Name: ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: למד שיטה פשוטה לייצור ליסאט חיידקי באיכות גבוהה מזן Escherichia coli מונדס אוטוליזיס. הפרוטוקול מאפשר ביטוי גנים ללא תאים במעבדות סטנדרטיות בקלות ובמהירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לזאקרי סאן וריצ'רד מוריי (המכון הטכנולוגי של קליפורניה) על שסיפקו בחביבות את הפלסמיד P_araBAD-gamS, ואת Kaeko Kamei (המכון הטכנולוגי של קיוטו) על שסיפקו בחביבות צנטריפוגת קירור במהירות גבוהה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ומתוכנית ARO MURI ונתמכה בחלקה על ידי היוזמה המובילה לחוקרים צעירים מצוינים, MEXT, יפן.

1. הכן מדיה ומאגרים.
<ol><li>הכן 2xYTPG בינוני.<ol>
<li>יש לערבב 62 גרם אבקת 2xYT, 5.99 גרם אשלגן פוספט מונובאזי, 13.93 גרם אשלגן פוספט דיבסי ומים דה-יוניים ל-2 ליטר.</li>
		<li>Autoclave על מחזור נוזלי עם זמן חשיפה של 30 דקות14.</li>
		<li>ל-400 מ"ל של מדיה של 2xYTP מ-1.1.2, הוסיפו 7.2 גרם D-גלוקוז (דקסטרוז) וערבבו עד להמסה.</li>
		<li>עיקור מסנן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן מאגר S30A.<ol>
<li>ערבבו את Tris-HCl (pH 7.7, 50 מ"מ בריכוז סופי), אשלגן גלוטמט (60 מ"מ סופי) ומגנזיום גלוטמט (14 מ"ר סופי).</li>
		<li>כוונן את ה- pH ל- 7.7 באמצעות 10 M KOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת פתרון 1 (ראה טבלה 1).<ol>
<li>Resuspend 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1- חומצה פיפרזינתאנסולפונית (HEPES) ב 2 מ"ל של מים.</li>
		<li>כוונן את ה- pH ל- 8.0 באמצעות KOH.</li>
		<li>הוסף את כל הרכיבים האחרים מטבלה 1.</li>
		<li>כוונן את ה- pH ל- 7.6 באמצעות 10 M KOH. מסנן לעקר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן פתרון פרמיקס 2.5x (ראה טבלה 2).<ol>
<li>ערבבו את כל הרכיבים בטבלה 2.</li>
		<li>כוונן את ה- pH ל- 7.5 באמצעות KOH.</li>
		<li>עליקוט ולהקפיא ב -80 °C (50 °F). הערה: תגובה של 20 μL משתמשת ב- 8.9 μL של premix.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכן תאים.
<ol><li>פס התאים autolysate על לוחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / mL אמפיצלין באמצעות לולאה מחסן לגדול ב 37 °C (ראה הערה 1).</li>
	<li>בחר מושבה אחת לתוך תרבות המתנע של מדיום LB / אמפיצלין באמצעות קצה צינור ולגדול ב 37 °C (50 °F) לילה.</li>
	<li>לחסן 400 מ"ל של 2xYTPG בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצ'ילין עם 400 μL של תרבות המתנע, ולגדול ב 37 °C (57 °C) בבקבוק 1 L Erlenmeyer, רועד ב 300 סל"ד.</li>
	<li>מדי פעם למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD600)באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לקרוא cuvette אופטי עם אורך נתיב 1 ס"מ. כאשר OD600 עולה על 1, להתחיל לדלל את התרבות פי 5 לפני מדידות כדי להבטיח כי המדידות יישארו בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר מעבדה טיפוסי. המשך לגדל את התאים עד שתרבית הדילול פי 5 תגיע ל- OD600 של 0.3 (המקבילה לתרבות OD600 של 1.5).</li>
</ol>3. הכן את הלסייט.
<ol><li>הכן חוצץ S30A בתוספת 2 mM dithiothreitol (DTT). לערבב 3 מ"ל של חוצץ S30A עם 6 μL של פתרון מלאי DTT ב 1 M. מקום על קרח לשימוש בשלב 3.7.</li>
	<li>לקצור את התאים על ידי centrifuging ב 1800 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להשליך את supernatant על ידי שפיכת אותו ושימוש בצינור כדי להסיר כל נוזל שנותר.</li>
	<li>resuspend הכדור ב 45 מ"ל של חיץ S30A קר (4-10 °C) באמצעות מערבל מערבולת.</li>
	<li>שקול צינור צנטריפוגה ריק 50 מ"ל, להעביר את התאים לתוכו, ולחזור על שלבים 3.2-3.3 לשטוף את התאים.</li>
	<li>שקול את הכדור, מפחית את המשקל של צינור ריק 50 מ"ל. הקפד לשאוף בזהירות כל supernatant שנותר כדי להבטיח מדידה מדויקת של משקל גלולה. הערה: תשואה טיפוסית היא ~ 1.3 גרם של גלולה תא מ 400 מ"ל של תרבות הייצור.</li>
	<li>הוסף 2 כרכים של חיץ S30A קר בתוספת 2 mM dithiothreitol, כלומר, 2 מ"ל של חוצץ עבור כל 1 גרם של גלולה התא, ו resuspend התאים על ידי ערבוב מערבולת נמרצת.</li>
	<li>תקפיא את התאים. מניחים את צינור 50 מ"ל המכיל את התאים במקפיא -20 °C (50 °F) או -80 °C (50 °F) עד שהכדור קפוא לחלוטין. הערה: שלב ההקפאה הוא נקודת עצירה טובה להיום.</li>
	<li>להפשיר את התאים באמבט מים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבולת במרץ במשך 2-3 דקות.</li>
	<li>דגירה ב 37 °C (45 °F) במשך 45 דקות עם רועד ב 300 סל"ד.</li>
	<li>נקה את הדגימה של פסולת תאית כבדה על ידי צנטריפוגה בצינורות צנטריפוגות שקופים ב 30,000 × גרם במשך 45 דקות ב 4 °C (70 °F). הערה: אם צנטריפוגה המסוגלת 30,000 x g אינו זמין, צנטריפוגה במשך 45 דקות ב 21,000 × גרם, ולנקוט זהירות נוספת בשלב 3.13, כמו הכדור יהיה פחות קומפקטי.</li>
	<li>בזהירות להעביר את supernatant לצינור חדש עם צינור, הימנעות הפרעה הכדור ככל האפשר. אם supernatant מועבר מזוהם עם חומר מן הכדור, לחזור על השלב הקודם.</li>
	<li>העבר את supernatant ל 1.5 מ"ל צנטריפוגות צנטריפוגות צנטריפוגה פעם נוספת ב 21,000 × גרם (או המהירות המרבית של צנטריפוגה שולחן) במשך 5 דקות.</li>
	<li>Aliquot autolysate פינה לתוך הכרכים הרצויים, בזהירות הימנעות כל גלולה שנותרה, להקפיא ב -80 °C (80 °F) או להשתמש מיד. הערה: תגובה אחת של 20 μL משתמשת ב- 8 μL של autolysate.</li>
</ol>4. ביטוי גנים ללא תאים
הערה: ה- Autolysate מוכן כעת לכל שימוש קצה רצוי. להלן פרוטוקול סטנדרטי לדוגמה לביטוי גנים ללא תאים.
<ol><li>לתגובה של 20 μL, לערבב על קרח 8 μL של autolysate ו 8.9 μL של premix. ראה הערה בסוף סעיף הפרוטוקול לגבי אופטימיזציה של מגנזיום גלוטמט וריכוזים PEG 8000.</li>
	<li>הוסף DNA (למשל, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 לריכוז סופי של 8 ננומטרים), כל ריאגנטים אחרים, ומים ל 20 μL.</li>
	<li>מקם את התגובה במיקרו-לוחית בעלת 384 באר ומדוד את מסלול הזמן של הפלואורסצנטיות ו/או נקודות הקצה באמצעות קורא לוחות. עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), השתמש באורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר.</li>
</ol>5. שינויים בפרוטוקול
הערה: השינויים הבאים של הפרוטוקול מאפשרים לו לשרת יישומים אחרים.
<ol><li>ביטוי גנים ללא תאים באמצעות תבניות DNA ליניאריות<ol>
<li>בצע את השלבים בסעיף 4, שכשהם את התגובה עם 2.2 מיקרומטר חלבון GamS מטוהר (מבוטא ומטוהר כמתואר12) לפני הוספת ה- DNA הליניארי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביטוי גנים ללא תאים המשלבים ירידה בחלבון<ol>
<li>בשלב 2.1, השתמש בתאים אוטומטיים המכילים את plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (ראה טבלת החומרים). בכל מדיה צמיחה, בנוסף כוללים 34 מיקרוגרם / mL כלורמפניקול.</li>
		<li>בשלב 2.3, כלול איזופרופיל 40 מיקרומטר β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במדיום הצמיחה כדי לגרום לביטוי מהפלסטיד.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.2-3.4 (כביסה) פעמיים נוספות (בסך הכל שלוש שטיפות) כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורמפניקול, שהוא מעכב תרגום. עבור שתי הכביסות הראשונות (שלב 3.4), החליפו את חיץ S30A עם תמיסת מלח עם פוספט (pH 7.4).</li>
		<li>בשלב 4.2, תוספת עם ATP נוסף של 3 מ"מ (נוסף מפתרון מלאי של 100 מ"מ ATP במים, pH 7.2) ו 4.5 mM מגנזיום גלוטמט (באמצעות פתרון מלאי 1 M במים) (ריכוזים סופיים) כדי לפצות על שימוש ATP גבוה על ידי ClpXP, כמו גם כלציה של מגנזיום על ידי ATP נוסף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביטוי גנים ללא תאים באמצעות קריאות מבוססות LacZ (כולל colorimetric)<ol>
<li>בשלב 2.1, השתמש בתאים אוטומטיים שאינם מבטאים LacZ באופן מקורי (ראה טבלת החומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלופין, להכין את ליסאט ישירות מתאים מיובשים בהקפאה.<ol>
<li>בצע את כל השלבים מ- 1.1 עד 3.7.</li>
		<li>לערבב 8 μL של השעיית תא עם 8.9 μL של premix.</li>
		<li>הוסף DNA plasmid (אם תרצה), ריאגנטים מותאמים אישית אחרים, ומים כדי להגיע לנפח סופי של 20 μL.</li>
		<li>מעבירים את התגובה למיקרו-לוחית 384-באר ומייבשים אותה בהקפאה. הערה: ניתן לאחסן דגימות מיובשות בהקפאה עד שבוע ואולי אף יותר.</li>
		<li>כדי להתחיל את התגובה, rehydrate אותו עם 18 μL של מים deionized בתוספת כל DNA הרצוי או ריאגנטים אחרים.</li>
		<li>עקוב אחר הדינמיקה פלואורסצנטית בקורא לוחות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>הערה 1: תאים אוטומטיים מתוכננים להתיז על מחזור הפשרת הקפאה, ולכן חשוב במיוחד להשתמש cryoprotectant בעת ביצוע מלאי קפוא. הקפאנו מניות ב 24% wt / vol גליצרל ואחסנו אותם ב -80 °C (80 °F).
הערה 2: יונים מגנזיום ו PEG 8000 הם קריטיים לביצועי ליסאט. הבסיס 2.5x premix, המבוסס על נתונים שפורסמו בעבר, מכיל 6 mM מגנזיום גלוטמט ו 4.8% wt / vol PEG 8000, אשר הופכים 2.4 mM ו 1.9%, בהתאמה, בתגובה הסופית. Autolysate מוכן עם הפרוטוקול כאן בדרך כלל מבצעים הטובים ביותר עם 5 מ"מ נוספים Mg-גלוטמט ו 1.5% PEG 8000 בתגובה הסופית. עם זאת, ניתן למטב זאת בטווח של גלוטמט Mg נוסף של 0-10 מ"מ ו-0-3% PEG 8000 נוספים (בהשוואה לפני הקדם הבסיסי). כדי להכין את premix עם מומלץ 5 מ"מ נוסף Mg-גלוטמט ו 1.5% PEG 8000 (ריכוזים סופיים), לערבב 380 μL של premix עם 4.75 μL של מגנזיום גלוטמט ב 1 M ו 36.1 μL של PEG 8000 ב 40% משקל / נפח.

<ol><li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+metabolic+engineering%3A+biomanufacturing+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+without+boundaries%3A+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li>
<li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+in+proteomics+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li>
<li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+%22breadboard%22%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%222019+IEEE+32nd+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28MEMS%29%22%5BJournal%5D)">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li>
<li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li>
<li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
</ol>

J.H. הוא מייסד שותף של GenCirq Inc, המתמקדים טיפולי סרטן. הוא חבר במועצת המנהלים ויש לו הון עצמי ב-GenCirq.

הפרוטוקול המתואר כאן מניב ליסאט חיידקי פעיל מאוד לביטוי גנים ללא תאים. המפתח הוא להשתמש בתאים הנושאים את pAD-LyseR, המבטא את הלמבדה פאג' אנדוליסין בציטוזוליה. תאים אלה הם potentiated כדי lyse עצמם על permeabilization של הממברנה הפנימית, המאפשר את הגישה אנדוליסין לקיר התא, אשר השיטה משיגה באמצעות מחזור פשוט להפשיר הקפאה. מכיוון שהתאים למעשה מתמוססים, המוצר מכונה autolysate. לאחר שהתאים נרקמו, השלבים היחידים שנותרו הם דגירה וצנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת תאית.
בהשוואה לשיטות אחרות לי...

ביטוי גנים בליסאטים ללא תאים יש מספר יתרונות על פני שימוש בתאים חיים1,2,3,4. ליסאטים ניתן לשנות בקלות ביוכימית ולהשתמש בתנאים שיכולים להיות מזיקים או בלתי אפשרי להשיג בתאים חיים. מעגלי ביטוי גנים אינם צריכים להתמודד או להתחרות בתהליכים ביולוגיים מארחים, ובדיקת מעגלים גנטיים חדשים היא פשוטה כמו הוספת DNA. מסיבות אלה, ביטוי גנים ללא תאים מצא יישומים שונים, מ biosensors5,6 כדי במהירות טיפוס מעגלי גנים סינתטיים7,8 לפתח תאים מלאכותיים9. רוב ביטוי הגנים ללא תאים משתמש lysates הסלולר כי כבר מעובד מאוד, בדרך כלל דורש פרוטוקולים ארוכים ומורכבים, ציוד מיוחד, ו / או צעדים רגישים שיכולים להוביל וריאציה משמעותית בין משתמשים אצוות10,11.
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לייצור ליסאט ללא תאים הדורש עיבוד ומומחיות מינימליים (איור 1A)12. השיטה מסתמכת על תאי E. coli כי הם מהונדסים lyse לאחר מחזור פשוט להפשיר הקפאה. התאים מבטאים אנדוליסין מפג' למדה שמשפיל את דופן התא. ככל שהתאים גדלים, אנדוליסין זה נשאר בציטופלסמה, מופרד מקיר התא. עם זאת, מחזור פשוט להפשרת הקפאה משבש את הממברנה הציטופלסמית, משחרר את האנדוליזין לתוך הפריפלסמה, שם הוא משפיל את דופן התא, וכתוצאה מכך תמוגה מהירה של התא. הפרוטוקול יכול להסתיים עם רק כמה שעות של עבודה מעשית ודורש רק מקפיא, צנטריפוגה המסוגלת 30,000 × גרם (לקבלת תוצאות אופטימליות; מהירויות נמוכות יותר ניתן להשתמש בזהירות רבה יותר לא להפריע לכדור), מערבל מערבולת, ופתרון חיץ פשוט. ליסאט פונקציונלי יכול אפילו להיות מיוצר על ידי ייבוש קפוא של התאים rehydrating אותם במקום. עם זאת, שיטה זו מייצרת lysates עם פעילות נמוכה יותר, ככל הנראה בשל פסולת התא הנותרת.
lysates פעילים מאוד עבור ביטוי גנים ללא תאים, והם יכולים להיות משופרים בדרכים שונות בהתאם לשימוש הסופי. ניתן להגדיל עוד יותר את קצב סינתזת החלבון על ידי ריכוז ה- lysate באמצעות רכזי ספין סטנדרטיים. ניתן להגן על דנ"א ליניארי מפני השפלה על ידי הוספת חלבון GamS מטוהר. השפלת חלבונים, הכרחית לדינמיקת מעגלים מורכבת יותר כגון תנודה, ניתן להשיג על ידי הבעת הקסאמר ClpX בזן13המייצר באופן אוטומטי . לבסוף, קריאות חזותיות מבוססות LacZ מופעלות באמצעות זן autolysate חסר lacZ. בסך הכל, שיטה זו מייצרת ליסאט פעיל מאוד ללא תאים המתאים למגוון רחב של יישומים.

<table><tbody><tr><td>מדיה 2xYT</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי, חתך 3 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>אופציונלי, ניתן להשתמש לריכוז ליזאט, בחירת קיבולת רכז המתאימה לנפח שיש לרכז</td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A0166-5G</td><td>או קרבניצילין, גרסה יציבה יותר</td></tr><tr><td>של ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>CTP</td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>D-גלוקוז (דקסטרוז)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) הנושא pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) &Delta; lacZ הנושא pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פולינית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>GTP</td><td>United States Biosciences</td><td>16800</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>או</td></tr><tr><td>מדיה שווה ערך LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446075</td> או <td></td></tr><tr><td>מגנזיום גלוטמט</td> <td>שווה ערךSigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>אשלגן גלוטמט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>להתאמת pH</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>או</td></tr><tr><td>תערובת tRNA</td> שווה ערך <td>Roche</td><td>10109541001</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>UTP</td><td>United States Biosciences</td><td>23160</td><td>או שווה ערך</td></tr></tbody></table>

ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

ביטוי גנים ללא תאים מציע את כוחה של הביולוגיה ללא סיבוכים של אורגניזם חי. למרות שקיימות מערכות ביטוי גנים רבות כאלה, רובן יקרות למדי לקנייה ו/או לדרוש ציוד מיוחד ומומחיות מושחזת דק כדי לייצר ביעילות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור ליסאט נטול תאים חיידקי התומך ברמות גבוהות של ביטוי גנים, תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי בלבד ודורש עיבוד מינימלי. השיטה משתמשת בזן קולי Escherichia המייצר אנדוליסין שאינו משפיע על הצמיחה, אך מייצר ביעילות גלולה של תאים שנקטפו לאחר מחזור פשוט של הפשרת הקפאה. העיבוד הנוסף היחיד הנדרש הוא דגירה קצרה ואחריה צנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת הסלולר. מעגלי גנים דינמיים יכולים להיות מושגים באמצעות ביטוי הטרולוגי של פרוטאז ClpX בתאים לפני הקציר. זן E. coli חסר הגן lacZ יכול לשמש עבור רגישות גבוהה, יישומי biosensing ללא תאים באמצעות קריאה צבעונית או פלואורסצנטית. הפרוטוקול כולו דורש מעט כמו 8-9 שעות, עם רק 1-2 שעות של עבודה מעשית מחיסון להשלמה. על ידי הפחתת העלות והזמן כדי לקבל lysate ללא תאים, שיטה זו צריכה להגדיל את המחיר הזול של ביטוי גנים ללא תאים עבור יישומים שונים.

ניתן לראות תוצאות מייצגות באמצעות autolysate כדי לבטא GFP מתוך פלסמיד מבטא באופן מרכיב, כאן pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, והקלטת קורס זמן של פלואורסצנטיות GFP בקורא לוחות(איור 1B). סדרת דילול של דנ"א פלסמיד מצאה ביטוי חזק אפילו בדנ"א של 1 ננומטר. בהשוואה ליסאט זמין מסחרית, autolysate יכול לייצר תשואה כוללת גדולה יותר והשיג שיעור ייצור מקסימלי גדול יותר, מחושב כנגזרת הזמן של קורס הזמן GFP (איור 1C,D). לקבלת תוצאות נוספות בשיטה זו, ראה דידוביק...

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה לייצור ליסאט חיידקי לביטוי גנים ללא תאים, באמצעות זן מהונדס של Escherichia coli ודורש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לייצר ליסאטים תאי חיידקיים באיכות גבוהה באמצעות ציוד מעבדה משותף זמין רק באופן נרחב, מה שהופך ביטוי גנים ללא תאים נגיש בקלות לרוב החוקרים. שילוב של אוטוליזה תאית של תוכנית עם מחזור הפשרה או ייבוש בהקפאה מאפשר ליצור גישה מעשית, עבודה וחסכונית לייצור מהיר של ליסאטים חיידקיים לביטוי גנים ללא תאים. התחל על ידי שימוש בלולאת חיסון כדי פס התאים של זן E.coli autolysis על לוחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ולאחר מכן לדגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה.למחרת, באמצעות קצה פיפטה, לבחור מושבה אחת מצלחת אגר ולהוסיף אותו לתוך צינור תרבות המכיל LB בינוני עם אמפיצלין. לגדל את תרבות המתנע הזה ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, להוסיף 400 microliters של התרבות המתנע לתוך בקבוקון Erlenmeyer ליטר אחד המכיל 400 מיליליטר של 2xYTPG בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפצילין.לדגור על התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 300 סל"ד. באמצעות ספקטרופוטומטר וקובט אופטי עם אורך נתיב של סנטימטר אחד, מודדים מעת לעת את הצפיפות האופטית של התרבות ב-600 ננומטר. כאשר הצפיפות האופטית עולה על אחת, התחל לדלל את התרבות פי חמישה לפני המדידות כדי להבטיח שהמדידות יישארו בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר מעבדה טיפוסי.ברגע שהצפיפות האופטית של התרבות מדוללת פי חמישה מגיעה ל-0.3, הסירו את הבקבוק מהחממה והמשיכו להכין את הלסאט. כדי להכין את lysate, לקצור את התאים על ידי centrifugation ב 1, 800 x g במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. יוצקים את supernatant ולהסיר את הנוזל הנותר באמצעות pipette.מוסיפים 45 מיליליטר של חוצץ S30A קר לכדור ו resuspend הכדור על ידי מערבולת. לאחר מכן, לשקול צינור צנטריפוגה ריק 50 מיליליטר לפני העברת התאים לתוך הצינור. צנטריפוגה התאים שוב ולהשליך את supernatant.שאפו כל סופר-טבעי שנותר באמצעות פיפטה. שקול את הצינור שוב ולהפחית את המשקל של הצינור הריק מן המשקל המוצג כדי לקבל את המשקל של הכדור. על כל מיליגרם אחד של גלולה תא, להוסיף שני microliters של חוצץ S30A קר בתוספת שני מילימולרים dithiothreitol.לאחר מכן, תקיף מחדש את התאים על ידי מערבולת נמרצת. לאחר מכן, להקפיא את התאים על ידי הצבתם מינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא עד הכדור קפוא ביסודיות, ולאחר מכן להפשיר את התאים באמבט מים בטמפרטורת החדר מערבולת במרץ במשך שתיים עד שלוש דקות. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם רועד ב 300 סל"ד, ולאחר מכן לנקות את המדגם של פסולת תאית כבדה על ידי צנטריפוגה בצינורות צנטריפוגות שקופים ב 30, 000 x g במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות להעביר את supernatant לצינור חדש עם pipette, דואג לא להפריע את הכדור. אם supernatant מועבר מזוהם עם חומר מן הכדור, לחזור על צנטריפוגה. מעבירים את הסופר-נט לצינורות צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר.וצנטריפוגה פעם נוספת ב 21, 000 x g או המהירות המרבית של צנטריפוגה שולחן במשך חמש דקות. Aliquot autolysate אוטומטי לתוך כרכים הרצויים ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד השימוש. לביטוי גנים ללא תאים באמצעות autolysate, לערבב שמונה microliters של autolysate ו 8.9 microliters של מראש לערבב על קרח.הוסף DNA לריכוז סופי של שמונה ננומולים, כל ריאגנטים ומים נחוצים אחרים כדי להשיג נפח סופי של 20 מיקרוליטרים. הוסף את התגובה למיקרו-לוחית בעלת 384 באר והשתמש בקורא לוחות כדי למדוד את מסלול הזמן והנקודות הקצה של הפלואורסצנטיות. ביטוי GFP באמצעות autolysate עם סדרת דילול של DNA פלזמה תוצאות ביטוי חזק אפילו עם DNA ננומולרי אחד.בעת השוואת ביטוי GFP בין ליסייט זמין מסחרית ואת autolysate, autolysate המיוצר רמות דומות של GFP. השונות בין קבוצות של ליסאט המיוצר בשתי מעבדות שונות על ידי חוקרים שונים היה בתוך בערך פי שניים. שלושת המשתנים הקריטיים ביותר הם יחס גלולה עד חיץ של תאים, העברת סופר-נט ללא פסולת ושימוש בריכוז PEG ומגנזיום אופטימלי בתגובה הסופית.לאחר שהתמצית הוכנה, ניתן להשתמש בארסנל גדול של פרוטוקולים קיימים שפותחו עבור מערכות ביטוי חופש תא E.coli, כגון השפלה בתיווך ClpXP, או חישת מניין בתיווך AHL.

rapid-affordable-uncomplicated-production-bacterial-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

מקור: Wiegand, D. J., et al. ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות החיידק Vibrio natriegens הגדל במהירות. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את השימוש במערכת ביטוי חלבון נטולת תאים חיידקית המבוססת על Vibrio natriegens ליזאט גולמי לביצוע שעתוק ותרגום משולבים במבחנה. הוא מדגיש את הכנת תערובת המאסטר עם רכיבים חיוניים ואת הסינתזה שלב אחר שלב של חלבונים פונקציונליים מתבנית DNA.

ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות תמצית תאים גולמיים חיידקים

פרוטוקול זה מפרט את השלבים, ' עלויות ' הציוד הנדרש לייצר e. coli-המבוסס על תמציות תא וליישם במבחנה תגובות סינתזת חלבון תוך 4 ימים או פחות. למנף את אופי גמיש הפלטפורמה עבור יישומים רחב, נדון תנאי ריאקציה, כי ניתן להתאים אופטימיזציה.

Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

מערכות ללא תא ביטוי הן כלי עוצמתי וחסכוני עבור תפוקה גבוהה סינתזה ו ההקרנה של חלבונים חשובים. כאן, אנו מתארים את הכנת המערכת ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות ויבריו natriegens לייצור חלבון המהירה באמצעות פלסמיד DNA DNA ליניארי, תבנית ה-mRNA.

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

אנו מציגים שיטה מהירה וחסכונית לייצור מערכת TX-TL נטולת תאים PURE רקומביננטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

מערכת ללא תאים טהורים של OnePot

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

עבודה זו מתארת את הכנת תמצית התאים מ-Escherichia coli (E. coli) ולאחר מכן תגובות של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) תוך פחות מ-24 שעות. הסבר על פרוטוקול אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI) מפרט שיפורים שנעשו כדי להפחית את הפיקוח על החוקרים ולהגדיל את כמויות תמצית התאים המתקבלות.

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

תמצית לישמניה תרגומית (LTE) היא מערכת ביטוי חלבונים אאוקריוטית נטולת תאים שמקורה בטפיל חד-תאי, Leishmania tarentolae. פרוטוקול ממוטב זה הופך את LTE לפשוט וחסכוני לייצור. הוא מתאים ליישומים שונים המתמקדים בביטוי רב-מקבילי ולימוד של חלבונים איקריוטים מורכבים והאינטראקציות ביניהם.

ייצור ואופטימיזציה של LTE, מערכת ביטוי חלבונים ללא תאים המופקת מלישמניה טרנטולאי לייצור חלבונים רקומביננטיים

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

אנו מציגים פרוטוקול מעודכן לייצור מערכת OnePot 'סינתזת חלבון באמצעות אלמנטים רקומביננטיים' (PURE) וריבוזומים גולמיים לסינתזת חלבון נטול תאים, תוך התמקדות בשליטה על צמיחת התאים כדי למזער שינויים בין אצווה לאצווה.

חידוד של OnePot PURE וייצור ריבוזום גולמי לסינתזה של חלבון ללא תאים הניתנת לשחזור

למד שיטה פשוטה לייצור ליסאט חיידקי באיכות גבוהה מזן Escherichia coli מונדס אוטוליזיס. הפרוטוקול מאפשר ביטוי גנים ללא תאים במעבדות סטנדרטיות בקלות ובמהירות.

ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

גלה סרטונים נוספים