שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

האכלה מלאכותית ואיסוף רוק מספקים שיטה ישירה לאיתור משפיעים ברוק חרקים. עם זאת, זה לא תואר בפירוט לפני. פרוטוקול זה יעיל לאיסוף רוק מחרקים ספורופיטיים.

בנוסף, זוהי טכניקה פשוטה, כפי שאנו משתמשים בינוני המכיל רק סוכרוז כמו דיאטה מלאכותית. רוק חרקים ספורופיטיים עלול להשפיע על המערכת החיסונית של הפונדקאי לטובת התנהגות האכלה והעברת פתוגנים. תרופה זו שיכולה לשמש להתנהגות חרקים ולמחקר נתיב עצם החרק.

זוהי שיטה פשוטה לביצוע. עם זאת, זה מצביע על הרכבה של סביבה ניסיונית נקייה כמו רוק נאסף למחקר נוסף. התחל על ידי הכנת פתרון 5% סוכרוז לתזונה המלאכותית, ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון כדי להסיר זיהום חיידקים וזיהומים.

להרעיב כ -200 זחלי הופר צמחים חומים קטנים במשך שלוש עד חמש שעות לפני החדרתם לתא האכלה. לאחר מכן, כדי להכין את גלילי הזכוכית כתאי האכלה, לכסות קצה פתוח אחד של התא עם קרום פרפין לפני הצגת החרקים הניסיוניים, ולאחר מכן להעביר את החרקים לתוך גליל זכוכית לכסות את הקצה השני של התא עם קרום פרפין מתוח. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של דיאטה מלאכותית על הממברנה, ולאחר מכן לכסות את הנוזל עם שכבה נוספת של קרום פרפין מתוח.

לבסוף, לכסות את התא עם רדיד אלומיניום, משאיר את הסוף עם מכשיר דיאטה מלאכותית חשוף לאור. לאחר 24 שעות, לאסוף את הרוק SBPH על ידי קירור הגליל בארבע מעלות צלזיוס כדי לשתק את החרקים, ואז לחשוף את הסרט החיצוני ולאסוף את הדיאטה המלאכותית לתוך צינורות סטריליים 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית. שמור את הרוק שנאסף במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.

לאחר מכן, לשטוף את הממברנה הפנימית עם 50 microliters של דיאטה מלאכותית טרי שלוש פעמים על ידי pipetting ברכות, ולאסוף את דיאטת כביסה מלאכותית לתוך צינורות סטריליים 1.5 מיליליטר. לאחר שלוש שטיפות, מוסיפים דיאטה מלאכותית טרייה על הממברנה הפנימית ומניחים קרום פרפין טרי על גבי. לבסוף, לסנן את הדגימות שנאספו באמצעות יחידת מסנן מיקרון 0.22 כדי להסיר חיידקים ומזהמים אחרים.

מעבירים את דגימות הרוק הקולקטיביות במסנן צנטריפוגלי 500 מיקרוליטר, 10 קילודלטון. צנטריפוגה הדגימה. לאסוף את supernatant ולהביא את הנפח הסופי ל 100 microliters.

כדי למדוד את הריכוז של הרוק שנאסף, להפעיל את ספקטרופוטומטר הנראה UV ולשטוף את המעמדים שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפולים. בחרו את האפשרויות על המסך בסדר הבא, חלבונים, חלבון A280. בחר סוג ויחידת ספיגה אחת השווה למיליגרם אחד למיליליטר.

לאחר מכן סמן את התיבה לתיקון בסיסי, 340 ננומטר. לאחר מכן, לטעון שני microliters של 5% תמיסה מימית כמו ריק, ולאחר מכן לגעת ריק בתחתית המסך. לבסוף, לאחר קביעת הסטנדרטים, לטעון שני microliters של הרוק שנאסף ולתעד את ריכוז החלבון.

כאשר ניזונים מ-5% סוכרוז, יותר מ-80% מה-SBPH שרדו בארבעת הימים הראשונים. עם זאת, מהיום החמישי ואילך, התמותה עלתה במהירות ל -40% וביום השביעי, פחות ממחצית SBPH שרד. ניתוח דף SDS הראה את דגימות הרוק המרוכזות מרוק SBPH נגוע RSV הכיל הרבה יותר חלבונים מאשר 5% שליטה שלילית סוכרוז.

בניתוח כתם מערבי לגילוי חלבון קבסיד RSV, חרקים לא נגועים ונמרצים. חלבון קפסיד RSV זוהה בהצלחה במדגם המרץ, נוגדן שתוכנן נגד מוצר הגן LssgMP זיהה חלבון 78 קילודלטון בדגימות לא נגועות ומרץ, והוכיח כי LssgMP הוא חלבון רוק. ניתוח QRT PCR של רמות תעתיק LssgMP ברקמות שונות הראה כי רמות התמליל Lssg בבלוטת הרוק היה גבוה פי 20 מאשר בכל הגוף והמעיים, המאשר את הביטוי הספציפי של LssgMP בבלוטת הרוק.

להרעיב את החרקים הניסיוניים לפני הכנסתם לתאים יש צורך להבטיח את היעילות של אוסף הרוק שלנו. חוץ מזה, מדיום מלאכותי צריך להיות נאסף והחלפה כל 24 שעות כדי להפחית זיהום מיקרוביאלי במדגם שנאסף. טכניקה זו מספקת שיטה ישירה ללמוד את תפקוד הרוק בהעברת פתוגנים.

בנוסף, זה יכול לעזור ללמוד אינטראקציה מארח פתוגן חרקים.