Name: הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למד הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם באמצעות מיקרוסקופיית לייט-שיט ופרוטוקולי ניקוי רקמה. שיטה זו מאפשרת שחזור תלת-ממדי ברזולוציית מיקרומטר ללא פגיעה במבנה הרקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענקים No 952166 (תיקון), MUR במסגרת תוכנית FISR, פרויקט FISR2019_00320 ו- Regione Toscana, הצדעה לבנדו רייסרקה 2018, פרויקט PERCARE.

כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות דירקטיבה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות והתאימו לעקרונות ולתקנות של משרד הבריאות האיטלקי. פרוטוקול הניסוי אושר על ידי משרד הבריאות האיטלקי (פרוטוקול מספר 647/2015-PR). כל בעלי החיים סופקו על ידי ENVIGO, איטליה. בניסויים אלה נעשה שימוש ב-5 עכברי C57BL/6J זכרים בני 6 חודשים.
1. הכנת פתרון
<ol><li>יש להכין 4% פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח ספוגת פוספט (PBS) (pH 7.6) במכסה המנוע הכימי. אחסן את 4% PFA aliquots ב -20 °C במשך מספר חודשים.</li>
	<li>הכן תמיסת הידרוג'ל: יש לערבב 4% אקרילאמיד, 0.05% ביס-אקרילאמיד, 0.25% ייזום AV-044 ב-0.01 M PBS במכסה מנוע כימי. שמור את הריאגנטים ואת הפתרון על הקרח במהלך כל ההכנה. אחסנו את ההידרוג'ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.</li>
	<li>הכן פתרון ניקוי: לערבב 200 mM חומצה בורית, 4% נתרן דודציל-סולפט (SDS) במים deionized; pH 8.6 במכסה מנוע כימי. אחסן את התמיסה בין 21-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע משקעי SDS.</li>
	<li>הכן תמיסת טירודה טרייה ביום הניסוי: הוסף 10 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1.2 mM MgCl2, ו 4.7 mM KCl; טיטרט ל-pH 7.4 באמצעות 1 M NaOH.</li>
</ol>2. בידוד לב
<ol><li>להזריק 0.1 מ"ל של 500 I.U. הפרין תת עורית 30 דקות לפני הליך בידוד הלב.</li>
	<li>מלאו מזרק של 30 מ"ל ושלוש צלחות פטרי בקוטר 6 ס"מ בתמיסת טיירוד טרייה. יוצרים בקע קטן (3-4 מ"מ עומק) על גבול אחת מצלחות הפטרי ומניחים אותו מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופי.</li>
	<li>מקבעים צינורית בקוטר 1 מ"מ למזרק ומכניסים אותה לבקע של צלחת פטרי. ודא שאין בועות אוויר במזרק.</li>
	<li>מלאו מזרק של 20 מ"ל ב-4% PFA ושמרו אותו במכסה המנוע הכימי. הכינו צלחת פטרי ריקה מתחת למכסה המנוע.</li>
	<li>מרדימים את העכבר ב-3% איזופלורן/חמצן בקצב זרימה של 1.0 ליטר/דקה ומקריבים אותו על ידי נקע צוואר הרחם בהתאם לכללי רווחת בעלי החיים שבתוקף.</li>
	<li>לאחר ההקרבה, הסר את הפרווה מעל החזה ופתח את החזה כדי לקבל גישה מלאה ללב.</li>
	<li>לבודד את הלב, לטבול אותו בצלחת פטרי מלא בעבר עם 50 מ"ל של תמיסת טירוד. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את אבי העורקים מיד ליד קשת אבי העורקים כדי לחשוף את הלב.</li>
	<li>להעביר את הלב תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בזהירות לבצע את cannulation. אין להכניס את הצינורית עמוק מדי לאבי העורקים (לא יותר מ-2 מ"מ) כדי למנוע נזק לרקמות.</li>
	<li>השתמשו במעט מהדק ותפר (גודל 5/0) כדי לקבע את הלב לצינורית.</li>
	<li>למזג את הלב עם 30 מ"ל של תמיסת Tyrode עם לחץ קבוע של 10 מ"ל / דקה כדי להסיר דם מן כלי הדם.</li>
	<li>מנתקים את הצינורית מהמזרק ומניחים את הלב בצלחת הפטרי המלאה בתמיסת טירוד. היזהר לא יש בועות אוויר בצינורית; אחרת, הסר את בועות האוויר כראוי.</li>
	<li>חברו את מזרק ה-20 מ"ל המלא ב-4% PFA קר לצינורית והכניסו את הלב לאותו לחץ קבוע.</li>
	<li>לדגום את הלב ב 10 מ"ל של 4% PFA ב 4 מעלות צלזיוס בלילה (O / N). כדי למנוע השפלה של רקמות, בצע את שלבים 2.6-2.13 בזמן הקצר ביותר האפשרי.</li>
</ol>3. ניקוי לב
<ol><li>למחרת, לשטוף את הלב ב 0.01 M PBS 3 פעמים ב 4 °C (64 °F) במשך 15 דקות. הערה: לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS + 0.01% נתרן אזיד (NaN3) ב 4 °C במשך מספר חודשים.</li>
	<li>לדגום את הלב ב 30 מ"ל של תמיסת הידרוג'ל ברעידות (15 סל"ד) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.</li>
	<li>דגה את הדגימה בטמפרטורת החדר באמצעות מייבש, משאבת ואקום ומערכת צינורות המחברת את המייבש הן למשאבה והן לצינור חנקן.<ol><li>מניחים את הדגימה במייבש ופותחים את הבקבוקון, תוך שמירה על הפקק עליו.</li>
		<li>סגרו את המייבש והוציאו את החמצן מהצינור על ידי פתיחת צינור החנקן.</li>
		<li>הפעילו את משאבת הוואקום כדי להוציא את החמצן מהמייבש למשך 10 דקות.</li>
		<li>כבו את המשאבה והשתמשו בידית המייבש כדי לפתוח את צינור החנקן. ברגע שהלחץ שווה ללחץ האטמוספרי, פתחו בזהירות את המייבש וסגרו במהירות את הבקבוקון.</li>
	</ol></li>
	<li>שמור את הלב בתמיסת הידרוג'ל degassed ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות במנוחה.</li>
	<li>כאשר ההידרוג'ל עובר פולימריזציה נכונה ונראה ג'לטיני לחלוטין, הסר בזהירות את הלב ממנו והנח אותו במחזיק הדגימה.</li>
	<li>הכנס את מחזיק הדגימה עם הלב באחד מתאי הניקוי וסגור אותו כראוי כדי למנוע דליפות של פתרון הסליקה.</li>
	<li>הפעל את אמבט המים שבו ממוקם מיכל תמיסת הניקוי ואת המשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל את סירקולציה של פתרון הסליקה.</li>
	<li>שנה את תמיסת הסליקה במיכל פעם בשבוע כדי לזרז את הליך ההבהרה.</li>
</ol>4. מכתים את קרום התא
<ol><li>ברגע שהלב נראה מובהר לחלוטין, הסר אותו ממחזיק הדגימה ושטוף אותו ב -50 מ"ל של PBS מחומם במשך 24 שעות. יש לשטוף שוב ב-50 מ"ל של PBS + 1% של Triton-X (PBS-T 1x) למשך 24 שעות.</li>
	<li>דגירה של הדגימה ב-0.01 מ"ג/מ"ל נבט חיטה אגלוטינין (WGA) - Alexa Fluor 633 ב-3 מ"ל של PBS-T 1x ברעידות (50 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 7 ימים.</li>
	<li>לאחר הדגירה בת 7 הימים, יש לשטוף את הדגימה ב-50 מ"ל של PBS-T 1x בטמפרטורת החדר בטלטול במשך 24 שעות.</li>
	<li>לדגום את הדגימה ב 4% PFA במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו 3 פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד. הערה: לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS + 0.01% NaN3 ב 4 °C במשך מספר חודשים.</li>
	<li>לדגום את הלב בריכוזים הולכים וגדלים של 2,2′-תיומיאתנול (TDE) ב-0.01 M PBS (20% ו-47% TDE/PBS) למשך 8 שעות כל אחד, עד לריכוז הסופי של 68% TDE ב-0.01 M PBS כדי לספק את מקדם השבירה הנדרש (RI = 1.46). זהו המדיום התואם RI (RI-medium) לרכישת תמונות16.</li>
</ol>5. הרכבה ורכישה של הלב
הערה: כל רכיבי המערכת האופטית מפורטים בפירוט בטבלת החומרים.
<ol><li>מלאו בעדינות כ-80% מהקובט החיצוני (קוורץ, 45 מ"מ × 45 מ"מ × 42.5 מ"מ) במדיום RI. הערה: כאן, ניתן להשתמש בפתרונות לא נדיפים שונים המבטיחים RI של 1.46.</li>
	<li>מלאו בעדינות את הקובט הפנימי (קוורץ, 45 מ"מ × 12.5 מ"מ × 12.5 מ"מ) באותו מדיום RI.</li>
	<li>לטבול את הדגימה בתוך הקובט הפנימי. הדגירה של הדגימה שתוארה לעיל מאפשרת לדגימה להישאר יציבה בתוך מדיום ה-RI מבלי להיות מוחזקת.</li>
	<li>הזיזו בעדינות את הדגימה לתחתית הקובטה באמצעות פינצטה דקה וסדרו את הלב עם ציר האורך שלו במקביל לציר הראשי של הקובט כדי למזער את נתיב אור העירור על פני הרקמה במהלך הסריקה.</li>
	<li>תקן בעדינות את התקע המותאם מעל הקובט הפנימי באמצעות שני ברגים.</li>
	<li>הרכיבו את הדגימה לשלב המיקרוסקופ באמצעות המגנטים.</li>
	<li>תרגם את שלב הדגימה האנכי באופן ידני כדי לטבול את הקובטה הפנימית לתוך החיצונית.</li>
	<li>הפעל את מקור האור העירור (אורך גל של 638 ננומטר), הגדרת הספק נמוך (בסדר גודל של 3 mW).</li>
	<li>הזז את הדגימה באמצעות המתרגם הממונע כדי להאיר מישור פנימי של הרקמה.</li>
	<li>הפעל את תוכנת ההדמיה (HCImageLive) והגדר את ההדק של המצלמה למצב חיצוני (גיליון אור) כדי להניע את הדק הרכישה של המצלמה על-ידי התוכנה המותאמת אישית השולטת בהגדרה כולה.</li>
	<li>הפעל שמירה אוטומטית בחלונית Scan Settings והגדר את תיקיית הפלט שבה יש לשמור את התמונות.</li>
	<li>כוונן ידנית את מיקום הדגימה במישור XY עם המתרגמים הלינאריים כדי להזיז את הדגימה למרכז ה- FoV של חיישן המצלמה.</li>
	<li>הזז את הדגימה לאורך ציר Z באמצעות המתרגם הממונע הליניארי כדי לזהות גבולות לב לצורך שחזור טומוגרפי.</li>
	<li>הגדל את עוצמת הלייזר ל~20 mW, מוכן לסשן ההדמיה.</li>
	<li>התחל את הרכישה הטומוגרפית, לחץ על לחצן התחל בלוח הרצף של תוכנת ההדמיה, ובמקביל הזז את הדגימה לאורך ציר Z במהירות קבועה של 6 מיקרומטר לשנייה באמצעות המתרגם הממונע.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
<li>Bishop, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+anatomically+detailed+MRI-derived+rabbit+ventricular+model+and+assessment+of+its+impact+on+simulations+of+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).</li>
<li>Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+role+of+the+coronary+vasculature+during+external+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transaction+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation.</a> IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

בעבודה זו הוצגה גישה מוצלחת לניקוי, הכתמה ותמונה של לב עכבר שלם ברזולוציה גבוהה. ראשית, פרוטוקול טרנספורמציה של רקמות (CLARITY) עבר אופטימיזציה ובוצע, שונה מעט ליישומו על רקמת הלב. ואכן, כדי להשיג שחזור יעיל בתלת מימד של לב שלם, חיוני למנוע את תופעת פיזור האור. מתודולוגיית CLARITY מאפשרת לנו להשיג לב שלם שקוף מאוד, אך היא דורשת זמני דגירה ארוכים כאשר היא מבוצעת באופן פסיבי (כ -5 חודשים). לגבי המוח, רקמת הלב אינה מתאימה לניקוי פעיל, המנצל שדה חשמלי. גם במתחים נמוכים, השדה החשמלי מוביל לנזקים ולשברים ברקמות. כאן, גישת סליק...

שיפוץ מבני הקשור למחלות לב יכול להשפיע על ההולכה החשמלית ולהכניס תפקוד אלקטרומכני של האיבר 1,2. הגישות הנוכחיות המשמשות לחיזוי שינויים תפקודיים משתמשות בדרך כלל ב-MRI וב-DT-MRI כדי לקבל שחזור כולל של תצהיר פיברוזיס, עץ כלי דם וחלוקת סיבים של הלב, והן משמשות למודלים של נתיבי התפשטות פוטנציאלית של פעולה מועדפת (APP) על פני האיבר 3,4. אסטרטגיות אלה יכולות לספק סקירה יפה של ארגון הלב. עם זאת, הרזולוציה המרחבית שלהם אינה מספיקה כדי לחקור את ההשפעה של שיפוץ מבני על תפקוד הלב ברמה התאית.
הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה, שבו תאים בודדים יכולים למלא תפקידים בודדים על התפשטות פוטנציאל פעולה, היא מאתגרת. המגבלה העיקרית היא חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות לביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה (רזולוציה מיקרומטרית) ברקמות מסיביות (בגודל סנטימטר). למעשה, הדמיית רקמות ביולוגיות בתלת-ממד ברזולוציה גבוהה מסובכת מאוד בשל אטימות הרקמות. הגישה הנפוצה ביותר לביצוע שחזורים תלת-ממדיים באיברים שלמים היא להכין חתכים דקים. עם זאת, חיתוך, הרכבה והדמיה מדויקים דורשים מאמץ וזמן משמעותיים. גישה חלופית שאינה דורשת חיתוך הדגימה היא יצירת רקמה שקופה. במהלך השנים האחרונות, מספר מתודולוגיות להבהרת רקמות הוצעו 5,6,7,8. האתגר לייצר רקמות מסיביות, שקופות ומסומנות פלואורסצנטיות הושג לאחרונה על ידי פיתוח גישות טרנספורמציה אמיתיות של רקמות (CLARITY9, SHIELD10). בפרט, שיטת CLARITY מבוססת על הפיכת רקמה שלמה לצורה ננו-נקבובית, הידרו-היברידית, נטולת שומנים, המאפשרת להעניק שקיפות גבוהה על ידי הסרה סלקטיבית של דו-שכבתיות של שומנים בממברנה. יש לציין כי שיטה זו נמצאה מוצלחת גם בהכנה לבבית11,12,13,14. עם זאת, מכיוון שהלב שברירי מכדי להיות מתאים לניקוי אקטיבי, יש לנקות אותו באמצעות הגישה הפסיבית, הדורשת זמן רב כדי להעניק שקיפות מלאה.
בשילוב עם טכניקות הדמיה מתקדמות כמו מיקרוסקופיה של יריעות אור, ל-CLARITY יש פוטנציאל לצלם רקמות לב מסיביות בתלת-ממד ברזולוציה מיקרומטרית. במיקרוסקופיה של יריעות אור, הארת הדגימה מתבצעת עם יריעה דקה של אור המוגבלת במישור המוקד של מטרת האיתור. הפליטה הפלואורסצנטית נאספת לאורך ציר בניצב למישור התאורה15. ארכיטקטורת הגילוי דומה למיקרוסקופיית שדה רחב, מה שהופך את הרכישה למהירה הרבה יותר ממיקרוסקופים לסריקת לייזר. העברת הדגימה דרך יריעת האור מאפשרת קבלת טומוגרפיה מלאה של דגימות גדולות, עד דגימות בגודל סנטימטר. עם זאת, בשל התכונות הפנימיות של קרן גאוס, ניתן לקבל יריעת אור דקה מאוד (בסדר גודל של כמה מיקרונים) רק עבור הרחבה מרחבית מוגבלת, ובכך להגביל באופן דרסטי את שדה הראייה (FoV). לאחרונה הוצגה ערכת עירור חדשנית כדי להתגבר על מגבלה זו ולהחיל הדמיה מוחית, המאפשרת שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה איזוטרופית16.
במאמר זה מוצגת גישת סליקה פסיבית, המאפשרת הפחתה משמעותית של תזמון הסליקה הנדרש על ידי פרוטוקול CLARITY. המסגרת המתודולוגית המתוארת כאן מאפשרת לשחזר לב עכבר שלם ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת עם זמן רכישה בסדר גודל של דקות.

<table><tbody><tr><td>2-2' תיודיתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>ביו-ראד</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 יוזם</td><td>Wako כימיקלים</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>ביס-אקרילאמיד</td><td>ביו-ראד</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>המאמאטסו</td><td>אורקה פלאש 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מצלמה</td><td>Hamamatsu</td><td>HC עדשת</td> קולימציה תמונה <td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>זרוע זיהוי</td><td>אופטיקה משולבת</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>עדשת עירור</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave; nal quartz cuvette</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>מראות מתקפלות</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>מראה גלוונומטרית</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>קובטה קוורץ פנימית</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>מקור לייזר</td><td>אופטיקה משולבת</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מעבר ארוך</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>בסיס מגנטי</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר פיזיסק ממונע</td><td></td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>אובייקטיבי</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ פוספט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>עדשת ממסר Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>עדשת צינור</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>עדשה מתכווננת</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>מים אמבטיה</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

מחלות לב גנטיות ולא גנטיות יכולות לגרום לתהליכי שיפוץ חמורים בלב. שיפוץ מבני, כגון תצהיר קולגן (פיברוזיס) ואי-התאמה תאית, יכול להשפיע על ההולכה החשמלית, לגרום להפרעות אלקטרומכניות, ובסופו של דבר להוביל להפרעות קצב. מודלי החיזוי הנוכחיים של שינויים פונקציונליים אלה מבוססים על מידע מבני לא משולב וברזולוציה נמוכה. הצבת מסגרת זו בסדר גודל שונה היא מאתגרת בשל חוסר היעילות של שיטות הדמיה סטנדרטיות בביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה ברקמה מסיבית. בעבודה זו אנו מתארים מסגרת מתודולוגית המאפשרת הדמיה של לבבות עכברים שלמים ברזולוציה מיקרומטרית. השגת מטרה זו דרשה מאמץ טכנולוגי שבו שולבו התקדמות בטרנספורמציה של רקמות ובשיטות הדמיה. ראשית, אנו מתארים פרוטוקול CLARITY אופטימלי המסוגל להפוך לב שלם לצורה ננו-נקבובית, היברידית הידרוג'ל, נטולת שומנים, המאפשרת שקיפות גבוהה וכתמים עמוקים. לאחר מכן, מתואר מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי המסוגל להשיג במהירות תמונות של שדה ראייה מזוסקופי (בקנה מידה מ"מ) ברזולוציה של קנה מידה מיקרוני. בעקבות פרויקט mesoSPIM, המיקרוסקופ שהגה מאפשר שחזור של כל לב העכבר ברזולוציה מיקרומטרית בסריקה טומוגרפית אחת. אנו מאמינים כי מסגרת מתודולוגית זו תאפשר להבהיר את מעורבותם של אי-סדר הציטו-ארכיטקטורה בתפקוד החשמלי ותסלול את הדרך למודל מקיף המתחשב הן בנתונים הפונקציונליים והן בנתונים המבניים, ובכך יאפשר חקירה מאוחדת של הגורמים המבניים המובילים לשינויים חשמליים ומכניים לאחר שיפוץ הרקמה.

מערך הסליקה הפסיבית שפותח מאפשר לקבל לב עכבר בוגר מנוקה (עם ממד של הסדר 10 מ"מ x 6 מ"מ x 6 מ"מ) תוך כ -3 חודשים. כל רכיבי ההתקנה מותקנים כפי שמוצג באיור 1. שיפוע הטמפרטורה הזניח בין כל תא ניקוי (בסדר גודל של 3 מעלות צלזיוס) מאפשר שמירה על הטמפרטורה בטווח תקין בכל התאים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62795/62795fig01.jpg"> איור 1: סכימה של מערך הסליקה הפסיבית.</st...

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

מתודולוגיה זו משלבת שיפור של פרוטוקול הניקוי עם יכולת העין של חתך אופטי של טכנולוגיית Mesos PIM המאפשרת לנו לבצע שחזורים מזו סקופיים ברזולוציה מיקרומטרית. הוא מספק את האפשרות לצלם רקמות לב מסיביות או לבבות עכברים שלמים פתרון שלם בסריקה אחת מבלי לאבד את ארגון הרקמה התלת-ממדית המקורית. לאחר שהלב כבר משומר על ידי אבי העורקים הפרוקסימלי שנשטף בתמיסת טירו וקבוע ב 4% Paraform aldehyde ב 0.01 טוחנת PBS הוא מוכן להתחיל את פרוטוקול הסליקה.לשטוף את הלב שלוש פעמים ב 0.01 PBS טוחנת בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS ו 0.01% נתרן אזיד בארבע מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים. לדגום את הלב ב 20 מיליליטר של תמיסת הידרוג'ל במצב רעידות ב 15 סל"ד במשך שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס.ניתן להוריד את הגז בטמפרטורת החדר באמצעות מייבש משאבת ואקום, ומערכת צינורות המחברת את המייבש הן לרצועת המשאבה והן לצינור החנקן. הניחו את הדגימה במייבש ופתחו את הבקבוקון תוך שמירה על המכסה. סגרו את המייבש והוציאו את החמצן מהצינור על ידי פתיחת צינור החנקן.הפעילו את משאבת הוואקום כדי להוציא את החמצן מהמייבש למשך 10 דקות. כבו את המשאבה ופתחו את ידית המייבש לצינור החנקן. לאחר מכן פתחו את ברז החנקן.ברגע שהלחץ שווה ללחץ האטמוספרי פתחו בזהירות את המייבש וסגרו במהירות את הבקבוקון. שמור את הלב בתמיסת הידרוג'ל ללא גזים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כשלוש שעות במנוחה. כאשר ההידרוג'ל הוא פולימרי כראוי ונראה ג'לטיני לחלוטין, בזהירות להסיר את הלב ממנו ומניחים אותו בתמיסת ניקוי בבקבוקון עם תמיסת ניקוי.שנה את פתרון הסליקה בבקבוקון אחת לשלושה ימים כדי לזרז את הליך ההבהרה. ברגע שהלב נראה ברור לחלוטין להסיר אותו מן הבקבוקון ולשטוף אותו 50 מיליליטר של PBS מחומם במשך 24 שעות במצב רועד. יש לשטוף שוב ב-50 מיליליטר של PBS T אחד למשך 24 שעות במצב ניעור.דגירה של הדגימה ב-0.01 מיליגרם למיליליטר נבט חיטה אגלוטינין אלקסה רצפה 633 בשלושה מיליליטר של X PBS T אחד במצב רעידות ב-50 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך שבעה ימים. לאחר הדגירה בת שבעת הימים, יש לשטוף את הדגימה ב-50 מיליליטר של X PBS T אחד בטמפרטורת החדר בטלטול במשך 24 שעות. יש לדגום את הדגימה ב-4% PFA למשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותה שלוש פעמים ב-PBS טוחן 0.01 במשך חמש דקות כל אחת.לדגום את הלב ברצף ב-20 וב-47% TDE ב-0.01 PBS טוחנת במשך שמונה שעות כל אחד. ולבסוף ב 68% TDE ב 0.01 PBS טוחנות כדי לספק את מקדם השבירה הנדרש של 1.46. ממלאים בעדינות כ-80% מקובט הקוורץ החיצוני במדיום מקדם השבירה.ממלאים את קיובט הקוורץ הפנימי באותו מדיום מקדם שבירה. לטבול את הדגימה בתוך הקיווט הפנימי. הזיזו בעדינות את הדגימה לתחתית הקיובט באמצעות פינצטה דקה וסדרו את הלב עם ציר האורך שלו במקביל לציר הראשי של הקיובט כדי למזער את נתיב אור העירור על פני הרקמה במהלך הסריקה.תקן בזהירות את התקע המותאם מעל הקיובט הפנימי באמצעות שני ברגים. הרכב את הדגימה לשלב המיקרוסקופ באמצעות מגנטים. תרגם את שלב הדגימה האנכי באופן ידני כדי לטבול את הקיובט הפנימי לתוך החיצוני.הפעל את מקור האור העירור באורך גל של 638 ננומטר והגדר אותו בהספק נמוך בסדר גודל של שלושה מילי-וואט. הזז את הדגימה באמצעות המתרגם הממונע כדי להאיר צלחת פנימית של הרקמה. הפעל את תוכנת המצלמה החיה של HC image והגדר את הדק המצלמה למצב יריעת הדק בקצה החיצוני כדי להניע את הדק הרכישה של המצלמה על-ידי התוכנה המותאמת אישית השולטת בהגדרה כולה.הפעל שמירה אוטומטית בתוכנת המצלמה והגדר את תיקיית הפלט שבה יש לשמור את התמונות. כוונן ידנית את מיקום הדגימה במישור X Y עם המתרגמים הליניאריים כדי להזיז את הדגימה למרכז שדה הראייה של חיישן המצלמה. הזז את הדגימה לאורך ציר Z באמצעות המתרגם הממונע הליניארי כדי לזהות גבולות לב לצורך שחזור טומוגרפי.הגדל את עוצמת הלייזר לכ-20 מילי-וואט לפני תחילת ההדמיה. התחל את הרכישה הטומוגרפית על ידי לחיצה על כפתור התחל בלוח הלכידה של תוכנת ההדמיה, ובמקביל התחל להזיז את הדגימה לאורך ציר Z במהירות קבועה של שישה מיקרומטר לשנייה באמצעות המתרגם הממונע. השילוב של מתודולוגיית הבהירות עם TDE כמדיום מקדם שבירה אינו משנה באופן משמעותי את הנפח הסופי של המדגם ואינו מוביל לעיוות איזוטרופי של הדגימה.אופטיקת העירור ייצרה יריעת אור עם מינימום פסולת של כשישה מיקרומטרים שהתפצלה עד 175 מיקרומטר בקצה שדה הראייה. הסנכרון של תריס הגלגול של המצלמה עם הסריקה הצירית של פסולת יריעת האור הבטיח לאסוף את אות הפליטה רק בחלק הדגימה הנרגש עם הפסולת של יריעת האור וכתוצאה מכך F W H M ממוצע של כ-6.7 מיקרומטר לאורך כל שדה הראייה. פונקציית התפשטות נקודת Z של המיקרוסקופ הוערכה גם על ידי שחזור טומוגרפי של הננוספרה הפלואורסצנטית ו-F W H M של 6.4 מיקרומטר הוערך על ידי ההתאמה.הפוטנציאל של המערכת לפתור ממברנות תאיות בודדות בשלושה ממדים עם יחס אות לרעש מספיק באיבר כולו אושר גם הוא. הליך הפחתת הגזים הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול. אם זה לא מבוצע כראוי הרקמה עלולה להיתקל בנזקים המציינים במהלך הדגירה בתמיסת ניקוי.ניתן לשלב את הפרוטוקול המוצג עם פרוטוקול מרובה כתמים כדי להשיג שחזור איברים שלם המשלב מבנים ביולוגיים שונים וניתן ליישם אותו לחקר מודלים פתולוגיים.

mesoscopic-optical-imaging-of-whole-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תדירות גבוהה אולטרסאונד דופלר היא טכנולוגיה חדשנית להערכת תפקוד שריר הלב באזור. עבודה זו מציגה את העדות הראשונה הוכחת הישימות של פלטפורמה זו הדמיה תכליתי עבור למדוד את חוזרות ונשנות של מתח שריר הלב, dp / dt, ו regurgitation צניפי בלב אדום (IR) איסכמיה reperfused Murine.

בתדירות גבוהה ברזולוציה גבוהה אקו: העדות הראשונה על מדוד לא פולשני חוזרות ונשנות של הזנים Contractility שריר הלב, ו regurgitation צניפי בלב איסכמיה reperfused Murine

וידאו זה מדגים שימוש רכבת רכוב בתדירות גבוהה בדיקה אולטרסאונד לבצע אקו על העכבר בהרדמה. שיטות מתארים הן מדידות דו מימדי ו-M-mode קונבנציונלי של תפקוד הלב בנוסף, הכלים החדשים חזקים יותר כגון צבע דופלר, ניתוח המתח, כמו גם בניגוד הדמיה בכלל ממוקדות.

אקו Murine והדמיה אולטראסאונד

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

במאמר זה אנו מתארים את ההליך ניסיוני המלא לשחזר, עם רזולוציה גבוהה, האנטומיה מוח הקנס של מוח עכבר שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול המתואר כולל הכנת מדגם וסליקה, דגימת הרכבה עבור הדמיה, שלאחר עיבוד נתונים והדמיה רב היקף.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

מחקר זה מדגים את ההקמה המוצלחת של הדמיית מיקרוסקופיה תהודה מגנטית ככלי לא פולשני להערכת הפרעות לב בעכברים הסובלים מדלקת שריר הלב האוטואימונית.  הנתונים מצביעים על כך שניתן להשתמש בטכניקה כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה בבעלי חיים חיים.

הערכה לא פולשנית של לב חריגות בניסויית אוטואימוניות דלקת שריר לב על ידי תהודה מגנטית מיקרוסקופית הדמיה בעכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיפוי אופטי של פעילות חשמלית מן אטריום ימין בעכבר במיוחד צומת סין-פרוזדורים, ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן.

מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

אנו מציגים את המתודולוגיה עבור בידוד של מוציטים מורטין וכיצד להשיג מתח או סימני הסידן במקביל עם הקיצור סרקומר באמצעות מכשירי האור הפלואורסצנטית עם מדידות הגיאומטריה הדיגיטלית בו.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בהדמיית אולטרסאונד ארבע-ממדית in vivo והדמיית ספקטרומטריית מסה ex vivo כדי להעריך שינויים ביומכניים וביו-מולקולריים במערכת הלב וכלי הדם של העכברים. טכניקה זו מיושמת לניתוח שיפוץ לב באוטם שריר הלב המושרה בניתוח ושינויים בכלי הדם בבעלי חיים מזדקנים.

מחקר רב-מודאלי של שיפוץ לב וכלי דם בעכברים: אולטרסאונד ארבע-ממדי והדמיית ספקטרומטריית מסה

למד הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם באמצעות מיקרוסקופיית לייט-שיט ופרוטוקולי ניקוי רקמה. שיטה זו מאפשרת שחזור תלת-ממדי ברזולוציית מיקרומטר ללא פגיעה במבנה הרקמה.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

גלה סרטונים נוספים