Name: שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: למדו שיטת איסוף רוק מחרקים ממוצאי עשבים באמצעות מזון מלאכותי בסוכרוז. הפרוטוקול מאפשר חקר תפקוד הרוק בהעברת נגיפים ובאינטראקציות מארח-חרק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס '2019YFC1200503), על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס '32072385), ועל ידי האגודה לקידום חדשנות נוער CAS (2021084).

1. תחזוקת SBPH
<ol><li>לגדל את האנשים SBPH ארסיים ללא RSV בחממה זכוכית (65 x 200 מ"מ) עם 5-6 אורז(Oryza sativa cv. Nipponbare) שתילים לכל תא זכוכית במעבדה. לגדל את צמחי האורז ב 25 °C (5 °F) תחת אור 16 שעות / 8 שעות פוטופריוד כהה. הערה: האנשים בעלי החיים הנמרצים והפטורים מ- RSV נתפסו בתחילה במחוז ג'יאנגסו, סין.</li>
	<li>זהה RSV ב- SBPH על ידי בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (dot-ELISA) עם נוגדן פוליקלונלי ספציפי ל- RSV ארנב (ראה טבלה של חומרים) שהועלה כנגד ריבונוקליאופרוטאינים RSV (RNPs). הערה: כדי להבטיח יעילות זיהום גבוהה של צאצאים, נקבות נמרצות נשמרו בנפרד, ו -15% מהצואצאים שלהם נבדקו באופן אקראי לזיהום RSV. הפרטים של dot-ELISA מתוארים בשלבים 1.3-1.7.</li>
	<li>הומוגניזציה SBPH יחיד ב 20 μL של חוצץ ציפוי (0.05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9.5). ספוט 3 μL של כל על קרום ניילון (ראה שולחן של חומרים), ולאחר מכן לייבש את הממברנה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לדגור על הממברנה עם 15 מ"ל של חוצץ חסימה (PBS + 3% חלב דל שומן) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדגור על הממברנה עם ארנב ראשוני מדולל-נוגדנים נגד RSV (1:10000) ב 15 מ"ל של PBS במשך 1 שעה ב RT ולשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות דגירה בכל פעם.</li>
	<li>לדגור על הממברנה עם 1.5 μL של חזרת peroxidase-מצומד עיזים נגד ארנב נוגדנים (ראה טבלה של חומרים)ב 15 מ"ל של PBS לשטוף שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות דגירה בכל פעם.</li>
	<li>לפתח את אימונובלוטים עם ערכת כרומוגנית HRP-DAB משופרת (ראה טבלת חומרים) על פי הפרוטוקולים שסופקו על ידי היצרן.</li>
</ol>2. הכנת תא האכלה ותזונה מלאכותית
<ol><li>שקול 2 גרם של אבקת סוכרוז ולהמיס אותו ב 40 מ"ל של ddH2O כדי להכין 5% תמיסה מימית סוכרוז כמו דיאטה מלאכותית.</li>
	<li>סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר זיהום חיידקים וזיהומים.</li>
	<li>להרעיב 2003 rd-5זחלי SBPH במשך 3-5 שעות לפני הצגתם לתוך התא. הערה: 200 SBPH מוכנים לתא אחד; SBPH יותר צריך להיות מוכן למספר תאים.</li>
	<li>הכינו את גלילי הזכוכית כתאיהאכלה (איור 1A). לכסות קצה פתוח אחד של התא עם קרום פרפין (ראה שולחן של חומרים) לפני הצגת החרקים הניסיוניים. הערה: אורכו של כל גליל הוא 15.0 ס"מ וקוטרו 2.5 ס"מ. גלילי זכוכית אלה מיוצרים בהתאמה אישית בהתאם לדרישה הניסיונית.</li>
	<li>מעבירים חרקים לצילינדר זכוכית.</li>
	<li>לכסות את הקצה השני של התא עם קרום פרפין מתוח (במיוחד, Parafilm M). לאחר מכן, להוסיף 200 μL של דיאטה מלאכותית אליו. לבסוף, לכסות את הנוזל עם שכבה נוספת של קרום פרפין מתוח. הערה: קרום פרפין נמתח בערך להכפיל את האזור המקורי שלה.</li>
	<li>לכסות את התא עם רדיד אלומיניום, אבל להשאיר את הסוף עם מכשיר דיאטה מלאכותית חשוף לאור.</li>
</ol>3. אוסף רוק SBPH
<ol><li>לאסוף דיאטה מלאכותית מ SBPH ללא RSV וארסי בנפרד בסוף 24 שעות.</li>
	<li>מצננים את הגליל ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשתק את החרקים.</li>
	<li>לחשוף את הסרט החיצוני ולאסוף את נוזל דיאטה מלאכותית באמצעות pipette סטרילי לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל. שמור את הרוק שנאסף ב -80 מעלות צלזיוס עד ניתוח. הערה: הרוק שנאסף יכול להיות מאוחסן ב -80 °C (70 °F) למשך שנה אחת.</li>
	<li>יש לשטוף את הממברנה הפנימית ב-50 מיקרו-אל של תזונה מלאכותית טרייה שלוש פעמים על ידי צנרת ברכות, ולאסוף את דיאטת הכביסה המלאכותית כמתואר בשלב 3.3. מניחים את הדיאטה המלאכותית החדשה על הממברנה הפנימית ושומרים על קרום פרפין טרי.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.2 ו- 3.3 למשך 5 ימים עד שבועיים. הערה: לספור את שיעור ההישרדות של האכלה מלאכותית SBPH ולהבטיח תוספת מספקת של SBPH טרי על פי שיעור ההישרדות.</li>
	<li>סנן את הדגימות שנאספו באמצעות יחידת סינון 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חיידקים ומזהמים אחרים.</li>
</ol>4. ריכוז הרוק שנאסף
<ol><li>העבר את דגימות הרוק שנאספו במסנן צנטריפוגלי 0.5 מ"ל 10 kD (ראה טבלת חומרים) ומסתובב ב 5,500 x גרם ב 4 °C (4 °F) במשך 20 דקות. לאסוף את supernatant ולעשות את הכרך הסופי ל 100 μL.</li>
	<li>למדוד את הריכוז של הרוק שנאסף באמצעות ספקטרופוטומטר מתאים UV-Vis בעקבות שלבים 4.3-4.6.</li>
	<li>הפעל את הספקטרופוטומטר ושטוף את ההודים שלוש פעמים עם ddH2O.</li>
	<li>בחרו באפשרויות הבאות על המסך לפי הסדר הנכון: חלבונים | חלבון A280 | בחירת | סוג 1 שרירי בטן = 1 מ"ג / מ"ל. לאחר מכן, סמן את תיבת הסימון תיקון בסיסי 340 ננומטר.</li>
	<li>טען 2 μL של 5% תמיסה מימית סוכרוז ריק, לגעת ריק בתחתית המסך.</li>
	<li>לאחר קביעת סטנדרטים, לטעון 2 μL של הרוק שנאסף למדידה. קרא ותיעד את ריכוז החלבון. הערה: 1 מ"ג של חלבוני רוק נאספו סוף סוף בסך הכל לפחות.</li>
</ol>5. כתמי כסף של חלבוני רוק
<ol><li>לחלץ חלבון מדגימות רוק חרקים באמצעות חוצץ טעינה מדגם (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% גליסול, 2% SDS, 0.1% ברומופנול כחול, ו 1% β-mercaptoethanol). לאחר מכן, חלק אותו ב- 10% SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים). לטעון את הפתרון 5% סוכרוזאקי יטופל באותו אופן כמו שליטה שלילית.</li>
	<li>טען aliquot 20 μL של המדגם על ג'ל SDS-PAGE לצד סמן מראש. הפעל את הג'ל במשך 15 דקות ב 90 וולט, ולאחר מכן 50 דקות ב 140 וולט.</li>
	<li>תקן את הג'ל ב 30% (vol/vol) אתנול, 10% (vol/vol) חומצה אצטית במשך לפחות 30 דקות לאחר אלקטרופורזה.</li>
	<li>לשטוף את הג'ל פעמיים עם 20% (vol/vol) אתנול ומים בנפרד במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>רגישים את הג'ל ב 0.8 מ"מ נתרן thiosulfate במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים במים במשך 1 דקות בכל פעם.</li>
	<li>לטבול את הג'ל חנקתי כסף 12m לפחות 1 שעות, ולאחר מכן לטבול אותו במים deionized במשך 10 s לפני העברתו לפתרון המפתח.</li>
	<li>כאשר הרקע של הג'ל מחשיך, לטבול את הג'ל בתמיסת עצירה (5% חומצה אצטית) במשך 30 דקות לפחות כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>לשטוף את הג'ל פעמיים עם מים במשך 30 דקות בכל פעם. פיתוח התמונה באמצעות מערכת הזיהוי (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>6. זיהוי חלבונים על ידי סופג מערבי
<ol><li>לזהות את החלבון דמוי mucin הרוק של SBPH (LssgMP) ו RSV על ידי כתמים מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים, בהתאמה.</li>
	<li>לטפל דגימות רוק חרקים בעקבות שלב 5.1.</li>
	<li>לטעון aliquot 20 μL של המדגם על ג'ל SDS-PAGE 10% לצד סמן prestained ו 20 μL RSV דגימת רוק לא נגוע כמו שליטה שלילית. הפעל את הג'ל במשך 15 דקות ב 90 וולט, ולאחר מכן במשך 50 דקות ב 140 וולט.</li>
	<li>יש לערבב 100 מ"ל של חיץ העברת חלבונים 10x (רטוב) (ראה טבלת חומרים)עם 900 מ"ל של ddH2O לתמיסת עבודה (1x), ולאחר מכן להעביר חלבונים לקרום דיפלואוריד פוליווינילידן באמצעות מאגר העברת חלבונים (1x).</li>
	<li>לחסום את הממברנה ב 5% חלב רזה עם 0.01 M תמיסת מלח חוצצת טריס עם 0.05% Tween 20 (TBST) בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 שעה. הערה: בפרוטוקול זה, לערבב 100 מ"ל של 10x TBST (ראה טבלת חומרים) עם 900 מ"ל של ddH2O לתוך פתרון העבודה.</li>
	<li>לדגור על הממברנה עם נוגדני ארנב ראשוניים נגד RSV או LssgMP (שניהם 1:10000) מדולל ב- TBST ב- RT לפחות 2 שעות. הערה: הייצור של נוגדנים ראשוניים נגד RSV הוזכר לעיל. חברת ביוטכנולוגיה ייצרה את הנוגדן הפוציקלוני נגד LssgMP נגד פפטיד LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.</li>
	<li>לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST במשך 10 דקות של דגירה בכל פעם.</li>
	<li>לדגור על הממברנה עם נוגדני עזים מצומדים נגד ארנבות מחוסלבים ב-1:10000 TBST.</li>
	<li>לפתח את החיסון עם מערכת זיהוי סופג מערבית chemiluminescence משופרת.</li>
</ol>7. זיהוי תבנית ביטוי LssgMP ב- SBPH
<ol><li>לשתק את החרקים ב 4 °C (5 דקות).</li>
	<li>לשטוף את החרקים עם 75% אתנול ו ddH2O אחד אחד, ולאחר מכן לנתח את החרקים TBS צונן מראש (0.01 M טריס חוצץ מלוחים).</li>
	<li>לנתח את החרקים מהבטן תוך ניתוק הבחירה של SBPH במפרק קוקסה-טרוכנוטר על ידי מלקחיים; לשטוף את midgut ואת בלוטות הרוק פעמיים ב TBS כדי להסיר כל זיהום מן ההמולימפה.</li>
	<li>שים חמש רקמות לתוך צינור 1.5 מ"ל ללא RNase כדי לחלץ RNA. שקול כל צינור כדוגמה אחת.</li>
	<li>בצע מיצוי RNA בהתאם לפרוטוקולי היצרן ו- PCR הפוך-תמלול (RT-PCR) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע כמותית בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לחקור את רמות ביטוי התמליל היחסי של LssgMP בתמציות של כל הגוף או רקמות שונות של L. striatellus. הערה: זוגות פריימר המשמשים להגברת גנים היו LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, QPCR מבוסס ירוק SYBR בוצע על פי פרוטוקול היצרן. רמת התמליל של גורם התארכות התרגום של L. striatellus 2 (ef2) כותמה עם זוג פריימר ef2-q-F/ef2-q-R לנורמליזציה של תבניות cDNA. ורצפי הפריימר מצורפים להלן:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, X., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+of+molecular+interactions+between+rice+and+the+brown+planthopper%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.</a> Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).</li>
<li>Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+insights+into+research+on+Rice+Stripe+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Pathology+Journal%22%5BJournal%5D)">Current insights into research on Rice Stripe Virus.</a> The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).</li>
<li>He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+rice+stripe+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of rice stripe virus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+NS4+of+Rice+Stripe+Virus+plays+a+critical+role+in+viral+spread+in+the+body+of+vector+insects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects.</a> PLoS One. 9 (2), 88636(2014).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949(2014).</li>
<li>Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asian+citrus+psyllid+RNAi+pathway-RNAi+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence.</a> Scientific Reports. 6, 38082(2016).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+feeding+Rice+Stripe+Virus+enables+efficient+virus+infection+of+Laodelphax+striatellus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus.</a> Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909(2018).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+Stripe+Virus+hitchhikes+the+vector+insect+vitellogenin+ligand-receptor+pathway+for+ovary+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312(2019).</li>
<li>Bao, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+intestine-specific+transcriptome+of+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+revealed+potential+functions+in+digestion%2C+detoxification+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response.</a> Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).</li>
<li>Elzinga, D. A., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+effectors+in+plant-aphid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of protein effectors in plant-aphid interactions.</a> Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).</li>
<li>Bos, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomics+approach+identifies+candidate+effectors+from+the+aphid+species+Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid).</a> PLoS Genetics. 6 (11), 1001216(2010).</li>
<li>Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+secreted+watery+saliva+proteins+of+the+rice+brown+planthopper%2C+Nilaparvata+lugens+%28St%C3%A5l%29+by+transcriptome+and+Shotgun+LC-MS%2FMS+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach.</a> Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).</li>
<li>Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-induced+interactions+between+two+rice+planthoppers%2C+Nilaparvata+lugens+and+Sogatella+furcifera+%28Hemiptera%3A+Delphacidae%29%3A+effects+on+feeding+and+honeydew+excretion%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion.</a> Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).</li>
<li>De Vos, M., Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myzus+persicae+%28green+peach+aphid%29+salivary+components+induce+defence+responses+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+immune+system+architecture+and+transcriptome+responses+to+southern+rice+black-streaked+dwarf+virus+in+Sogatella+furcifera%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera.</a> Scientific Reports. 6, 36254(2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+into+rice+tissues+by+brown+planthopper+and+fine+structure+of+the+salivary+sheaths%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armet+is+an+effector+protein+mediating+aphid-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).</li>
<li>Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GroEL+from+the+endosymbiont+Buchnera+aphidicola+betrays+the+aphid+by+triggering+plant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).</li>
<li>Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+defense+mechanism+in+wheat+by+polyphenol+oxidase+from+aphid+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).</li>
<li>Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clock+genes+show+circadian+rhythms+in+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Clock genes show circadian rhythms in salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-like+protein%2C+a+saliva+component+involved+in+brown+planthopper+virulence+and+host+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).</li>
<li>Shangguan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mucin-like+protein+of+planthopper+is+required+for+feeding+and+induces+immunity+response+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants.</a> Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).</li>
<li>Petrova, A., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+a+brown+planthopper+%28Nilaparvata+lugens+St%C3%A5l%29+salivary+catalase-like+protein+into+tissues+of+rice%2C+Oryza+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa.</a> Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+small+brown+planthopper%2C+Laodelphax+striatellus%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus.</a> GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).</li>
<li>Van Bel, A. J., Will, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evaluation+of+proteins+in+watery+and+gel+saliva+of+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1840(2016).</li>
<li>Perez-Vilar, J., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+assembly+of+secreted+mucins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The structure and assembly of secreted mucins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).</li>
<li>Pitino, M., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphid+protein+effectors+promote+aphid+colonization+in+a+plant+species-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Zhang, F., Zhu, L., He, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+response+to+brown+planthopper+feeding+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice.</a> Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vat%2C+an+amazing+gene+conferring+resistance+to+aphids+and+viruses+they+carry%3A+from+molecular+structure+to+field+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects.</a> Frontiers In Plant Science. 7, 1420(2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

גידול מוצלח של חרקים על דיאטות מלאכותיות דווח לראשונה בשנת 1962 כאשר מיטלר ואבא תיארו את טכניקת קרום פרפין להחזיק דיאטה מלאכותית29,30. שיטה זו נחקרה בהיבטים רבים של ביולוגיה והתנהגות חרקים, למשל, תוספת תזונתית, האכלת dsRNA, ורכישת וירוסים. בהתבסס על הדרישות של ניתוח רוק, 5% סוכרוז משמש דיאטה מלאכותית כללית כדי לאסוף רוק של SBPH במחקר זה. עבור איסוף רוק מוצלח, כמה צעדים קריטיים ראויים לציין כאן. ראשית, להרעיב את החרקים הניסיוניים לפני החדרתם לתא יש צורך להבטיח את ...

וירוס פסים אורז (RSV), וירוס RNA שלילי תקוע בסוג Tenuivirus, גורם למחלות קשות בייצור אורז במזרח אסיה1,2,3. העברת RSV מצמחי אורז נגועים לבריאים תלויה בווקטורים של חרקים, בעיקר לאודלפקס סטריאטלוס, המעביר RSV באופן מתמשך-מפיץ. SBPH רוכש את הנגיף לאחר האכלה על צמחים נגועים RSV. ברגע שבתוך החרק, RSV מדביק את תא האפיתל midgut יום אחד לאחר האכלה ולאחר מכן עובר דרך מחסום midgut לחדור המולימף. לאחר מכן, RSV מתפשט לתוך רקמות שונות באמצעות ההמולימפה ולאחר מכן מתפשט. לאחר תקופה סמויה של כ 10-14 ימים לאחר הרכישה, הנגיף בתוך בלוטת הרוק יכול להיות מועבר לצמחים המארחים בריאים באמצעות הרוק המופרש בעוד SBPH מוצץ sap מן phloem4,5,6,7,8,9,10 . תהליך האכלה יעיל וגורמים שונים ברוק חיוניים להתפשטות RSV מהחרק לצמח המארח.
רוק חרקים המופרש על ידי בלוטות הרוק הוא האמין לתווך חרקים, וירוסים, צמחים מארחים. חרקים Hemipteran בדרך כלל לייצר שני סוגים של רוק: רוק ג'לינג ורוק מימי11,12,13. רוק גלינג מופרש בעיקר לתוך apoplasm כדי לקיים את התנועה של stylet בין תאים מארחים והוא קשור גם להתגברות על התנגדות הצמח ותגובות חיסוניות14,15,16,17. בשלב החיטוט של האכלה, חרקים מפרישים לסירוגין רוק ג'לינג שמיד מתחמצן ויוצר אוגן על פני השטח. לאחר מכן, נדן יחיד או מסועף עטוף את הסגנון כדי להזמין ערוץ צינורי18,19,20. אוגן פני השטח על האפידרמיס הוא הניח כדי להקל על חדירה של stylet על ידי משמש כנקודת עיגון, בעוד נדן סביב stylet עשוי לספק יציבות מכנית סיכה16,21,22,23. Nlshp זוהה כחלבון חיוני להיווצרות נדן הרוק והאכלה מוצלחת של צמח חום(Nilaparvata lugens,BPH). עיכוב הביטוי של חלבון הנדן המבני (SHP) המופרש על ידי pisum Acyrthosiphon כנימות הפחית את הרבייה שלה על ידי שיבוש האכלה מצינורות מסננת מארח24. יתר על כן, בכמה מינים חרקים, גורמי רוק ג'ל אמורים לעורר תגובות חיסוניות צמח על ידי יצירת מה שנקרא דפוסים מולקולריים הקשורים אוכלי עשב (HAMPs). ב N. lugens, NlMLP, חלבון דמוי מוצין הקשור להיווצרות נדן, גורם להגנות צמחים מפני האכלה, כולל מוות תאים, ביטוי של גנים הקשורים להגנה, ותצהיר callose 25,26. כמו כן, כמה גורמי רוק ג'ל כנימות הוכחו לעורר תגובות הגנה צמחית באמצעות אינטראקציות בין גנים לגן דומה דפוסים מולקולריים הקשוריםפתוגן 12,15,27.
לחקר גורמי הרוק החיוניים להאכלת חרקים ו/או להעברת פתוגן, יש צורך לנתח רוק מופרש. כאן, שיטות האכלה ואיסוף מלאכותיות כדי להשיג כמויות מספיקות של רוק מתוארים לניתוח נוסף. באמצעות מדיום המכיל רק אלמנט תזונתי אחד, חלבוני רוק רבים נאספו ונותחו על ידי כתמי כסף וכתמים מערביים. שיטה זו תהיה מועילה במחקר נוסף על גורמים ברוק כי הם חיוניים להעברת RSV על ידי SBPH.

<table><tbody><tr><td>מסנן צנטריפוגלי 10-KD</td><td>Merck Millipore</td><td>R5PA83496</td><td>לריכוז</td></tr><tr><td>10x מאגר העברת חלבון (רטוב)</td> <td>macGENE</td><td>MP008</td><td>מאגר העברה לספיגה מערבית</td></tr><tr><td>10x TBST מאגר</td><td>Coolaber</td><td>SL1328-500mL&times; 10</td><td>מאגר כביסה לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>Azure c600 biosystems</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure c600</td><td>מערכת הדמיה לכתמים מערביים וצביעה</td></tr><tr><td>בכסף סולם חלבון צבוע בצבע</td><td>GenStar</td><td>M221-01</td><td>סמן חלבון לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>ECL&nbsp; ריאגנטים לזיהוי כתמים מערביים</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2209</td><td>זיהוי כתמים מערביים</td></tr><tr><td>ערכה כרומוגנית HRP-DAB מכושפת</td><td>TIANGEN</td><td></td>#PA110 <td>תגובה כרומוגנית</td></tr> חזרת <tr><td>פרוקסידאז מצומד עזים נוגדנים נגד ארנב</td><td>סיגמא</td><td>401393-2ML</td><td>נוגדן משני פוליקלונלי לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>Immobilon(R)-P ממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד</td><td>Merck ממברנת העברת IPVH00010 Millipore</td><td></td><td>לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725125</td><td>לערכת PCR כמותית בזמן אמת (qRT-PCR),</td></tr> <tr><td>iSCRIPT cDNA SYNTHES</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>ל-PCR שעתוק הפוך (RT-PCR)</td></tr><tr><td>מסנן Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>לסינון</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAB TGX ג'לים</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td>עבור SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>איתור ריכוז חלבון</td></tr><tr><td>קרום ניילון</td><td>PALL</td><td>T42754</td><td>ממברנה עבור dot-ELISA</td></tr><tr><td>Parafilm M ממברנה</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>ביצוע דיאטה מלאכותית כריכים</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-LssgMP נוגדן פוליקלונלי נגד פפטידים LssgMP</td><td>Genstript</td><td></td><td>Rabbit נוגדן פוליקלונלי ראשוני נגד LssgMP לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-RSV נוגדן פוליקלונלי</td><td>Genstript</td><td></td><td>Rabbit נוגדן פוליקלונלי ראשוני נגד RSV לכתמים מערביים ו-dot-ELISA</td></tr><tr><td>RNAprep טהור מיקרו קיט</td><td>TIANGEN</td><td>DP420</td><td>למיצוי RNA</td></tr></tbody></table>

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

וירוס פס האורז (RSV), שגורם לאובדן כלכלי משמעותי של החקלאות במזרח אסיה, תלוי לחלוטין בווקטורים של חרקים להעברתו האפקטיבית בקרב אורז מארח. לאודלפקס סטריאטלוס (באנגלית: Laodelphax striatellus) הוא וקטור החרקים העיקרי המעביר אופקית RSV תוך מציצת שרף מהפלום. הרוק ממלא תפקיד משמעותי בהתנהגות ההאכלה של החרקים. שיטה נוחה שתהיה שימושית למחקר על רוק חרקים עם התנהגות האכלה מוצצת פירסינג מתוארת כאן. בשיטה זו, חרקים הורשו לאכול על דיאטה מלאכותית בין שתי שכבות סרט פרפין מתוח. הדיאטה המכילה את הרוק נאספה מדי יום, מסוננת ומרוכזת לניתוח נוסף. לבסוף, איכות הרוק שנאסף נבדקה על ידי כתמי חלבון וחיסון. שיטה זו באה לידית על ידי זיהוי נוכחות של RSV וחלבון דמוי מוצין ברוק של SBPH. שיטת האכלה מלאכותית ואיסוף רוקים אלה תכשיר בסיס למחקר נוסף על גורמים ברוק חרקים הקשורים להתנהגות האכלה ולהעברת וירוסים.

שרטוטים של התקנת הזנה מלאכותית ואיסוף רוק איור 1A מתאר את גליל הזכוכית (15 ס"מ על 2.5 ס"מ) המשמש כתא האכלה לאיסוף הרוק. ראשית, זחלי SBPH היו מורעבים במשך כמה שעות כדי לשפר את יעילות האיסוף ולאחר מכן משותק על ידי צינון במשך 5 דקות. לאחר החרקים הועברו לתוך גליל זכוכית, שני הקצוות הפתוחים של התא היו מכוסים קרום פרפין מתוח. בקצה אחד, 200 μL של 5% סוכרוז היה תקוע בין שתי שכבות של קרום פרפין מורחב לכפול השטח המקורי שלה(איור 1B). התא היה מכוסה בנייר...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

האכלה מלאכותית ואיסוף רוק מספקים שיטה ישירה לאיתור משפיעים ברוק חרקים. עם זאת, זה לא תואר בפירוט לפני. פרוטוקול זה יעיל לאיסוף רוק מחרקים ספורופיטיים.בנוסף, זוהי טכניקה פשוטה, כפי שאנו משתמשים בינוני המכיל רק סוכרוז כמו דיאטה מלאכותית. רוק חרקים ספורופיטיים עלול להשפיע על המערכת החיסונית של הפונדקאי לטובת התנהגות האכלה והעברת פתוגנים. תרופה זו שיכולה לשמש להתנהגות חרקים ולמחקר נתיב עצם החרק.זוהי שיטה פשוטה לביצוע. עם זאת, זה מצביע על הרכבה של סביבה ניסיונית נקייה כמו רוק נאסף למחקר נוסף. התחל על ידי הכנת פתרון 5% סוכרוז לתזונה המלאכותית, ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון כדי להסיר זיהום חיידקים וזיהומים.להרעיב כ -200 זחלי הופר צמחים חומים קטנים במשך שלוש עד חמש שעות לפני החדרתם לתא האכלה. לאחר מכן, כדי להכין את גלילי הזכוכית כתאי האכלה, לכסות קצה פתוח אחד של התא עם קרום פרפין לפני הצגת החרקים הניסיוניים, ולאחר מכן להעביר את החרקים לתוך גליל זכוכית לכסות את הקצה השני של התא עם קרום פרפין מתוח. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של דיאטה מלאכותית על הממברנה, ולאחר מכן לכסות את הנוזל עם שכבה נוספת של קרום פרפין מתוח.לבסוף, לכסות את התא עם רדיד אלומיניום, משאיר את הסוף עם מכשיר דיאטה מלאכותית חשוף לאור. לאחר 24 שעות, לאסוף את הרוק SBPH על ידי קירור הגליל בארבע מעלות צלזיוס כדי לשתק את החרקים, ואז לחשוף את הסרט החיצוני ולאסוף את הדיאטה המלאכותית לתוך צינורות סטריליים 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית. שמור את הרוק שנאסף במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.לאחר מכן, לשטוף את הממברנה הפנימית עם 50 microliters של דיאטה מלאכותית טרי שלוש פעמים על ידי pipetting ברכות, ולאסוף את דיאטת כביסה מלאכותית לתוך צינורות סטריליים 1.5 מיליליטר. לאחר שלוש שטיפות, מוסיפים דיאטה מלאכותית טרייה על הממברנה הפנימית ומניחים קרום פרפין טרי על גבי. לבסוף, לסנן את הדגימות שנאספו באמצעות יחידת מסנן מיקרון 0.22 כדי להסיר חיידקים ומזהמים אחרים.מעבירים את דגימות הרוק הקולקטיביות במסנן צנטריפוגלי 500 מיקרוליטר, 10 קילודלטון. צנטריפוגה הדגימה. לאסוף את supernatant ולהביא את הנפח הסופי ל 100 microliters.כדי למדוד את הריכוז של הרוק שנאסף, להפעיל את ספקטרופוטומטר הנראה UV ולשטוף את המעמדים שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפולים. בחרו את האפשרויות על המסך בסדר הבא, חלבונים, חלבון A280. בחר סוג ויחידת ספיגה אחת השווה למיליגרם אחד למיליליטר.לאחר מכן סמן את התיבה לתיקון בסיסי, 340 ננומטר. לאחר מכן, לטעון שני microliters של 5% תמיסה מימית כמו ריק, ולאחר מכן לגעת ריק בתחתית המסך. לבסוף, לאחר קביעת הסטנדרטים, לטעון שני microliters של הרוק שנאסף ולתעד את ריכוז החלבון.כאשר ניזונים מ-5% סוכרוז, יותר מ-80% מה-SBPH שרדו בארבעת הימים הראשונים. עם זאת, מהיום החמישי ואילך, התמותה עלתה במהירות ל -40% וביום השביעי, פחות ממחצית SBPH שרד. ניתוח דף SDS הראה את דגימות הרוק המרוכזות מרוק SBPH נגוע RSV הכיל הרבה יותר חלבונים מאשר 5% שליטה שלילית סוכרוז.בניתוח כתם מערבי לגילוי חלבון קבסיד RSV, חרקים לא נגועים ונמרצים. חלבון קפסיד RSV זוהה בהצלחה במדגם המרץ, נוגדן שתוכנן נגד מוצר הגן LssgMP זיהה חלבון 78 קילודלטון בדגימות לא נגועות ומרץ, והוכיח כי LssgMP הוא חלבון רוק. ניתוח QRT PCR של רמות תעתיק LssgMP ברקמות שונות הראה כי רמות התמליל Lssg בבלוטת הרוק היה גבוה פי 20 מאשר בכל הגוף והמעיים, המאשר את הביטוי הספציפי של LssgMP בבלוטת הרוק.להרעיב את החרקים הניסיוניים לפני הכנסתם לתאים יש צורך להבטיח את היעילות של אוסף הרוק שלנו. חוץ מזה, מדיום מלאכותי צריך להיות נאסף והחלפה כל 24 שעות כדי להפחית זיהום מיקרוביאלי במדגם שנאסף. טכניקה זו מספקת שיטה ישירה ללמוד את תפקוד הרוק בהעברת פתוגנים.בנוסף, זה יכול לעזור ללמוד אינטראקציה מארח פתוגן חרקים.

two-layered-membrane-sandwich-method-for-laodelphax-striatellus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זמן ומרחב ביטוי ניתוח גנטי תפקיד מכריע גנומיקה תפקודית. כל...

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

אוסף של hemolymph לתקתק נגוע, בלוטות הרוק, ורוק חשוב ללמוד איך לתקתק נישאים פתוגנים לגרום למחלה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לאסוף את בלוטות הרוק hemolymph ו מ...

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

סרטון זה מתאר את בלוטת הלימפה דרוזופילה – האתר העיקרי של המטופויזיס בזחל הזבוב – ומציג פרוטוקול לדוגמה לניתוח והרכבה של האיבר לצורך אימונוהיסטוכימיה והדמיה פלואורסצנטית.

דיסקציה של בלוטת הלימפה בזחל: בידוד האיבר המייצר המוציטים של דרוזופילה

אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.

הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים

באקלים הנוכחי של משאבים נדירים, צצות טכנולוגיות חדשות המאפשרות לחוקרים לבצע מחקרים זולים יותר, מהירים יותר ומדויקים יותר. כאן אנו מתארים את הפיתוח של בדיקה חיסונית מרובת נוגדנים מבוססי רוק מבוססת חרוזים למדידת חשיפה אנושית למספר פתוגנים סביבתיים בו זמנית.

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

תסיסנית ומערכות hematopoietic יונקים חולקים הרבה מאפיינים משותפים, מה שהופך תסיסנית מודל גנטי אטרקטיבי ללמוד hematopoiesis. כאן אנו מדגימים לנתיחת הרכבה של איבר hematopoietic הגדול זחל אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, אנו מתארים שיטות Assay שונים תאי hematopoietic זחל כולל hemocytes במחזור ותאי קריסטל נייחים.

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

מוצגת כאן שיטה להאכלת קרציות במבחנה באמצעות מערכת ממברנות מלאכותית המאפשרת גודש חלקי או מלא של מגוון שלבי חיים של הקרציות.

קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף רוק, המולימפה, בלוטות הרוק והמעי האמצעי, לאחר דיסקציה של קרצייה בודדת שניזונה, כדי לחקור לוקליזציה ספציפית לרקמה של פתוגנים הנישאים על ידי קרציות כדי לקדם את ההבנה של יכולת הווקטור ואינטראקציות פתוגן-מיקרוביום.

מיצוי רוק, המולימפה, בלוטות רוק ומעי תיכון מקרציות בודדות (Acari: Ixodidae)

למדו שיטת איסוף רוק מחרקים ממוצאי עשבים באמצעות מזון מלאכותי בסוכרוז. הפרוטוקול מאפשר חקר תפקוד הרוק בהעברת נגיפים ובאינטראקציות מארח-חרק.

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

גלה סרטונים נוספים