הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות

Macropinocytosis הוא מסלול אנדוציטי שחשוב למגוון תהליכים תאיים, כולל חילוף החומרים של הסרטן. פרוטוקול זה מאפשר לך לכמת את מידת macropinocytosis בתאים במבחנה. האוטומציה נועדה למקסם את רבייה, פרודוקטיביות והפחתת וריאציה ניסיונית.

יתר על כן, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת לך לבדוק חזותית את המדגם כדי לקבוע את איכות הניסוי ולהעריך מאפיינים מקרופינום נוספים. מפגינה את ההליך איתי תהיה צ'סקה מארי גלפטה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. עבור צלחת 24-well עם תבנית כיסוי, להשתמש מלקחיים כדי לאחוז כיסוי יחיד מאמבט האתנול.

הקש על כיסוי על הקיר הפנימי של הצלחת כדי להסיר אתנול עודף ומניחים את כיסוי שטוח על החלק התחתון של הבאר. לאחר האתנול מתאדה, לשטוף את כיסוי פעמיים עם DPBS, ולאחר מכן לזרוע את התאים על גבי כיסוי על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של השעיית התא לכל באר. מניחים את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד שמפגש התאים מגיע ל -60 עד 80% ביום שלפני תיוג מקרופינום.

יום לפני תיוג מקרופאינום, החלף את המדיה בבארות עם 500 מיקרוליטרים של מדיה ללא סרום שחוממה מראש והנח את התאים באינקובטור למשך 16 עד 24 שעות. עבור פורמט 96-well microplate, להתחיל על ידי העברת ההשעיה התא למאגר ריאגנט 25 מיליליטר. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, זרעו 100 מיקרוליטרים של השעיית התא לכל באר של מיקרו-פלטת הקרנה שחורה בעלת תוכן גבוה של 96 באר עם אולפין מחזורי או תחתית זכוכית ברורה אופטית.

לדגור על התאים עד מפגש התאים מגיע 60 עד 80% ביום שלפני תיוג מקרופינום. יום לפני תיוג מקרופינום, הסר והשלך את המדיה מכל באר באמצעות מתאם שאיפה רב ערוצי לקבלת טיפים סטנדרטיים המחוברים למשאבת ואקום. לחלופין, ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית.

באמצעות מאגר ריאגנט ופיפטה רב-ערוצית, הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטרים של מדיה נטולת סרום שחוממה מראש לכל באר, ולאחר מכן הניחו את התאים באינקובטור התא למשך 16 עד 24 שעות. עבור צלחת 24-well עם פורמט כיסוי, להחליף את המדיה בבארות עם 200 microliters של מדיה ללא סרום עם פלואורופור שכותרתו dextran משקל מולקולרי גבוה ומניחים את התאים באינקובטור התא במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שאפו את המדיה ושטפו בעדינות אך במהירות את התאים חמש פעמים עם PBS קר כקרח באמצעות בקבוק שטיפה מקורר מראש.

לחצו בחוזקה את הצלחת ביד במהלך הכביסה כדי לסייע בהסרת אגרגטים דקסטרניים שנדבקים לכיסויים. לאחר מכן, לתקן את התאים על ידי הוספת 350 microliters של 3.7% פורמלדהיד ודגרה במשך 20 דקות, ולאחר מכן לשאוף את פתרון הקיבעון לשטוף את התאים עם PBS פעמיים. מכתימים את הגרעינים ב-350 מיקרוליטרים של DAPI ב-PBS.

לאחר 20 דקות, לשאוף את פתרון DAPI ולשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. הדבק מבודדי סיליקון זה לצד זה בשקופית מיקרוסקופ כדי לקבל מרווח זוגי ולוקליזציה הניתנת לשחזור של נקודות הכיסוי הנדרשות לאוטומציית הדמיה. לאחר מכן, עבור כל כיסוי, הוסף טיפה של מדיה הרכבה פלואורסצנטית התקשות על שקופית המיקרוסקופ בתוך המרחב הפתוח של המבודד.

הרימו כיסוי באמצעות מלקחיים והסירו PBS עודף על ידי הקשה עדינה על הצד של כיסויים על מגבון ללא מוך. לאחר מכן, הניחו את כיסוי הכיסוי הפוך על טיפת המדיה המתלהקת והקש בעדינות על כיסוי הכיסוי באמצעות מלקחיים סגורים כדי להסיר בועות ממדיית ההרכבה. אחסן את השקופיות בסביבה חשוכה ואפשר למדיה המותקנת להתייבש בטמפרטורת החדר, שבדרך כלל אורכת 16 עד 24 שעות.

לפני הדמיה, הסר את המבודדים משוקופית המיקרוסקופ. לאחר שהשקופיות השתוו לטמפרטורת החדר, נקו את כיסויי הכיסוי באמצעות אפליקטור כותנה עם קצה כותנה רטוב עם מנקה זכוכית ללא אמוניה. לאחר מכן, השתמש אפליקטור כותנה נקייה עם קצה כותנה רטוב עם 70% אתנול כדי לנקות את כיסוי ולהשאיר אותו יבש.

עבור פורמט 96-well microplate, לאחר שאיפת הבארות כפי שהוכח בעבר, להוסיף 40 microliters של מדיה ללא סרום עם פלואורופור שכותרתו משקל מולקולרי גבוה dextran לבארות, ולאחר מכן לדגור על התאים באינקובטור התא במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, השליכו את המדיה במיקרופלט על ידי הבהוב ידני של הצלחת הפוך לכוס ריקה של חמישה ליטרים, ואז שטפו את התאים ואת המיקרו-לוחית פעמיים על ידי טבילה איטית של הצלחת אנכית בזווית קלה לתוך שני ליטרים מלאה PBS קר כקרח ולאחר מכן השלכת PBS במיקרופלטה על ידי הבהוב הצלחת הפוכה לכוס חמישה ליטר. לאחר שטיפת PBS האחרונה, לתקן את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 3.7% פורמלדהיד ב- PBS לכל באר באמצעות מאגר ריאגנט 25 מיליליטר ופיפטה רב ערוצית.

לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את פתרון הקיבעון ושטוף את התאים עם PBS באמצעות טכניקת הטבילה וההבהוב. לאחר שטיפת PBS השנייה, הכתימו את הגרעינים ב-100 מיקרוליטרים של DAPI ב-PBS לבאר. לאחר 20 דקות, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח כפי שהוכח בעבר.

הסר כל שאריות PBS על ידי הקשה על המיקרו לוחית הפוכה על מגבון ללא מוך. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS טריים לכל באר באמצעות מאגר ריאגנט של 25 מיליליטר ופיפטה רב-ערוצית. לפני ההדמיה, תן לצלחת להשתוות לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לנגב את צלחת תרבית התא יבש עם לנגב ללא מוך.

לחלופין, לאחסן את הצלחת מכוסה הרחק אור בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע אחד. להדמיית מקרופינום אוטומטית, צור פרוטוקול אוטומציה כדי לרכוש את התמונות עם מטרה אווירית פי 40 בערוץ אורך הגל של הפלואורופור וה- DAPI של dextran. לאחר מכן, מטב את הגדרות החשיפה באמצעות מדגם הצפוי להיות ברמה הגבוהה ביותר של macropinocytosis כדי למנוע חשיפה יתר, אשר עלול לגרום לרוויה של האות ואובדן נתוני עוצמה.

השתמש בהגדרות מיקוד המאתרות את המדגם בקלות ובעקביות כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה. השג תמונות מרובות על פני כל באר או כיסוי כדי להסביר את השונות המדגם ולקבל ייצוג מדויק של המדגם. כדי לקבוע את האינדקס המקרו-פינוציטי, הפחת את הרקע עבור ה- DAPI ותמונת dextran המתאימה על-ידי החלת הפונקציה המתאימה, הנקראת לעתים קרובות פונקציית הכדור המתגלגל.

התאם את ההגדרות כך שרעשי הרקע ימוזערו עם אפקט חיסור מינימלי עד ללא השפעת חיסור על ה- DAPI והאות dextran. לאחר מכן, באמצעות שדה עם אות dextran גבוה, לקבוע את הגדרות אות העוצמה, המכונה לעתים קרובות את פונקציית הסף, כדי לבחור את הגרעינים, ולאחר מכן לקבוע את הגדרת אות העוצמה המינימלית הנדרשת כדי לבחור רק את macropinosomes. עבור תמונת dextran, חשב את הפלואורסצנטיות הכוללת בתוך בחירת המקרופאינום שנוצרה או השתמש בבחירה כדי לקבוע את האזור החיובי הכולל עבור dextran.

בתמונת DAPI, השתמשו בבחירה כדי לקבוע את מספר הגרעינים בתמונה כדי לשקף את מספר התאים הקיימים. לאחר מכן קבע את האינדקס המקרו-פינוציטי על-ידי חלוקת הפלואורסצנטיות או האזור הכוללים של דקסטרן לפי מספר התאים שנקבעו על-ידי DAPI. בתאי AsPC-1 PDAK, הוספת EGF ב 100 ננוגרם למיליליטר במשך חמש דקות לפני הוספת dextran מפעילה macropinocytosis.

יתר על כן, הפעלה אוטוקרינית EGF של macropinocytosis יכול להיות מושרה על ידי חסך גלוטמין במשך 16 עד 24 שעות. תאי MIA PaCa-2 מראים macropinocytosis המרכיב אשר מעוכב על ידי טיפול של 30 דקות עם 75 מיקרומולרי EIPA או טיפול של שעתיים עם 10 micromolar EHop-016. בניסוי תגובת מינון, מדד macropinocytic ירד בהדרגה בריכוזים גבוהים יותר של תרופות של EHop-016 ו EIPA, ובכך לאשר את קיומו של מקרופינוציטוזיס תלוי Rac1 המרכיב.

באפשרותך להתאים הליך זה כדי להעריך מקרופינוציטוזה של מטענים מתויגים פלואורסצנטיים אחרים כגון אלבומין. בנוסף, מומלץ להעריך אם ספיגה מקרו-פינוציטית של אלבומין תורמת לכושר התא על ידי ביצוע בדיקות הכדאיות של התא. טכניקה זו הייתה מרכזית לזיהוי של אספקת חומרים מזינים מקרופינוציטים בסרטן ותאי סטרומה והאוטומציה הגדילה מאוד את יכולת בדיקות המצב שלנו.