ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה חזקה לניתוח כלי עבודה אלקטרוניים ברמה התאית, וגישה מעשית לספיגת EV יעילה וניתוח מעקב אחר EV. שיטה זו של תיוג EV מבטלת משקעים משותפים של EVs וצבע, ובכך לשפר את אותות EV. ספיגת EV נמדדת על ידי ניתוח נפחי כדי להבחין בין EVs מופנמים מן EVs השטחי.

רכבים ים הם מטענים פעילים, ולכן, ספיגתם מאפשרת העברה של מולקולות ביוכימיות. למחקר על משלוח תרופות מבוססות EV וטיפול בסרטן, טכניקה זו יכולה להיות כלי הערכה. ספיגת EV ממלאת תפקיד בתקשורת בין-תאית ונחקרת בתחומי מחקר שונים, כגון ביולוגיה של סרטן, מדעי המוח ואספקת תרופות.

פרוטוקול זה עשוי להקל על ספיגת EV יעילה. לבידוד של שלל חוץ-תאי, או רכבים אלקטרוניים, הזריקו מיליליטר אחד של מדיה של תרבית תאים מעובדת מראש לתא המדגם של התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון. כדי להפעיל את ההתקן, סובב את ההתקן במכונת הספינינג של הספסל במהירות של 3000 סל"ד למשך 10 דקות.

לאחר ספינינג, להסיר את הנוזל מתא הפסולת על ידי pipetting או שאיפה, ולאחר מכן לחזור על הליך זה פעמיים לעיבוד שני מיליליטר נוספים של מדיה תרבות התא. לאחר מכן, כדי לשטוף את EVs מבודד, להזריק מיליליטר אחד של PBS לתוך תא המדגם ולסובב את המכשיר במכונת ספינינג הספסל. עבור תיוג חיסוני של כלי ה-EV, הזריקו מיקרוגרם אחד למיליליטר של הנוגדן הספציפי EV לחור ההצתה של המכשיר המכיל 100 מיקרוליטרים של כלי הפעלה אלקטרוניים מבודדים.

לאחר מכן לדגור במשך שעה אחת בחושך על שייקר צלחת כדי להבטיח את ההפצה הזוגית של הנוגדן על פני המדגם. לאחר מכן, חבר סרט הדבקה לחור ההתחמקות. הזריקו מיליליטר אחד של PBS לתא הדגימה כדי לשטוף את שאריות הנוגדנים, ואז לסובב את המכשיר עד תא המדגם ריק.

חזור על הכביסה על ידי הזרקת מיליליטר אחר של PBS לתוך תא המדגם, ומסובב את המכשיר כפי שהודגם בעבר. לאחר הסרת שאריות הנוזל מהתא, pipette את EVs תווית פלואורסצנטית מתא הממברנה לתוך צינור ענבר או צינור מיקרו. הגן על הצינור מפני אור עד לשימוש.

זרע ארבע פעמים 10 לתאי PC3 הרביעי לתוך צלחת 35 מיליליטר עם מדיה מיליליטר אחד. אפשר לתאים לדבוק בן לילה בתנאי תרבית תאים אופטימליים. למחרת, לשטוף את התאים דבק פעמיים עם מדיה exosome-מרוקן.

לאחר דילול רכבים אלקטרוניים עם תווית פלואורסצנטית לריכוז המתאים באמצעות מדיה מרוקנת אקסוזום, הוסיפו את כלי העבודה האלקטרוניים המדוללים לתאי היעד הדבוקים ודגרו לזמן הניסיוני הרצוי. לאחר הסרת רכבים אופניים לא מופנמים על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים עם מדיה נטולת אקסוזומים, סמן את הציטופלסמה של התאים הדבוקים במיקרוגרם אחד למיליליטר של CMTMR, ודגרה בתנאי תרבית תאים אופטימליים. להדמיית תאים חיים, הניחו את התאים המוכנים באינקובטור על הבמה.

לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה בהתבסס על דגימות בקרה, קבע את עומק תאי היעד ואת טווח גודל הערימה בכיוון Z כדי לרכוש תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות, ולאחר מכן הגדר את רכישת התמונה לתמונות מרובות של צבע ספציפי לתא וצבע ספציפי ל- EV בו-זמנית. לעיבוד תמונה, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה אוטומטית. כדי לבנות משטחים וירטואליים של התאים, לחץ על הוסף משטחים חדשים.

כדי לקבוע את התצורה של משטחי התא הווירטואלי, לחץ על לחצן הוסף ובחר איכות כסוג המסנן. סף את הערך המתאים עבור המגבלה הנמוכה על-ידי בדיקה חזותית, הגדר את הערך המרבי עבור הגבול העליון ולחץ על לחצן סיום הבא, כדי לבנות את הנקודות הווירטואליות של ה- EVs, לחץ על הלחצן הוסף כתמים חדשים. תחת הגדרות אלגוריתם, בחר גדלי ספוט שונים וחישוב המרחק הקצר ביותר ולאחר מכן לחץ על הבא ובחר ערוץ 1 Alexa Fluor 488 כערוץ המקור.

הזינו את הערך המתאים לקוטר XY המשוער תחת 'זיהוי ספוט' ולחצו על הבא. כדי לקבוע את התצורה של נקודות EV וירטואליות, לחץ על לחצן הוסף ובחר איכות כסוג המסנן. הגדר את הסף התחתון על-ידי בדיקה חזותית ולחץ על הבא עבור סוג אזורי ספוט, בחר עוצמה מוחלטת ולאחר מכן לחץ על הבא.

כדי לסף את האזור של נקודות EV, הזן את הערך המתאים עבור סף אזור על-ידי בדיקה חזותית. בחר קוטר מתחת לאמצעי אחסון באזור ולחץ על סיום. כדי לפצל את הנקודות המקובצות בתוך המשטח הבנוי, לחץ על בניית כתמים ועבור למסננים.

לאחר מכן לחצו על הלחצן 'הוסף' ובחרו 'המרחק הקצר ביותר למשטחים', 'משטחים משטחים 1' כסוג המסנן. לאחר הגדרת הסף הנמוך ביותר עבור המגבלה הנמוכה ואת הערך המתאים עבור הגבול העליון, לחץ על המקטע שכפל ללחצן כתמים חדש. לספירה אוטומטית של כלי עבודה חדשים בתוך התאים, לחצו על הבחירה 'נקודות מובנות 1', עבורו לסטטיסטיקה ויצאו את הערך ממספר הנקודות הכולל.

כדי להשיג את מספר התאים, לחץ על המשטחים הבנויים 1 ולאחר מכן עבור אל סטטיסטיקה וייצוא הערך של המספר הכולל של משטחים מתוך כולל. לבסוף, עבור לכרטיסיה מפורט תחת סטטיסטיקה כדי לייצא את אמצעי האחסון. רכבים נטויים שבודדו ממדיית תרבית תאים PC3 באמצעות התקן מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון תויגו בנוגדן ספציפי ל-EV מצומד פלואורו-4, ודמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית.

ה- EVs שהופנמו הוצגו כנוקטה ועיבוד EV.Post בודד של תמונות אלה מאפשר הדמיה וכימות של הפנמת EV לתאים. תוצאות ספיגת EV מצביעות על כך שרמת ספיגת EV תלויה באורך תקופת הדגירה. ניתן לנרמל את מספר ה- EVs הפנמיים לאמצעי האחסון של תא הנמען כדי לקבוע את הקצב בפועל של ספיגת EV עבור התא שצוין.

הליך זה מאפשר אי-הכללה שיטתית של כלי הפעלה אלקטרוניים שאינם מופנמים כדי למדוד במדויק את מספר כלי ה-EV המופנמים. התפלגות הגודל של נקודות EV מופנמות מוצגת כאן. אז השלבים העיקריים הם ניצול של המכשיר microfluidic עבור תיוג EV, מזעור של פלואורסצנטיות רקע בעת הדמיית EVs פלורסנט, ולאחר מכן ניתוח שלאחר הדמיה כדי לקבוע פנים לעומת EVs שטחי.

אז מעקב EV תאי יכול להתבצע בזמן אמת על מישור 3D, ובנוסף, ניתוח סחר EV על רזולוציות מרחביות / זמניות ואת לוקליזציה משותפת של רכבים EVs עם אברונים תת-תאיים ניתן להשיג. אז אנחנו מאמינים שטכניקה זו מספקת דרך קלה ויעילה יותר לחקור את ה- EVs בתוך מטריצות פנים-תאיות לחוקרים בתחום התקשורת הסלולרית עבור EVs.