blops של כל תכונה בנפרד כדי לבצע GWAS עם חבילת rMVP ב-R.הנתונים הליפידומיים על פני מספר מיני שעועית נפוצים מוצגים על סמך כרומטוגרמות שיא הבסיס הגולמיות של שתי דגימות QC מאצוות שונות.שינוי בעוצמות האות נצפתה בשיעורי ליפידים מסוימים. השגיאה המערכתית הייתה ברורה יותר כאשר ניתוח הרכיבים העיקריים בוצע על הנתונים הגולמיים. הליך הנורמליזציה, כולל החלקת הפיזור המוערכת באופן מקומי, הוביל להתקבצות של דגימות ה-QC.בעת ניתוח לאשכולות הבודדים, שגיאות מונחות מכונה באצווה 7 ו-8 התבררו לפני הנורמליזציה, שתוקנה. האשכולות המטבולומיים האינדיבידואליים המנורמלים והמשתנים שימשו עבור GWAS, והניבו מספר אסוציאציות של סמני תכונות. בניתוח הייצוגי, מחלקות תרכובות שונות מודגשות בצבעים שונים, בעוד שהסמנים הקשורים למחלקות מורכבות מרובות מסומנים עם הגן הקרוב ביותר שלו.נורמליזציה ושינוי צורה של נתונים הם אחד השלבים החשובים ביותר. ודא שבוצע תיקון תקין כדי לתקן שגיאה מערכתית ולהבטיח נורמליות בהתפלגות. על ידי ביצוע התיקון עבור השונות האנליטית, ניתן לבצע מספר גישות אינטגרציה, כגון ניתוח מתאם מטבולי ואינטגרציה בנתונים פנומיים כדי לשפוך אור על תכונות מורכבות.

large-scale-multi-omics-genome-wide-association-studies-mo-gwas

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול מתואר המשתמש במבחני Infinium של Illumina לבצע גנוטיפ בקנה מידה גדולה. מבחני אלה יכולים אמין גנוטיפ מיליונים SNPs על פני מאות דגימות DNA בודדות בשלושה ימים. נוצר פעם אחת, יכולים לשמש גנוטיפים הבאים כדי לבדוק לעמותות עם מגוון רחב של מחלות או פנוטיפים שונים.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

זיהוי של וריאציות גנטיות לתרום מחלות אנושיות מורכבות מאפשר לנו לזהות מנגנונים חדשניים. . הנה, נדגים הגישה מולטיפלקס genotyping של המועמד גנים או מסלול מפענוח ממקסם את הכיסוי במחיר נמוך, הוא נוטה מחקרי עוקבה מבוסס.

ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה

על ידי הפעלת כלי המחקר של איגוד הנתיבים (PAST), באמצעות היישום הנוצץ או באמצעות קונסולת R, החוקרים יכולים לקבל הבנה עמוקה יותר של המשמעות הביולוגית של תוצאות מחקר הקשר הגנום שלהם (GWAS) על ידי חקירת המסלולים המטבוליים המעורבים.

כלי מחקר של איגוד הנתיבים עבור ניתוחי GWAS של מידע על מסלול מטבולי

להלן, אנו מתארים הליך לניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול. ההליך רלוונטי למחקרים החוקרים קשרים בין דפוסי מתילציה של גנים וגורמים התורמים מסרטן בסרטן מערכת העיכול.

ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

המחקר הנוכחי מתאר את זרימת העבודה לניהול נתוני מתילציה DNA המתקבלים על ידי טכנולוגיות microarray. הפרוטוקול מדגים שלבים מהכנה מדגמית לניתוח נתונים. כל ההליכים מתוארים בפירוט, והסרטון מציג את השלבים המשמעותיים.

הכנת מדגם לניתוח ביואינפורמטיקה של מתילציה DNA: אסטרטגיית האגודה להשמנת יתר ומחקרי תכונות נלוות

הפרוטוקול מציג את ההליכים הכוללים במעבדה הנדרשים בבדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. כאן אנו מציגים את השלבים המפורטים של הגברה גנומית שלמה, בחירת מקטעי DNA, בניית ספרייה, הכנת תבניות וזרימת עבודה של ריצוף עם תוצאות מייצגות.

בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

למד שיטה לצמצום וריאציות טכניות במחקרי מטבולומיקה בקנה מידה גדול באמצעות הכנת דגימות ונורמליזציה. פרוטוקול זה משפר את הדיוק בניתוחי GWAS ומאפשר זיהוי אסוציאציות בין תכונות לסמנים גנטיים.

מחקרי אסוציאציה רב-גנומית בקנה מידה גדול (Mo-GWAS): קווים מנחים להכנת דגימות ונורמליזציה

גלה סרטונים נוספים