Name: הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: למד הדמיה של תחומי שכפול בכרומטין באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית. השיטה משתמשת בתיוג EdU וחלקיקי Nanogold לזיהוי DNA חדש, עם שימור מבני מיטבי לתמונות ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי RSF (מענק #17-15-01290) ו- RFBR (מענק #19-015-00273). המחברים מודים לתוכנית הפיתוח של אוניברסיטת המדינה לומונוסוב מוסקבה (PNR 5.13) ולמרכז ניקון למצוינות בהדמיה קורלטיבית במכון בלוזרסקי לביולוגיה פיזיקלית-כימית על הגישה למכוני הדמיה.

הפרוטוקול מותאם לתאים דבקים ונבדק בשורות התאים HeLa, HT1080 ו- CHO.
1. תיוג וקיבעון תאים
<ol><li>תאי צלחת על כיסויים ניקוי חומצה בצלחת פטרי 3 ס"מ. הגדל את התאים במדיה המומלצים עבור קו התא המשמש למפגש של 70%.</li>
	<li>הוסף EdU (5-אתניל-2'-deoxyuridine) ממלאי 10 mM לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ומניחים את התאים באינקובטור למשך 10 דקות או יותר (בהתאם למטרת הניסוי). לפולסים קצרים יותר (עד 2 דקות), הכינו צלחת פטרי עם מדיה תרבותית טרייה שחוממה מראש בתוספת 10 מיקרומטר EdU, והעבירו בה כיסויים, במקום להוסיף EdU לתאים ישירות. הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים בטמפרטורת החדר אם לא צוין אחרת.</li>
	<li>תקן את התאים המסומנים עם 2.5% glutaraldehyde, טרי עשה על ידי דילול 25% מלאי במאגר 100 mM cacodylate, במשך 1 שעה. הערה: שלבי הזיהוי הבאים של EdU רגישים לתזמון הקיבעון. זמני קיבוע ארוכים יותר עלולים להשפיע לרעה על תיוג EdU ולגרום ליחס אות לרעש נמוך יותר.</li>
	<li>הסר glutaraldehyde על ידי שטיפת הדגימות עם PBS בתוספת 5 מ"מ MgCl2 (PBS* לאחר מכן). לשטוף שלוש פעמים עם דגירה של 10 דקות לכל שטיפה.</li>
	<li>חלחלו קרומי פלזמה עם 1% טריטון X-100 ב-PBS* (PBS*T לאחר מכן). לשטוף פעמיים עם דגירה של 5 דקות לכל שטיפה.</li>
	<li>יש לשטוף את הדגימה בהרחבה באמצעות PBS*. בצע חמישה שינויים ודגר במשך 5 דקות בכל שינוי.</li>
	<li>להרוות את קבוצות אלדהיד ללא שיורית עם 20 מ"מ גליצין ב PBS *, פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.</li>
	<li>חסום את הדגימות ב- 1% BSA ב- PBS * למשך 30 דקות.</li>
</ol>2. תגובת קליקים
הערה: הליך זה משתנה מפרוטוקול19 שפורסם בעבר.
<ol><li>מיד לפני השימוש, להכין תערובת תגובה קליק לזיהוי EdU: בצינור microcentrifuge, לערבב 430 μL של 100 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 20 μL של 100 mM CuSO4, 1.2 μL של ביוטין-אזיד (10 מ"מ ב- DMSO), ו 50 μL של 0.5 M חומצה אסקורבית. עבור בקרת איכות של תיוג replicative והליך קליק ברמה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ביוטין-אזיד יכול להיות מוחלף על ידי AlexaFluor 488-azide. הערה: סדר הוספת הרכיבים בתגובה לעיל חשוב.</li>
	<li>בצע קליק-תגובה בתא לח כדי למזער את שינויי האידוי והריכוז בקוקטייל התגובה. מכינים את התא הלח על ידי הנחת גיליון רטוב של נייר סינון בתחתית צלחת פטרי ומכסה אותו בסרט פרפין. מניחים את כיסויי הכיסוי על פני השטח של הסרט עם התאים פונים כלפי מעלה ושכבה 50-100 μL של קוקטייל התגובה על כיסוי. התגובה אורכת 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הפסיקו את התגובה על ידי שטיפת הדגימה ב-0.1% טריטון X-100 ב-PBS* (PBS*T), חמש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>לחסום ב 1% BSA ב PBS * T במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכן פתרון סטרפטאבידין-ננוגולד עם PBS*T המכיל 1% BSA. לדגור על המדגם עם streptavidin, מצומד עם 1.4 ננומטר חלקיקי Nanogold (גשושי ננו) ב 1% BSA + PBS * T לילה ב +4 °C (4 °F) בתא הלח שהוכן לאחרונה.</li>
	<li>הפסיקו את התגובה ושטפו את הדגימה ב-PBS*T, חמש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.</li>
	<li>לייצב את קומפלקס הביוטין סטרפטאבידין על ידי פוסט-פיקסינג ב-1% גלוטרלדהיד ב-PBS* למשך 30 דקות.</li>
	<li>הסר glutaraldehyde על ידי כביסה אינטנסיבית עם מים deionized ולשטוף את המדגם ב PBS *, חמש פעמים במשך 20 דקות כל אחד.</li>
	<li>להרוות קבוצות אלדהיד חינם עם מוכן טרי 1 מ"ג / מ"ל NaBH4 במים, פעמיים במשך 10 דקות כל אחד. במהלך הדגירה, בועות של H2 נוצרים אשר יכול להרים את כיסויים. בזהירות לדחוף אותם למטה עם פינצטה.</li>
	<li>לשטוף עם מים deionized חמש פעמים במשך 5 דקות כל אחד. הערה: לבקרת איכות בשלב התוויות, מומלץ לבצע תיוג בקרה עם סטרפטאבידין המסומן בפלואורסצנטיות (איור 2). זה יספק הערכה של עוצמת תיוג ורמת הרקע לפני המעבר לשלבים מייגעים ונוטים לחפץ לאחר מכן.</li>
</ol>3. הגברה אג
הערה: הליך זה שונה מ Gilerovitch ואח ', 1995 (ראה 20,21).
<ol><li>Resuspend 50 גרם של אבקת שיטה ב 100 מ"ל של מים deionized. ממיסים במשך 3 ימים, דגה, ומסננים דרך ארבע שכבות של מטלית גבינה. יש לאחסן קפואים ב-5 מ"ל בצינורות של 50 מ"ל. הפשירו מיד לפני השימוש.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של 1 M MES (pH = 6.1) ל 5 מ"ל של aliquot מופשר של פתרון אבקת שיטה כדי להפוך 7 מ"ל של 0.28 M MES (pH = 6.1) בתמיסת אבקת שיטה. מערבבים על ידי נדנדה איטית של הצינור במשך 30 דקות. לעטוף את הצינור עם רדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור.</li>
	<li>במקביל לשלב 3.2, כיסויי כביסה עם חיץ כביסה (50 מ"מ MES, pH = 5.8, 200 מ"מ סוכרוז), שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.</li>
	<li>הכן את הפתרון הטרי של N-propyl gallate (NPG). בצינור 15 מ"ל, להמיס 10 מ"ג של NPG ב 250 μL של 96% אתנול, ולהתאים ל 5 מ"ל עם מים deionized.</li>
	<li>שים 36 מ"ג של לקטט כסף בצינור 15 מ"ל עטוף בנייר כסף.</li>
	<li>אחרי שלב 3.2. הושלם, להוסיף 1.5 מ"ל של פתרון NPG לתערובת אבקת שיטה וסלע עוד 3 דקות. הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים בחדר חושך. יש להשתמש באור בטוח שאינו אקטיני (צהוב או אדום).</li>
	<li>שיווי משקל את הדגימה עם חוצץ כביסה ולהמשיך לחדר החשוך. בו זמנית, מוסיפים 5 מ"ל של מים deionized כדי לקטט כסף להתמוסס על ידי רועד נמרץ במשך 1-2 דקות.</li>
	<li>מוסיפים 1.5 מ"ל של תמיסת לקטט כסף לתערובת אבקת שיטה, רוק לאט במשך 1 דקה. הימנע היווצרות בועות, כמו חמצן בתערובת יאט את התגובה.</li>
	<li>מסננים את התמיסה מהצלחת עם כיסויים ויוצקים 3 מ"ל של תערובת אבקת לקטט-שיטה כסופה על התאים. מנענעים את המנה מספר פעמים ודוללים במשך 2-5 דקות. זמן הדגירה תלוי באצווה אבקת שיטה ובטמפרטורה. זה צריך להיות מוגדר באופן ניסיוני. הערה: זמן דגירה ארוך יותר עלול לגרום לכריכת כסף לא ספציפית.</li>
	<li>כדי לעצור את התגובה, לנקז את תערובת התגובה לשטוף את המנה בהרחבה עם שלושה עד חמישה שינויים של מים deionized, ואחריו שלושה שינויים נוספים במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>תבדוק את הכתמים מתחת למיקרוסקופ של ברייטפילד. כתמים טובים צריכים להיות בהירים עד כהים עם רקע צהבהב קלוש מאוד. הערה: אם הכתמים אינם מתפתחים, ניתן לחזור מיד עם התערובת שכבר נוצרה (התערובת פעילה כ -15 דקות אם נשמר בחושך). עם זאת, הכתמים במקרה זה עלולים להתפתח מהר מדי.</li>
</ol>4. גוון זהב
הערה: על מנת להגן על חלקיקי כסף מפני פירוק על ידי חמצון OsO4 בהליכים הבאים, ספיגה עם זהב משמש בשלב זה (Sawada, Esaki, Esaki, 1994)22.
<ol><li>יש לשטוף את המכסים במים שעברו דה-יוניזציה.</li>
	<li>על מנת להגן על חלקיקי כסף מפני פירוק על ידי חמצון OsO4 , לדגור על הדגימות 0.05% חומצה טטרכלורואורית במשך 2 דקות בחושך.</li>
	<li>לשטוף ביסודיות עם מים deionized במשך 10 דקות. הערה: בשלב זה מתווספת ניגודיות נוספת לדנ"א המכיל חומר. צבע המדגם צריך להשתנות מחום לשחור.</li>
</ol>5. כרום
הערה: פרוטוקול זה שונה מ- Ou et al., 201716.
<ol><li>לדגור על כיסויים להרוות את הדגימות ב 10 μM DRAQ5 ב PBS במשך 10 דקות בחושך.</li>
	<li>הכן 0.2% diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) פתרון ב 50 mM Tris או PBS: המיסו את ה-DAB ב-90% מהנפח הסופי על-ידי ערבוב נמרץ בחושך, ולאחר מכן התאימו את רמת החומציות ל-7.0-7.4 עם NaOH. כוונן את עוצמת הקול ל- 100% וסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, יש לאחסן עטוף בנייר כסף.</li>
	<li>מוסיפים פתרון DAB לתאים (2 מ"ל לצלחת פטרי בגודל 3 ס"מ) ודוללים במשך דקה אחת.</li>
	<li>מעבירים את כיסוי הכיסוי לתוך צלחת הפטרי התחתונה של הזכוכית ומניחים אותה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. הקרין את המדגם (מספר שדות ראייה) על מיקרוסקופ הפוך עם מקור אור מתכת-הליד וערכת מסנן Cy5 (640 ננומטר, 1 W / cm2 במישור מוקד) באמצעות תוכנית Apo λ 40х (NA = 0.95) עדשה למשך 10 דקות. הערה: אינדיקציה של צילום DAB מוצלח הוא צילום מלא DRAQ5 צילום היווצרות משקעים DAB כהה גרעינים מוקרן. עם זאת, האחרון לא תמיד ניכר על אות EdU-כסף-זהב אינטנסיבי (במיוחד כאשר פולסים EdU מורחבים מנוצלים).</li>
	<li>לשטוף עם מים deionized שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.</li>
</ol>6. התייבשות והטבעת שרף אפוקסי
<ol><li>בצינור microcentrifuge, להכין פתרון טטראוקסיד אוסמיום מופחת חלקית על ידי ערבוב 2% פתרון מימי של K4Fe(CN)6 עם כמות שווה של 2% פתרון מימית של OsO4, כדי לקבל 1% ריכוז סופי של שני הרכיבים. דגירה מכסה את הליפס ב OsOמופחת 4 במשך 1 שעות ולשטוף במים deionized שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד. הערה: בשלב זה תרכובת האוסמיום מופחת מגיב עם תצהירי DAB ומגביר את הניגודיות של DNA. זהירות: אוסמיום רעיל, לעבוד תחת מכסה המנוע אדים ולטפל בפסולת על פי תקנות בטיחות מקומיות.</li>
	<li>מייבשים את הדגימות בסדרה של פתרונות אתנול מדורגים באחוזים הולכים וגדלים: 50% EtOH - 3 x 10 דקות; 70% EtOH - 3 x 10 דקות, 80% EtOH - 3 x 10 דקות, 96% EtOH - 3 x 10 דקות, 100% EtOH - 3 x 10 דקות.</li>
	<li>לחדירה והטבעה השתמש בנוסחת השרף עם יחס נפח הרכיב כדלקמן: מונומר שרף אפוקסי:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). נוסחה זו היא שונה עם אתנול.<ol>
<li>דגור על כיסוי בתערובת אתנול-שרף (3 חלקים 100% EtOH:1 חלק שרף אפוקסי) במשך 30 דקות.</li>
		<li>דגור על כיסוי בתערובת אתנול-שרף (1 חלק 100% EtOH:1 חלק שרף אפוקסי) במשך 2 שעות.</li>
		<li>דרגו את כיסוי הכיסוי בתערובת האתנול-שרף (1 חלק 100% EtOH:3 חלקים שרף אפוקסי) לילה.</li>
		<li>החליפו תערובת אתנול-שרף בשרף טהור טרי. יש לדגור בתערובת שרף טהורה למשך 8 שעות. פתח את המנה כדי לתת שרידים של אתנול להתאדות.</li>
		<li>מעבירים כיסויים למנה חדשה עם שרף טהור ודגרה במשך 2 שעות בטמפרטורה של 37-42 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>ממלאים תבנית סיליקון בשרף טרי. מניחים את כיסוי עם התאים הפונים כלפי מטה על תבנית סיליקון מתאימה מלאה שרף אפוקסי. לרפא את השרף עבור 24 שעות ב 37 °C (50 °F), ולאחר מכן ב 60 °C (60 °F) לפחות 2 ימים. זהירות: רכיבים של תערובת שרף אפוקסי הם חומרים מסרטנים פוטנציאליים. תלבש כפפות ותעבוד מתחת למכסה המנוע של האדים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את לוח השרף מהתבנית, לנקות את פני השטח של כיסוי עם אזמל או סכין גילוח. כדי להסיר את כיסוי, טיפה כיסוי לתוך חנקן נוזלי ולאחר מכן להעביר את הלוח לתוך המים הרותחים. יש לחזור על הפעולה במידת הצורך.</li>
	<li>אתר את האזור המוקרן תחת סטריאומיקרוסקופ וחתוך אותו מהלוח עם מסור או כל מכשיר מתאים אחר. מחממים מראש את הלוח בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה, במידת הצורך.</li>
	<li>הדקו את החתך למחזיק מדגם אולטרה-מיקרוטומי לחיתוך בלוק סופי. בעזרת התער, הכינו את הדגימה בצורת פירמידה. הר את המחזיק עם פירמידה על ultramicrotome ולהתקין את הסכין.<ol>
<li>חתוך את הבלוק כך שהתאים המוקרנים הנושאים תווית EdU ייכללו. הכן קטע דק למחצה (עובי 250 ננומטר) המתאים לטומוגרפיה אלקטרונית. הערה: ניתן להתאים את עובי המקטע כך שיתאים לדרישות הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נתק חלק מקצה הסכין והנח אותם על רשתות החריץ הבודד. עבור טומוגרפיה אלקטרונית, 250 ננומטר קטעים נבחרים על רשתות 1 מ"מ חריץ יחיד ולאחר ייבוש קטעים אלה יכולים להיות מצופים פחמן משני הצדדים. אין צורך בניגוד נוסף. הערה: מכיוון שהמקטעים כבר מכילים חלקיקי Au-Ag בעלי ניגודיות גבוהה, אין צורך להוסיף חלקיקי זהב פידוקאליים לפני השטח של המקטע.</li>
	<li>בדוק את הרשתות במיקרוסקופ אלקטרוני שידור בהגדלה נמוכה (כ -600x) כדי לאתר את התאים עם דפוסי שכפול מתאימים. הערה: פרוטוקול זה יוצר צפיפות תוויות גבוהה מספיק לזיהוי קל של מוקדי שכפול אפילו בהגדלה נמוכה. מומלץ תחילה ליצור מפה של המקטע לניווט הבא ואיסוף הקרנות זוויתיות לטומוגרפיה. עבור להגדלה גבוהה יותר וצלם תמונות ברזולוציה גבוהה.</li>
</ol>7. טומוגרפיה אלקטרונית
<ol><li>הכנס את הרשת למיקרוסקופ האלקטרונים של השידור עם מחזיק הטיה גבוהה. טען את הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים ואתר את אזור העניין.</li>
	<li>יישר את המיקרוסקופ במצב EFTEM במצב תאורה כמעט מקבילי. כוונן את מסנן האנרגיה עם חריץ בחירת אנרגיה 20 eV ממוקם בשיא אפס הפסד.</li>
	<li>לפני הקרנת אזור רכישת טומוגרפיה בקצב מינון של 40 e/ Å2/s לפחות 1.5-2 דקות, אשר תואם את המינון הכולל לפחות של 3000 e / Å2.</li>
	<li>התאם גובה אוצנטרי עם פעילות אוטומטית ב- SerialEM. בדוק את משימת המיקוד האוטומטי כדי לוודא שהיא פועלת כראוי בזווית הטיה אפסית ובערך defocus היעד של -0.8 מ'ק"מ.</li>
	<li>הטה את מחזיק הדגימה ל- -60° באמצעות המשימה Walk-Up.</li>
	<li>הגדר את רכישת הטומוגרפיה מ- -60 עד +60° עם שלב 2.0°. יש להגדיר את החשיפה בהתאם לזווית ההטיה כדי לשמור על העוצמה הממוצעת במצלמה. הגבל את הסטת התמונה במקרה שהיא גורמת לשינוי אנרגיה ובכך חותכת אי-התאמה. יש לשמור את נתוני הטומוגרפיה כקובץ .mrc</li>
	<li>יבא את קובץ ה- .mrc לתוכנת IMOD לשחזור טומוגרפיה. הסר את ערכי הפיקסלים החריגים ביותר עקב צילומי רנטגן.</li>
	<li>ישר את סדרת ההטיה. בצע מתאם צולב ראשוני, ולאחר מכן סמן באופן ידני 10-12 חלקיקי זהב כנאמנות. עקוב אחר המודל הפיקטיבי ובדוק כי כל fiducial הוא במעקב נכון דרך סדרת הטיה. צור טומוגרמה לדוגמה (פרוסות) וסמן באופן ידני את גבולות המקטע הדק כדי למנוע הטיה אפשרית של הצפיפות המשוחזרת בתוך אמצעי האחסון. השגיאה השיורית הממוצעת עבור יישור עדין הייתה פחות מ 1.2 פיקס.</li>
	<li>שחזר את הטומוגרמה באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורי מסונן ולאחר מכן חתוך את הפלט כך שיתאים לאזור העניין לאמצעי האחסון הסופי.</li>
</ol>

<ol><li>Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicating+large+genomes%3A+divide+and+conquer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicating large genomes: divide and conquer.</a> Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).</li>
<li>Méchali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+origins%3A+Many+choices+for+appropriate+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).</li>
<li>Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Organization of DNA replication.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737(2010).</li>
<li>Su, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+reveals+spatiotemporal+propagation+of+human+replication+foci+mediated+by+CTCF-organized+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).</li>
<li>Leonhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+factories+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication factories in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).</li>
<li>Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microarchitecture+of+DNA+replication+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microarchitecture of DNA replication domains.</a> Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).</li>
<li>Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organizations+of+replicon+domains+during+DNA+synthetic+phase+in+the+mammalian+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus.</a> Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+DNA+replication+sites+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).</li>
<li>Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+early+and+late+replicating+DNA+in+human+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories.</a> Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).</li>
<li>Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+three-dimensional+replication+patterns+during+the+S-phase%2C+analysed+by+double+labelling+of+DNA+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy.</a> Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).</li>
<li>Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-like+chromatin%3A+Toward+understanding+the+real+chromatin+organization+present+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell.</a> Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).</li>
<li>Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+early+chromosome+condensation%3A+A+hierarchical+folding%2C+axial+glue+model+of+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).</li>
<li>Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+interphase+large-scale+chromatin+structure+from+analysis+of+engineered+chromosome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposium+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions.</a> Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 236 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromEMT%3A+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+in+interphase+and+mitotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), (2017).</li>
<li>Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+factories+and+nuclear+bodies%3A+the+ultrastructural+characterization+of+replication+sites+during+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle.</a> Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).</li>
<li>Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytology+of+DNA+replication+reveals+dynamic+plasticity+of+large-scale+chromatin+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers.</a> Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li>
<li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li>
<li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed%2C+Epon-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

לשיטה המתוארת כאן יש מספר יתרונות על פני פרוטוקולים שפורסמו בעבר. ראשית, השימוש ב-Click-chemistry לתיוג דנ"א משוכפל מבטל את הצורך בדנטורציה של DNA תנאי מוקדם לגילוי BrdU עם נוגדנים, ובכך לשפר את המבנה האולטרה-מבנה של הכרומטין. 
שנית, ניצול הביוטין כליגנד משני שנוצר לאחר קיבוע glutaraldehyde ומרווה נכונה של קבוצות אלדהיד לא מאוגדות ממזער את השינוי הכימי של המטרה, ובכך משפר את יעילות התוויות תוך הפחתת הרקע עקב ביוטין אנדוגני. ביוטין-סטרפטאבידין מוסיף גם רב-תכליתיות שכן השימוש בסטרפטאווידין המסומ...

שכפול DNA הוא תהליך ביולוגי בסיסי הנדרש להעתקה והעברה נאמנה של המידע הגנטי במהלך חלוקת התאים. באוקריוטים גבוהים יותר, שכפול DNA כפוף לרגולציה מרחבית-זמנית הדוקה, המתבטאת בהפעלה רציפה של מקורותהשכפול 1. מקורות שכפול שכנים ירי באופן סינכרוני טופס אשכולות של replicons2. ברמה של מיקרוסקופיה אופטית, אתרים של שכפול DNA מתמשך מזוהים כמו מוקדי שכפול של מספר וגודל שונים. מוקדי שכפול מציגים דפוסים ספציפיים של התפלגות מרחבית בתוך גרעין התא בהתאם לתזמון השכפול של ה- DNAהמסומן בתווית 3,4, אשר, בתורו, מתואם היטב עם פעילות הגנים שלו. הודות לרצף מוגדר היטב של שכפול DNA, מסודר בקפדנות בחלל ובזמן, תיוג שכפול היא שיטה רבת עוצמה של תיוג DNA מדויק לא רק לחקר תהליך השכפול כשלעצמו, אלא גם להפלות תת-שבר DNA ספציפי עם פעילות שעתוק מוגדרת ורמת דחיסה. הדמיה של שכפול כרומטין מבוצעת בדרך כלל באמצעות זיהוי רכיבי חלבון עיקריים של מכונות שכפול DNA (או על ידי חיסון או על ידי ביטוי של תגי חלבון פלואורסצנטיים 5,6) או על ידי שילוב של מבשרי סינתזת DNA שונה 7,8,9,10 . מתוכם, רק שיטות המבוססות על שילוב של נוקלאוטידים שהשתנו בדנ"א ששוכפל לאחרונה מאפשרות לכידת שינויים קונפורמציה בכרומטין במהלך השכפול, ומעקב אחר אופן הפעולה של תחומים משוכפלים לאחר השלמת השכפול שלהם.
באאוקריוטים גבוהים יותר, אריזות DNA לכרומטין מוסיפות רמה נוספת של מורכבות לוויסות פונקציות גנטיות בסיסיות (שעתוק, שכפול, פיצוי וכו '). קיפול הכרומטין משפיע על נגישות הדנ"א לטרנס-גורמים רגולטוריים ושינויים קונפורמיים בדנ"א (התרופפות סליל כפול) הנדרשים לסינתזת התבנית. לכן, מקובל כי תהליכים סינתטיים תלויי DNA בגרעין התא דורשים מעבר מבני של כרומטין ממצבו המרוכז והדכאני לקונפורמציה נגישה ופתוחה יותר. מבחינה ציטולוגית, שני מצבים כרומטין אלה מוגדרים כהטרוכרומטין ואאוכרומטין. עם זאת, עדיין אין קונצנזוס לגבי אופן קיפול ה- DNA בגרעין. ההשערות נעות בין "פולימר נמס" מודל11, שבו סיבים נוקלאוזומיים מתנהגים כפולימר אקראי שעבורו צפיפות האריזה נשלטת על ידי מנגנוני הפרדת פאזה, למודלים מתקפלים היררכיים המניחים היווצרות רציפה של מבנים דמויי סיבי כרומטין של עובי הולך וגדל12,13. מודלים קיפול היררכיים זכו לאחרונה לתמיכה בגישות מולקולריות המבוססות על ניתוח מגעי DNA-DNA-DNA (לכידת קונפורמציה כרומוזומית, 3C), הממחישים את קיומה של ההיררכיה של תחומים מבניים כרומטין14. חשוב לציין כי יחידות שכפול לתאם היטב לתחומים כרומטין אלה15. הביקורת העיקרית על מודלים אלה מבוססת על צבירת כרומטין מלאכותית פוטנציאלית הנגרמת על ידי הליכי הכנת מדגם, כגון permeabilization של קרום התא והסרת רכיבים שאינם כרומטין, על מנת לשפר את ניגודיות הכרומטין למחקרים אולטרה מובנים תוך שיפור נגישות הכרומטין לבדיקות שונות (למשל, נוגדנים). ההתקדמות הטכנית האחרונה בהכתמת DNA סלקטיבית למיקרוסקופיה אלקטרונית על ידי חמצון צילום בתיווך פלואורופור מחייב DNA של דיאמינובנזידין (ChromEMT6) אפשרה את חיסול המכשול הזה. עם זאת, אותם שיקולים נכונים להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים של שכפול DNA 17,18. כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת מיפוי אולטרה-מבני ברזולוציה גבוהה בו זמנית של דנ"א מסונתז חדש וכרום מוחלט בתאים שלמים המחוברים לאלדהיד. הטכניקה משלבת זיהוי של DNA שכותרתו EdU על ידי קליק-כימיה עם בדיקות biotinylated וסטרפטאבידין-Nanogold, ו ChromEMT.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנט</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU)</td><td>תרמו פישר</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-מורפולינו)אתאן חומצה סולפונית (MES)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP300-100</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 555-אזיד</td><td>טרמו פישר</td><td>A20012</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין-אזיד</td><td>Lumiprobe</td><td>C3730</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Boval</td><td>LY-0080</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>SPI-CHEM</td><td>26544-38-7</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>SPI-CHEM</td><td>90-72-2</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Scientific</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>מונומר שרף אפוקסי</td><td>SPI-CHEM</td><td>90529-77-4</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד (25%, דרגת EM)</td><td>TED PELLA, INC</td><td>18426</td><td></td></tr><tr><td>גומי ערבי</td><td>ACROS Organics</td><td>258850010</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Panreac</td><td>141396.1209</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>SPI-CHEM</td><td>25134-21-8</td><td></td></tr><tr><td>N-פרופיל גלאט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>כסף לקטט</td><td>ALDRICH</td><td>359750-5G</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-AlexaFluor 488 מצומד</td><td>Termo Fisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Nanogold מצומד</td><td>Nanoprobes</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טטרכלורואורית</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1004</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>CHEM-IMPEX INT'L</td><td>298</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Chemica</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רשתות חריץ יחיד נחושת</td><td>Ted Pella</td><td>1GC10H</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 סט מסנני פלואורסצנטי (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td><td>Nikon</td><td>Cy5 HQ</td><td>חלופות: Zeiss, Leica, סכין</td></tr><tr><td>יהלום אולימפוס Ultra Wet 45o</td><td>Diatome</td><td>DU</td><td>חלופות:</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>של טד פלה Nikon</td><td>Ti-E</td><td>חלופות: Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>מחזיק מדגם הטיה גבוהה</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Biosan</td><td>Multi Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור הפועל ב-200 קילו וולט במצב EFTEM, עם גוניומטר הטיה גבוהה</td><td>Jeol</td><td>JEM-2100</td><td>חלופות: FEI, פינצטה של היטאצ'י</td></tr><tr><td></td><td>טד פלה</td><td>523</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-מיקרוטום</td><td>Leica</td><td>UltraCut-E</td><td>חלופות: RMC</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רכישת תמונה</td> קוד <td>פתוח</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td><td></td></tr><tr><td>עיבוד תמונה</td> IMOD <td>בקוד פתוח</td><td>(https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

עקרונות קיפול DNA בגרעין התא והשינויים הדינמיים שלו המתרחשים במהלך מילוי פונקציות גנטיות בסיסיות (שעתוק, שכפול, הפרדה וכו ') נשארים מובנים היטב, בין היתר בשל היעדר גישות ניסיוניות להדמיה ברזולוציה גבוהה של לוצי כרומטין ספציפי בגרעינים שהשתמרו מבנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה של תחומים משוכפלים בתרבית תאים מונולאיים במקום, על ידי שילוב תיוג EdU של DNA מסונתז חדש עם זיהוי תווית עוקב עם Ag-הגברה של חלקיקי ננוגולד וכרום הכתמת כרומטין. פרוטוקול זה מאפשר תיוג טרום הטמעה בעל ניגודיות גבוהה ויעילות גבוהה, התואם לקיבעון גלוטרדהיד מסורתי המספק את השימור המבני הטוב ביותר של כרומטין לעיבוד מדגם בטמפרטורת החדר. יתרון נוסף של תיוג טרום הטבעה הוא האפשרות לבחור מראש תאים מעניינים עבור חלוקה. זה חשוב במיוחד לניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגניים, כמו גם תאימות עם גישות טומוגרפיה אלקטרונים לניתוח תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של ארגון כרומטין באתרי שכפול, וניתוח של ארגון כרומטין לאחר שכפול, וניתוח של ארגון מחדש של כרומטין לאחר שכפול והפרדה כרומטית אחות באינטרפאזה.

מוקדי שכפול בגרעין תאי היונקים מציגים דפוסי הפצה ברורים בתוך הגרעין בהתאם להתקדמות שלב ה- S. דפוסים אלה מתואמים עם פעילות שעתוק של loci להיות משוכפל. מאז השיטה המוצגת כאן משתמשת בהליך חזק למדי, זה די פשוט להשתמש תיוג דופק משכפל לגילוי ספציפי של loci כרומטין במצבים תמלול שונים, אפילו בתנאים המציעים שימור מבני הטוב ביותר של כרומטין המתקבל על ידי קיבעון כימי טמפרטורת החדר.
שלבי בקרת איכות נועדו להבטיח השלמה מוצלחת של הליכי המפתח בפרוטוקול זה. בתחילה, תיוג מוצלח של EdU צריך להיות מאושר על ידי תגוב...

פרוטוקול זה מציג טכניקה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי שכפול בכרומטין שהשתמר מבנית במקום המשתמש בשילוב של תיוג EdU-streptavidin-Nanogold טרום הטמעה וכרוממט.

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

אנו מציגים פרוטוקול להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית של תחומים replicative בתא על ידי תיוג EdU של DNA מסונתז חדש זיהוי תווית עם שיפור כסף של חלקיקי Nanogold וכרום הכתמת הכרומטין. פרוטוקול זה מעניק את תיוג טרום ההטבעה הניגודיות הגבוהה עם קיבעון גלוטרדהיד מסורתי המעניק את השימור המבני הטוב ביותר של הכרומטין לעיבוד מדגם טמפרטורת החדר. פרוטוקול זה מותאם לתא הדבקה הגדל על כיסויים בצלחת פטרי.הוסף EdU ל 10 מיקרו מולים ריכוז סופי ומניחים את התאים לתוך האינקובטור לזמן התיוג הרצוי. תקן את התאים המסומנים עם 2.5% gluaradehydrate בתמיסת 100 מילימול נתרן קקודילאט במשך שעה אחת. זמן קיבעון ארוך יותר עלול להשפיע לרעה על תיוג EdU.הסר glutaraldehyde על ידי שטיפה של הדגימות עם PBS בתוספת חמישה מילימולים של מגנזיום כלוריד, נחשב עוד יותר כוכב PBS. לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות. קרום פלזמה Permeabilize עם 1% פתרון של Trione X-100 בכוכב PBS, לבצע שני שינויים במשך חמש דקות כל אחד.פתרון זה מכונה גם כוכב PBS T.נרחב לשטוף את המדגם עם כוכב PBS. חמישה שינויים לחמש דקות כל אחד. להרוות את שאריות אלדהיד קבוצות עם 20 מילימול של גליצין בכוכב PBS, פעמיים במשך 10 דקות.מניחים את המדגם בכוכב PBS עם 1%BSA במשך חצי שעה. בעת חסימה ב- BSA, להכין את קוקטייל התגובה לזיהוי EdU. סדר הוספת הרכיבים חשוב.הטיות ביוטין-אזיד EdU מבוצעות בתא הלח כדי למזער את שינויי האידוי והריכוז בקוקטייל התגובה. הכינו את התא הלח. מניחים את כיסוי הכיסוי על para-film עם תאים הפונים כלפי מעלה ושכבה 50 עד 100 microliters של קוקטייל התגובה על כיסוי.התגובה אורכת 30 דקות בטמפרטורת החדר. הפסיקו את התגובה על ידי שטיפת הדגימה בכוכב PBS T, חמש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. חסום שוב עם 1%BSA בכוכב PBS T למשך חצי שעה נוספת.הכן פתרון סטרפטאבידין-ננוגולד בכוכב PBS T עם 1%BSA. דגירה המדגם עם סטרפטאבידין לילה ב פלוס ארבע מעלות בתא לח שהוכן לאחרונה. ההליך זהה להטיית ביוטין-אזיד EdU.הפסיקו את התגובה ושטפו את הדגימה, חמש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם כוכב PBS T.Stabilize biotin streptavidin קומפלקס על ידי קיבוע נוסף יהיה 1% כוכב PBS glutaraldehyde במשך חצי שעה. הסר glutaraldehyde על ידי כביסה אינטנסיבית עם מים deionized. להרוות קבוצות אלדהיד שיורית עם מיליגרם אחד למיליליטר נתרן בורוהידריד.לשטוף שוב ביסודיות. השלב הבא הוא להגדיל את הגודל של חלקיקי Nanogold באמצעות תצהיר כסף על מסלול הזהב. הכן את ההכנות המוקדמות כדי למזער את פעילות חדר החושך.שיווי משקל את הדגימות עם חוצץ כביסה ולהמשיך לחדר חושך. בחדר החושך מערבבים את הרכיבים להכנת פתרון הכביסה ומחילים אותו על הדגימות. תמיסת אבקת שיטה היא מאוד קרביים.אז במהלך ערבוב הרכיבים, לטלטל את הצינור לאט כדי למנוע היווצרות בועה וקצף. התגובה אורכת בין שתיים לחמש דקות. אנו ממליצים לבצע הרצת מבחן כדי לקבוע את זמן התגובה האופטימלי.זמן דגירה ארוך יותר עלול לגרום לתצהיר כסף לא ספציפי. כדי לעצור את התגובה, לשטוף במהירות את המדגם עם שלושה עד חמישה שינויים של מים deionized. ואחריו עוד שלושה שינויים במשך חמש דקות כל אחד.כדי להגן על חלקיקי הכסף מפני פירוק על ידי tetroxide אוסמיום, לדגור על הדגימות ב 0.05% חומצה טטרכלורואורית במשך שתי דקות בחושך. לשטוף ביסודיות עם מים deionized. בשלב זה, ניגודיות נוספת מתווספת ל- DNA המכיל חומר.להרוות את הדגימה עם כתם DNA DRAQ5. מוסיפים תמיסת diamionobenzidine לדגימה ודגורים במשך דקה אחת. הזיזו את כיסוי הכיסוי לתוך צלחת הפטרי התחתונה מזכוכית, והניחו אותה על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך.להקרין כמה שדות ראייה עם אור אדום 640 ננומטר. החלונית השמאלית מציגה את הלבנת התמונות המלאה של DRAQ5. בחלונית הימנית, אותו שדה ראייה מוצג באור המשודר המציג משקעים מסוג DAB.לשטוף דגימות עם מים deionized. השלב הבא צריך להתבצע מתחת למכסה המנוע של האדים. מוכן פתרון אוסמיום טטרוקסיד מופחת חלקית.תיזהר. חומר זה הוא מאוד נדיף ורעיל. החל את הפתרון המוכן על המדגם.בשלב זה, תרכובות אוסימיום מופחת להגיב עם תצהירים diamionobenzidine ולהגדיל את הניגוד של ה- DNA. השליכו אוסמיום המכיל פתרון בהתאם לתקנה המקומית שלכם ושטפו דגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. המדגם מיובש עוד יותר בסדרה של הגדלת ריכוזי אתנול ואחריו חדירת התאים עם תערובות שרף אתנול.החלף תערובת שרף אלכוהול עם שרף טהור טרי מוכן. מלאו את תבנית ההטבעה בגודל הנכון בשרף טרי. מניחים את כיסוי הכיסוי עם תא הפונה כלפי מטה מעל החלל מלא שרף.לרפא את השרף במשך 24 שעות ב 37 מעלות. ואז ב-60 מעלות לפחות יומיים. הסר שרף ממשטח תחתון של כיסוי.זרוק את הלוח לתוך חנקן נוזלי ולאחר מכן להעביר למים רותחים. הזכוכית צריכה להתנתק. חזור על הפעולה במידת הצורך.שדות ראייה מוקרנים צריכים להיות גלויים בבירור בשל התצהיר diamionobenzidine והכתמת DAB. לחתוך את האזור של עניין מן הלוח באמצעות המסור או כל מכשיר מתאים אחר. מניחים את הגזרה לתוך המחזיק הפשוט ultramicrotome.הגדר את ultramicrotome עבור חיתוך בלוק סופי. באמצעות סכין הגילוח, הכינו את הגלולה בצורת פירמידה. גודלו של שטח שטוח על גבי הפירמידה צריך להיות כ 400 על ידי 200 מיקרון.הר את הפירמידה המוכנה לזרוע האולטרה-רובוטית והתקן את הסכין. הכן את החלקים. ניתן להתאים את עובי המקטע כך שיתאים לדרישות הניסיוניות.אנחנו שואפים לטומוגרפיה אלקטרומגרפיה. אז הכנו קטעים בעובי של 250 ננומטר המכונים גם קטעים דקים למחצה. נתק את המקטעים מקצה הסכין והתקן אותם על רשת חריצים.השתמשנו ברשת חריצים, הם היו עגולים מילימטר אחד כדי להיות בסביבה, פתיחה צדדית מילימטרית אחת. גודל הפתיחה הקטן מספק יציבות טובה יותר של המקטעים. תן לדגימות להתייבש ברשת.ברגע זה, החלקים מוכנים לתצפית. מקם את הרשת במחזיק מדגם מיקרוסקופ האלקטרונים. טען את הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים.לרכוש סדרת הטיה. מוקדי שכפול בגרעיני תאי היונקים מציגים דפוסי הפצה ברורים בהתאם להתקדמות שלב ה- S. תיוג EdU מוצלח שאושר על ידי תגובת הקליק עם אזיד מסומן בפלואורסצנטיות מדגים דפוס שכפול טיפוסי באוכלוסיית התאים ההטרוגניים לאחר קיבוע glutaraldehyde על גבי.תיוג סטרפטאבידין יכול להיות מושפע glutaraldehyde. אז קודם לבדוק את כתמי סטרפטאבידין פלואורסצנטין תחת אותו מצב כמו ננו-גד סטרפטאווידין בתחתית. תוצאה טובה של הליך שיפורי הכסף היא כתם חום כהה של כמה גרעינים וכתם ציטופלסט צהוב התעלף מאוד, המוצג בתחתית.היתרון של תיוג לפני הטבעה הוא האפשרות לבחור תאים עבור החתך. זה אפשרי בשלב זה כי דפוסי התוויות הופכים גלויים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. התוויות המתאימות גורמות לאתרי השכפול המסומנים היטב.ראש חץ להראות את סיבי הכרומטין מוכתמים DAB. תיוג הרקע מימין מוגבל לכמה חלקיקים למיקרון מרובע. חלקים דקים למחצה מוכנים לטומוגרפיה ואינם דורשים תוספת של חלקיקי זהב.הגישה המתוארת המשמשת למחקרים של ארגון כרומטין באתרים עם שכפול זמין. לניתוח של ארגון מחדש לאחר שכפול של כרומטין כולל הדמיה ברזולוציה גבוהה של הפרדת כרומטין. הוא משמש גם עבור תיוג משוכפל של תחומים כרומוזומליים גדולים ומחקרים של קיפול כרומטין בסדר גבוה יותר והטרוכרומטין.טכניקת הדמיה זו חשובה גם כנקודת התייחסות לנתונים הנוצרים על ידי גישות לא מיקרוסקופיות אחרות. ניתן להתאים את השיטה גם למחקרים מיקרוסקופיים מתואמים כולל טכניקות רזולוציית-על. זה פותח אופקים חדשים במחקרים של מבנה סדר גבוה יותר כרומטין ואת הדינמיקה שלה במצבים הפיזיולוגיים השונים של התא.

imaging-replicative-domains-ultrastructurally-preserved-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי "macromolecular" (~ 4 ננומטר) החלטה.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להמחיש דחיסת אן ארעי של כחוליות. טיפוח סינכרונית, פיקוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הקפאה מהירה ו גבוה מתח הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה משמשים. פרוטוקול עבור מתודולוגיות אלה מוצג, יישומים עתידיים ופיתוחים הנדונים.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

פרוטוקול זה מתקן את טומוגרפיית הקריו-אלקטרון (קריו-ET) לרקמות עבות על ידי שילוב הקפאה בלחץ גבוה (HPF) עם שיטת הוופל, הרמת קרן יוני מוקד קריוגנית (crio-FIB), ורכישה מקבילה סימטרית במינון, מה שמניב למלות דקות ודגימות מזגוגות לניתוח שכפול בשטח בהיפוקמפוס העכבר.

תהליך עבודה של טומוגרפיית קריו-אלקטרון לרקמות עבות שהודגם בהיפוקמפוס של עכבר

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

למד הדמיה של תחומי שכפול בכרומטין באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית. השיטה משתמשת בתיוג EdU וחלקיקי Nanogold לזיהוי DNA חדש, עם שימור מבני מיטבי לתמונות ברזולוציה גבוהה.

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

גלה סרטונים נוספים