Name: זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: למד שיטה אוטומטית לזיהוי דבקות חיידקית בתאים מארחים באמצעות תיוג פלואורסצנטי וניתוח סטטיסטי. שיטה זו מקצרת משמעותית את זמן העבודה ומספקת תוצאות ברות-השחזור במחקר אינטראקציות פתוגן-מארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר קייט זלוטוקובסקי מ-Biotek Inc. על תמיכתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה תחת חוזה מספר W911NF1920013 ל- PdF, הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה (DARPA) ומשרד הפנים תחת חוזה מס '140D6319C0029 ל- PdF. תוכן המידע אינו משקף בהכרח את עמדת הממשלה או את מדיניותה, ואין להסיק כל אישור רשמי.

1. תרבית תאים A549
<ol><li>לשמור על קו התא A549 ב F-12K בינוני בתוספת עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ודגרה ב 37 °C (5°F), 5% CO2.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל 3-4 ימים ועבר ב 85%-95% השפעה.</li>
	<li>בקצרה, לשטוף את התאים עם 1 x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4, אלא אם צוין אחרת) ולטפל עם 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין-0.53 mM חומצה אתילנדימינטראטראצטית (EDTA) פתרון (שקוע שכבת התא) במשך כ 2 דקות ב 37 °C .C.</li>
	<li>הוסף 6 מ"ל נוספים של מדיום צמיחה מלא (F-12K בינוני + 10% FBS) כדי לעצור את פעילות הפרוטאז. לאחר מכן, צלחת התאים בפוליסטירן סטרילי T-75 רקמה תרבית בקבוקון ביחס תת-קטיביציה של 1:3-1:8. הכרך הסופי של התרבות הוא 12 מ"ל.</li>
	<li>זרע כ 1 x 104 תאי A549 (ריכוז תאים: ~ 1 x 105 תאים / מ"ל) על כל באר של צלחת 96 באר יום לפני דבקות.</li>
</ol>2. צמיחה והכתמה חיידקית
<ol><li>בצע את כל עבודת החיידקים בקבינט בטיחות ביולוגית, מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2.</li>
	<li>לחסן את כל תרביות החיידקים, כולל P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes, ו- B. subtilis, וכו ', ממלאי הגליצריל הקפוא ולגדל אותם במרק סויה טריפטי (TSB, 3 מ"ל) באינקובטור רועד ב 37 °C בלילה נשמר ב 250 סל"ד.</li>
	<li>למחרת, להשתמש 1:100 דילול של תרבות הלילה כדי לחסן תת תרבות ולהגדיל אותם TSB (1 מ"ל) עבור 3 שעות לשלב המעריכי, למדוד את OD ב 600 ננומטר (OD600)כדי לאשר. ודא כי OD600 הוא בטווח של 0.4-0.6.
</li>
	<li>לפני ביצוע בדיקת דבקות מארח חיידקים, צלחת דילול סדרתי של השעיית חיידקים על לוחות TSB-אגר, לדגור אותם לילה ב 37 °C (50 °F), ולאחר מכן להקים את CFUs חיידקי ממספר המושבות. עבור P. aeruginosa, OD600 של 1.0 מתאים 2 x 108 תאים חיידקיים קיימא / מ"ל, ועל L. monocytogenes, OD600 של 1.0 מתאים 9 x 108 תאים חיידקיים קיימא / מ"ל.</li>
	<li>לקצור את תרביות החיידקים בשלב מעריכי על ידי צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן לשטוף אותם פעם אחת באמצעות 1x PBS (1 מ"ל). Resuspend כדורי חיידקים ב 1 מ"ל של 1x PBS ולקבוע את הריכוזים על ידי מדידת OD600 של השעיות חיידקים. לדוגמה, P. aeruginosa עם OD600 של 0.5 מייצג ריכוז של 1 x 108 תאים חיידקיים / מ"ל.</li>
	<li>מכתימים את ההשעיה החיידקית באמצעות צבע פלואורסצנטי ירוק או אדום ב- RT למשך 30 דקות עם סיבוב עדין בחושך. בשביל זה, להוסיף 2 μL של 500-קיפול מרוכז מלאי כתמים צבע לתוך 1 מ"ל של השעיה חיידקית כדי לדלל את הצבע פי 1. כדי לשטוף את צבע הכתמים, צנטריפוגה החיידקים מוכתמים ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות ו resuspend הכדור ב 1 מ"ל של 1x PBS במשך שלוש פעמים. הערה: אם פלואורסצנטיות - (GFP-, RFP-, mCherry-, וכו ') חיידקים מתויגים משמשים בניסוי, אז לדלג על שלב זה כתם חיידקי. GFP- מתויג P. aeruginosa ו צביעה פלואורסצנטית אדומה מוכתמת L. מונוציטוגנים שימשו בפרוטוקול זה.</li>
	<li>לאסוף את תאי החיידקים המוכתמים או חיידקים מתויג GFP על ידי צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות. יש תחודשו ב-F-12K בינוני טרי (1 מ"ל) ותמדדו את ה-OD600 של כל תרבות. לאחר מכן לדלל את התרבויות לריכוזים הרצויים בהתבסס על ריבוי הזיהום (MOI) וריכוז התא המארח. הכרך הסופי המשמש בניסוי זה הוא 500 μL. הערה: לדוגמה, אם ריכוז התא המארח שנספר באמצעות מכתים כחול טריפאן הוא 1 x 105 תאים / מ"ל, הריכוז הרצוי של תאים חיידקיים ב- MOI של 100 יהיה 1 x 107 תאים / מ"ל. ריכוז P. aeruginosa ב 0.5 OD600 הוא 1 x 108/mL. כדי להשיג את הריכוז הרצוי, לדלל את P. aeruginosa תרבות פי 10, להוסיף 50 μL של תרבות resuspended כדי 450 μL של בינוני F-12K טרי.</li>
</ol>3. דבקות חיידקית והכתמת תאים מארחים
<ol><li>ראשית, לשטוף את המונו-שכבתים של תאי A549 זרע שלוש פעמים עם PBS חם 1x. עבור כל שטיפה, להוסיף 100 μL של 1x PBS לכל באר, בעדינות pipette למעלה ולמטה שלוש פעמים, להיפטר 1x PBS או לחכות 10 s לאחר תוספת ולאחר מכן ואקום כדי להסיר 1x PBS. כדי לקבוע את הקינטיקה של אסוציאציה חיידקית, לכסות את התאים עם 100 μL של ריכוזים הרצויים של השעיה חיידקית עם MOIs שונים (0, 1, 10, ו 100). ספין את החיידקים ב 200 x g במשך 10 דקות ודגורת תאי A549 נגועים ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 עבור שעה אחת נוספת. הערה: בניסוי זה, לכל תנאי היה טריפליקט טכני.</li>
	<li>הסר את החיידקים הלא מאוגדים על ידי שטיפת המונו-שכבתיות חמש פעמים עם PBS חם 1x כמתואר לעיל. הוסף 100 μL של 4% פורמלדהיד (ב 1x PBS) לתוך כל באר של לוחות 96-well כדי לתקן את התאים. תן את הצלחות לשבת על קרח במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף את פתרון הקיבעון באמצעות 1x PBS שלוש פעמים.</li>
	<li>כדי להכתים את הגרעינים, להוסיף 50 ננוגרם / מ"ל של 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ודגרה זה במשך 10 דקות ב RT. לאחר הדגירה, לשטוף את הבארות שלוש פעמים באמצעות 1x PBS. לכסות את תאי A549 נגועים עם 100 μL של 1x PBS כדי למנוע ייבוש. מעבד לשלב הבא או לאחסן את הצלחת ב 4 °C (5 °F) עד 2 ימים בחושך.</li>
</ol>4. הדמיה, עיבוד וניתוח פלואורסצנטיות אוטומטיים
<ol><li>כדי לשמור על שלמות הנתונים, בחר באופן אקראי ובאופן ידני חמישה מיקומים של כל באר כדי ללכוד את התמונות בהגדלה של פי 20. ללכוד את התמונות הפלואורסצנטיות של תאי A549 וחיידקים תחת ערוצי DAPI ו- GFP, בהתאמה. השתמש בערוץ PE-Cy5 עבור החיידקים מוכתמים על ידי צבע פלואורסצנטי אדום.</li>
	<li>כדי לקבל רזולוציה טובה יותר, לעבד את כל התמונות עבור שיטוח רקע ופירוק. הגדר את הפרמטרים כקוטר 68 מיקרומטר של הכדור המתגלגל להחלקת ומדידת אוטומטית של פונקציית התפשטות הנקודות (PSF) של דה-וולבולציה של תמונה בהתבסס על המטרה.</li>
	<li>כדי לספור את כל התאים והחיידקים המוסמכים, למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים המארחים והחיידקים ולהגדיר את עוצמת הפלואורסצנטיות החלשה ביותר של תאים וחיידקים מארחים כסף לספירת התאים. לספור את כל החיידקים קרוב לתא מארח בתוך 15 מיקרומטר מרחק כמו חיידקים דבק כמו הקוטר של תא A549 הוא 10.59-14.93 מיקרומטר21. הערה: הגדרת ברירת מחדל במערכת ההדמיה סופרת באופן סלקטיבי את התאים המארחים עם קטרים הנעים בין 5-100 מיקרומטר וחיידקים הנעים בין 0.2-5 מיקרומטר בגודל (רוחב ואורך).</li>
	<li>בהתבסס על תוצאות עיבוד התמונה הידניות שהוזכרו לעיל, החל את הפרמטרים של החלקת תמונה, דה-אבון-וולטינג, גדלי אובייקטים, מרחק ועוצמות פלואורסצנטיות לשאר התמונות האוטומטיות. לאחר הניתוח האוטומטי, שקול קריאות קריטיות, כגון ספירת תאים מארחים כוללת, גדלי תאים וצורות, ספירת חיידקים כוללת, וספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח, שהיה האינדיקטור החשוב ביותר, כדי לקבוע דבקות חיידקית.</li>
	<li>ייצוא נתונים וניתוח סטטיסטי<ol>
<li>יצא את התוצאות שנותחו מכל התמונות לגיליון אלקטרוני (למשל, תבנית 'xlsx'). המערכת האוטומטית מייצרת שתי קבוצות של תוצאות: 1) ספירת החיידקים החסידית הממוצעת מכל תמונה; 2) הנתונים האינפורמטיביים של כל תא מארח יחיד, כגון ספירת חיידקים חסידים על תא בודד, גודל המארח ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של התא המארח והחיידקים, מהתמונה המתאימה.</li>
		<li>חשב את המספר הממוצע ואת סטיית התקן של ספירת חיידקים חסידים מכל התמונות כדי לייצג את רמת הדבקות החיידקית בהשוואה לבקרות שליליות. בשיטה זו, E. coli ו- B. subtilis שימשו בקרות שליליות בבדיקת דבקות חיידקית גראם שלילית וסבתא חיובית, בהתאמה. בצע ANOVAs דו-כיווני כדי לבדוק שונות משמעותית בין נקודות נתונים על פני טיפול עבור שלושה ניסויים עצמאיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+and+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion and entry into host cells.</a> Cell. 124, 715-727 (2006).</li>
<li>Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mechanisms+of+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22M%C3%A9decine+et+Maladies+Infectieuses%22%5BJournal%5D)">Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).</li>
<li>Josse, J., Laurent, F., Diot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+adhesion+and+host+cell+invasion%3A+Fibronectin-binding+and+other+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2433(2017).</li>
<li>Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+in+patients+with+a+normal+or+abnormal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver.</a> Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).</li>
<li>Ortiz-Prado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+molecular%2C+and+epidemiological+characterization+of+the+SARS-CoV-2+virus+and+the+Coronavirus+Disease+2019+%28COVID-19%29%2C+a+comprehensive+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094(2020).</li>
<li>Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acute+pulmonary+coccidioidomycosis+coinfection+in+a+patient+presenting+with+multifocal+pneumonia+with+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine+High+Impact+Case+Reports%22%5BJournal%5D)">An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19.</a> Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).</li>
<li>Woo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+inhibit+epithelial+pathogen+adherence+by+epigenetically+regulating+C-type+lectin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression.</a> Frontiers in Immunology. 10, 928(2019).</li>
<li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+host+kinase+signaling+in+response+to+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection.</a> Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+fungal+hyaluronic+acid+and+host+CD44+promote+internalization+by+recruiting+host+autophagy+proteins+to+forming+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes.</a> iScience. 24 (3), 102192(2021).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screen+of+endoplasmic+reticulum-associated+host+factors+reveals+a+role+for+IRE1alpha+in+supporting+Brucella+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110(2008).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+host+factors+that+mediate+the+intracellular+lifestyle+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078(2011).</li>
<li>Qin, Q. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tractable+Drosophila+cell+system+enables+rapid+identification+of+Acinetobacter+baumannii+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240(2020).</li>
<li>Pandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+host+IRE1%CE%B1-dependent+signaling+axis+contributes+the+intracellular+parasitism+of+Brucella+melitensis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103(2018).</li>
<li>Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Pseudomonas+aeruginosa+with+A549+pneumocyte+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells.</a> Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).</li>
<li>Götz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+bacterial+infections+by+sphingolipid+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy.</a> Nature Communications. 11, 6173(2020).</li>
<li>Lim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+resolved+imaging+of+bacteria+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy.</a> PLOS Biology. 17 (10), 3000268(2019).</li>
<li>Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Imaging+of+bacterial+cells+for+accurate+cellular+representations+and+precise+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60350(2019).</li>
<li>Hoffmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantification+of+bacterial-cell+interactions+using+virtual+colony+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43(2018).</li>
<li>Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259(2012).</li>
<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).</li>
<li>Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphometrical+analysis+on+the+ultrastructure+of+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+Journal+of+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells.</a> Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).</li>
<li>Farinha, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+pilin+adhesin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO+results+in+normal+pilus+biogenesis+but+a+loss+of+adherence+to+human+pneumocyte+cells+and+decreased+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice.</a> Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).</li>
<li>Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+LpeA%2C+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li>
<li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li>
</ol>

לכל המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

הפרוטוקול מתאר גישה אוטומטית לספירת התקשרות חיידקית לתאים מארחים. לגישה המתוארת יש כמה יתרונות אטרקטיביים על פני שיטות קונבנציונליות. ראשית, גישה זו מאפשרת כימות מדויק של מספר תאי הפתוגן המיקרוביאליים המחוברים לתאים מארחים בודדים. חשוב לציין, כימות זה יכול להתבצע ללא צורך בקציר חיידקים מייגע, דילול סדרתי, ציפוי על מדיה מוצקה, וקביעה של CFUs10,11,12. ככזה, הטכניקה המתוארת מפחיתה את עומס העבודה הכולל הנדרש כדי לכמת דבקות חיידקית. ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

הידבקות חיידקית היא תהליך לפיו חיידקים מתחברים לתאים או למשטחים אחרים. הקמה מוצלחת של זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים דורשת הידבקות לתאים מארחים, קולוניזציה של רקמות, ובמקרים מסוימים, פלישה לתאים מארחים1,2,3. מחלות זיהומיות מתפתחות מהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, כפי שמעידת מגפת COVID-19 האחרונה4,5,6. חשוב לציין, פתוגנים חדשים או מתעוררים לא ניתן להבחין בקלות באמצעות גישות מבוססות גנומיות, במיוחד במקרים שבהם הפתוגן תוכנן להתחמק מזיהוי או אינו מכיל חתימות גנומיות המזהות אותו פתוגניים. לכן, זיהוי של פתוגנים פוטנציאליים באמצעות שיטות המעריכות ישירות סימני היכר של פתוגניות, כמו דבקות חיידקית בתאים מארחים, יכול לשחק תפקיד קריטי בזיהוי פתוגן.
דבקות חיידקית לתאים מארחים שימשה להערכת מנגנונים של פתוגנזה חיידקית במשךעשרות שנים 1,7. הדמיה מיקרוסקופית8,9 והספירה של יחידת יצירת מושבה חיידקית (CFU)10,11,12,13 על ידי ציפוי לאחר זיהום הן שתי שיטות מעבדה מפותחות לבדיקת דבקות מיקרוביאלית ו / או זיהום של תאים מארחים14. בהתחשב בגודל קנה המידה של תאי החיידקים, חלוקת תאי החיידקים החסידים דורשת בדרך כלל שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות בהגדלה גבוהה, כמו גם בגישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כולל מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה הרחבה (ExM)15,16והדמיה תלת ממדית17 . לחלופין, ספירת חיידקים הקשורים או מופנמים בתוך תאים מארחים יכולה להתבצע על ידי ציפוי סדרת הדילול של חיידקים שנקטפו על אגר מוצק וספירת CFUs10,12,13. שיטה זו היא מייגע וכוללת צעדים ידניים רבים, אשר מציג קשיים בקביעת הליך סטנדרטי או אוטומטי הנדרש לניתוחים בעלי תפוקה גבוהה18,19. לכן, פיתוח שיטות חדשות להערכת קובץ מצורף לתא מארח יטפל במגבלות הנוכחיות בשדה.
שיטה אחת כזו מתוארת כאן המשתמשת במיקרוסקופיה אוטומטית של תפוקה גבוהה, בשילוב עם עיבוד תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי. כדי להדגים את הגישה, בוצעו ניסויים עם מספר פתוגנים חיידקיים, כולל פסאודומונס ארוגינוזה, פתוגן חיידקי גרם שלילי אופורטוניסטי של בני אדם, בעלי חיים וצמחים14,20, אשר נמצא לעתים קרובות ליישב את דרכי הנשימה של חולים עם תפקודי הגנה מארח לקוי. גישה זו מיטבה את תהליך ההדמיה המיקרוסקופית המתוארת במחקרים קודמים14,20. זיהוי ההדמיה היה פשוט יותר על ידי תאים מארחים ובקטריה המסומנים על ידי פלואורסצנטיות כדי לעקוב במהירות אחר הקרבה שלהם, מה שהפחית באופן דרמטי את עומס העבודה של המיקרוסקופיה כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה עבור חיידקים ייחודיים. בנוסף, הניתוח הסטטיסטי האוטומטי של תמונות בספירת תאים מארחים וחיידקים החליף את הניסוי הידני של ציפוי CFU חיידקי כדי להעריך את היחס בין ספירת חיידקים חסידים לתא מארח. כדי לאשר את התאימות של שיטה זו, זנים חיידקיים מרובים וסוגי תאים מארחים נבדקו גם, כמו ליסטריה מונוציטוגנים, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, ו Klebsiella דלקת ריאות, כמו גם תאי אנדותל וריד הטבור האנושי (HUVECs), והתוצאות תומכות במגוון וביעילות של השיטה.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>VWR</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td>צבע צביעת תא מארח</td></tr><tr><td>96 צלחת באר</td><td>קורנינג</td><td>3882</td><td>חצי שטח באר, תחתית שטוחה שקופה</td></tr><tr><td>תאי A549</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL 185</td><td>קו תאי יונקים</td></tr><tr><td>BactoView ביוטיום אדום חי</td><td></td><td>40101</td><td>חיידקים צנטריפוגה</td></tr> צבע <tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE גשש חלוקת תאים</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>קורא רב-מצבי הדמיה תאית</td></tr><tr><td>מלאי מעבדה של אי קולי</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGM bulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>HUVEC תרבית תאים מדיום</td></tr><tr><td>EHEC</td><td></td><td></td><td>NIST אוספים</td></tr><tr><td>F-12k בינוני</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>302004</td><td>A549 מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>קורנינג</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>מלאי מעבדה&nbsp;</td></tr><tr><td>L. monocytogenes</td><td></td><td></td><td>אוספי NIST</td></tr><tr><td>OD600 דילופוטומטר</td><td>IMPLEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa</td> מלאי מעבדה <td></td><td></td><td>של ד"ר לורי בורוז</td></tr><tr><td>P. aeruginosa ודלתא; pilA,</td><td></td><td></td><td>מלאי מעבדה של ד"ר לורי בורוז,</td></tr><tr><td>S. agalactiae,</td><td></td><td></td><td>אוספי NIST,</td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>, BEI</td><td>NR-46543</td><td></td></tr>, <tr><td>S. aureus ודלתא; saeR</td><td>BEI</td><td>NR-48164</td><td></td></tr><tr><td>אוספי S. rubidaea</td><td></td><td></td><td>NIST</td></tr><tr><td>מרק סויה טיפוסי</td><td>Growcells</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

זיהוי של פתוגנים חיידקיים מתעוררים הוא קריטי לבריאות וביטחון האדם. דבקות חיידקית בתאים מארחים היא צעד חיוני בזיהומים חיידקיים ומהווה סימן היכר של איום פוטנציאלי. לכן, בחינת דבקותם של חיידקים לתאים מארחים יכולה לשמש כמרכיב של הערכת איום חיידקי. שיטה סטנדרטית לספירת דבקות חיידקית לתאים מארחים היא להדגיר יחד חיידקים עם תאים מארחים, לקצור את החיידקים החסידים, צלחת התאים שנקטפו על מדיה מוצקה, ולאחר מכן לספור את המושבה שנוצרת יחידות יוצרות (CFU). לחלופין, דבקות חיידקית בתאים מארחים ניתן להעריך באמצעות גישות מבוססות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. עם זאת, אסטרטגיות קונבנציונליות ליישום גישות אלה גוזלות זמן ולא יעילות. כאן, פותחה לאחרונה שיטת הדמיה אוטומטית המבוססת על מיקרוסקופיה. בשילוב עם עיבוד תמונה בעל תפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי, השיטה מאפשרת כימות מהיר של חיידקים הנצמדים לתאים מארחים. שני מינים חיידקיים, פסאודומונס ארוגינוזה גרם-חיובי מונוציטוגנים ופקדים שליליים תואמים, נבדקו כדי להדגים את הפרוטוקול. התוצאות מראות כי גישה זו מהווה נדבך במהירות ובדייקנות ומצטרפת באופן משמעותי את עומסי העבודה וצירי הזמן הניסיוניים.

כדי לפתח את בדיקת דבקות חיידקית מבוססת הדמיית פלואורסצנטיות, זן P. aeruginosa PAO1 ומקבילו לדבקות שלילית E. coli שימשו לבדיקת יעילות הפרוטוקול, כמו הדבקות של חיידקים אלה לתאי A549 דווח14,20,22. ראשית, GFP - שכותרתו P. aeruginosa (PAO1) ו- GFP שכותרתו E. coli היו דגירה משותפת עם קו תא אפיתל מונצח אנושי A549 ב MOIs שונים, בהתאמה. התוצאות הראו כי PAO1 דבק בתאי A549 בצורה תלוית מינון (<strong clas...

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

שיטה זו מספקת זיהוי מהיר, תפוקה גבוהה של דבקות חיידקים לתאים מארחים. בהשוואה לשיטות ה ציפוי הקונבנציונליות, זה להפחית את הזמן הידיים על הנדרש לכימות של חיידקים דבקים. טכניקה זו היא אוטומטית, חוסכת זמן ו ניתנת לשחזור רב.זה גם מיושם באופן נרחב הן על רוב התאים המארחים. שיטה זו, יש מאוד פשוטה. לניסוי הראשון, יש אופטימיזציה של התנאים כמו ריבוי הזיהום, וגם זמן הדגירה המשותפת של החיידקים המארחים.ראשית לקצור את תרביות החיידקים בשלב מעריכי על ידי צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת משטח התאים עם PBS מיליליטר אחד, resuspend פלטת החיידקים ב PBS מיליליטר אחד. לקבוע את הריכוזים של השעיה חיידקית על ידי מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר.לאחר מכן, להכתמת ההשעיה החיידקית, הוסיפו שני מיקרוליטרים של צבע הכתמים המרוכז של 500 המניות הירוק או האדום למיליליטר אחד של השעיית חיידקים כדי לדלל את הצבע קיפול אחד. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עם סיבוב עדין בחושך. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה החיידקים המוכתמים ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות ו resuspened הכדור במיליליטר אחד של PBS.לאסוף את תאי החיידקים מוכתמים על ידי צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות. resuspend הכדור במיליליטר אחד של בינוני F12 K טרי ולמדוד את הצפיפות האופטית של כל תרבות ב 600 ננומטר. לאחר מכן לדלל את התרבויות לריכוזים הרצויים בהתבסס על ריבוי הזיהום וריכוז התא המארח.עבור דבקות חיידקית Assay, לשטוף את שכבות מונו תא A549 בתרבית בעבר שלוש פעמים על ידי הוספת 100 microliters של PBS חם לכל באר בעדינות pipette למעלה ולמטה. לאחר מכן השלך PBS. לחלופין, לאחר הוספת PBS, המתן 10 שניות ולאחר מכן הסר PBS באמצעות ואקום.כדי לקבוע את הקינטיקה של אסוציאציה חיידקית, לכסות את התאים עם 100 microliters של ריכוזים הרצויים של השעיה חיידקית עם ריבוי שונה של זיהום. לסובב את החיידקים ולדגירה את תאי A549 נגועים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת נוספת. הסר את החיידקים הלא מאוגדים על ידי שטיפת שכבות מונו חמש פעמים עם PBS חם כפי שהוכח.לאחר מכן, לתקן את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 4% פורמלדהיד בכל הבארות של צלחת 96 באר על הקרח. לאחר 15 דקות, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את פתרון הקיבעון. כתם בגרעינים עם 50 ננוגרם למיליליטר כתם DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר שטיפת התאים עם PBS, לכסות את תאי A549 נגועים עם 100 microliters של PBS כדי למנוע ייבוש ולאחר מכן לאחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד יומיים בחושך או להמשיך להדמיה. כדי לשמור על שלמות הנתונים, בחר באופן אקראי ובאופן ידני חמישה מיקומים של כל באר כדי ללכוד את התמונות בהגדלה של פי 20. ללכוד את התמונות הפלואורסצנטיות של חיידקים תחת ערוצי GFP, תאי A549 תחת DAPI, ועל החיידקים מוכתמים על ידי צבע פלואורסצנטי אדום להשתמש PE Si חמש ערוץ.הגדר את הפרמטרים של הכדור המתגלגל להחלקת ומדוד אוטומטית את פונקציית התפשטות הנקודות של דה-וולוציה של תמונה בהתבסס על המטרה להשגת רזולוציה טובה יותר. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים המארחים והחיידקים. הגדר את עוצמת הפלואורסצנטיות החלשה ביותר של תאים מארחים וחיידקים כסף לספירת התאים וספור את כל החיידקים הקרובים לתא מארח במרחק של 15 מיקרומטר כחיידק הדבקות.לאחר שהתאים נספרו מכל התמונות האוטומטיות, ניתחו קריאות קריטיות, כגון ספירת תאים מארחים, גדלי תאים וצורות, ספירת חיידקים כוללת וחשבון חיידקי ממוצע לכל תא מארח, שהוא האינדיקטור החשוב ביותר לקביעת דבקות חיידקית. לאחר שעה אחת של דגירה משותפת, פסאודומונס aeruginosa זן PAO1 דבק בתאי A549 בצורה תלויה במינון. תוצאות דומות נצפו גם כאשר חיידקים חיוביים גרם ליסטריה monocytogenes ואת השליטה השלילית שלה bacillus subtilis.תמונה מייצגת של פילוח P aeruginosa חסיד מארח מדגימה את הקלות של ספירת תאים חיידקיים באמצעות פרוטוקול זה. התוצאות של הניתוחים האוטומטיים כוללות ספירת תאים חיידקיים וארחים, ספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח וגדלי תאים מארחים ואזורים המייצגים את מצב בריאות התא המארח, רמת הדבקות החיידקית ורעילות ציטו חיידקית. מלבד תאי A549, HUVECs נבדקו גם לבדיקת דבקות.Serratia rubidaea ו streptococcus agalactiae היו דבקים HUVEC, אבל לא לתאי A549, אשר מדגים את הזיהוי היעיל ואת ההתאמה של מארחים מרובים ללמוד את אינטראקציות חיידקים המארחים באמצעות שיטה זו. תאים מארחים צריכים להגיע סביב 90 עד 100% מפגש כדי למזער את דבקות החיידקים הבלתי רצויים בתחתית בארות. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנונים החדשים, אינטראקציות המזיקים המארחים.

automated-high-throughput-detection-bacterial-adherence-to-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות...

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

מקור: Stones, D. H., et al. חומרים ביומימטיים לאפיון אינטראקציות חיידקים-מארחים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השימוש בחרוזים בקטריומימטיים כדי לכמת הידבקות חיידקים לתאי אפיתל מארחים בתנאים תחרותיים. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בטיפול בתאים, ליזה שלהם וציפוי דילולים סדרתיים למדידת יחידות יוצרות מושבה.

הערכת אינטראקציות בין חיידקים לתאים מארחים באמצעות חרוזים ביומימטיים

סרטון זה מדגים את בדיקת היצמדות החיידקים להערכת היצמדות חיידקים המתויגים ב-GFP לתרבית תאי אפיתל כדי לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות מארח-פתוגן באמצעות הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

זיהוי היצמדות חיידקים לתאים מארחים באמצעות דימות פלואורסצנטי

סרטון זה מדגים צביעה והכנה של תאי חיידקים למחקרים אימונולוגיים באמצעות צבע פלואורסצנטי אדום. החיידקים המוכתמים מדוללים ומרחפים מחדש במדיום גדילה כדי להשיג את ריכוז החיידקים הרצוי לזיהום תאי המאכסן, המייצג את ריבוי הזיהום.

צביעת תאי חיידקים והכנה למחקרים אימונולוגיים

סרטון זה מדגים בדיקת היצמדות אופסונו-לבחינת האינטראקציה בין חיידקים שעברו אופסונציה לבין תאי מערכת החיסון. חיידקים המסומנים בפלואורסצנטית, מטופלים בסרום בדיקה המכיל נוגדנים נגד קפסולות, מודגרים עם מקרופאגים. לאחר צביעת המקרופאגים בפלואורסצנטיות, החיידקים המחוברים על פני המקרופאגים נצפים תחת מיקרוסקופ לצורך הדמיה.

בדיקת היצמדות אופסונו-להערכת האופסוניזציה של חיידקים עטופים על ידי נוגדנים נגד קפסולות

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

מתוארות שתי בדיקות לבדיקת תפוקה גבוהה מבוססת מיקרוסקופיה של גורמי מארח המעורבים בזיהום ברוצלה. בדיקת הכניסה מזהה גורמי מארח הנדרשים לכניסת ברוצלה ובדיקת נקודת הקצה הנדרשים לשכפול תוך תאי. בעוד שרלוונטי לגישות חלופיות, בדיקת siRNA בתאי HeLa משמשת להמחשת הפרוטוקולים.

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

הבדיקה האופסונו-דבקות היא שיטה חלופית למבצע ההרג האופוסונו-פאגוציטי כדי להעריך את הפונקציות האופסיוניות של נוגדנים בפיתוח חיסונים.

Opsono-דבקות Assay כדי להעריך נוגדנים תפקודיים בפיתוח חיסונים נגד אנתרקיס Bacillus ופתוגנים אנקפסולציה אחרים

למד שיטה אוטומטית לזיהוי דבקות חיידקית בתאים מארחים באמצעות תיוג פלואורסצנטי וניתוח סטטיסטי. שיטה זו מקצרת משמעותית את זמן העבודה ומספקת תוצאות ברות-השחזור במחקר אינטראקציות פתוגן-מארח.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

גלה סרטונים נוספים