רצף הכנסה טרנספוסון ככלי להבהב גורמי קולוניזציה חיידקיים בבורקהולדריה גלדיולי סימביונט של לגריה וילוסה בילס

פרוטוקול זה שימושי לביצוע מניפולציה גנטית על חיידקים סימביוטיים, במקרה זה, במיוחד על Burkholderia, וזיהוי הגנים החיוניים ליישב מארח חרקים. רצף החדרת טרנספוסון הוא כלי רב עוצמה לזיהוי מספר רב של גנים חיוניים מותנים בו זמנית בניסוי יחיד. התחל על ידי חיסון תרבות תורם טרי של תורם E.coli ב 10 מיליליטר של מדיום LB בתוספת Kanamycin ו DAP תחת מכסה המנוע סטרילי.

זן גלדיולי בורקהולדריה מסורס תאי נמען בחמישה מיליליטר של בינוני KB. לדגור על התרבויות ב 30 מעלות צלזיוס לילה על שייקר ב 250 סל"ד. לאחר צמיחה של לילה, צנטריפוגה ארבעה מיליליטר של כל אחת מהתרבויות ב 9, 600 פעמים G במשך שש דקות כדי כדורי התאים ולהשליך את supernatant.

מתחת למכסה המנוע הסטרילי, יש לשטוף את תרביות התאים המנושלים במדיום KB המכיל DAP. ולבסוף, resuspend התרבויות בנפרד בארבעה מיליליטר של KB בתוספת מדיום DAP. בצינור טרי של 15 מיליליטר, מערבבים 250 מיקרוליטרים של תאי התורם ה- E.coli שנשטפו עם מיליליטר אחד של זן הגלדיולי של ברקהולדריה שנשטף A תאים נמענים.

ספוט 10 microliters של תערובת תא ההטיות זה על לוחות אגר KB המכילים DAP. אפשר לצלחת לנוח באין מפריע במכסה המנוע הסטרילי בטמפרטורת החדר במשך שעה. לדגור על הצלחות עם כתמי ההטיה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 12 עד 18 שעות.

לאחר הדגירה, להוסיף שניים עד ארבעה מיליליטר של 1X PBS על הצלחות מתחת למכסה המנוע סטרילי ולהשתמש מגרד תאים כדי לשחרר את כתמי ההטיות החיידקיים הבוגרים מן agar. ואז פיפטה, תערובת התאים הצמודים לשני צינורות מיקרו-פוגה של מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 9, 600 פעמים G במשך שתי דקות.

השלך את supernatant ולשטוף את הכדור פעמיים במיליליטר אחד של 1X PBS על ידי צנרת למעלה ולמטה. resuspend הכדור הסופי ב 1, 200 microliters של 1X PBS. מערבבים היטב ומפיצים 100 מיקרוליטרים של תערובת התאים על לוחות אגר KB גדולים בתוספת קנאמיצין ודגרה ב 30 מעלות צלזיוס לילה.

לספור את המספר הכולל של מושבות transconjugant על שלוש הצלחות ולהעריך כדי לחשב את המספר המשוער של מוטציות שהושגו בכל הלוחות. כדי להגדיל את הסיכויים לקבל ספרייה ייצוגית, ודא כי המספר הכולל של מושבות הוא פי כמה גבוה יותר מאשר המספר הכולל של הגנים בגנום. כדי לאשר את הצלחת ההטיות, בצע PCR המתמקד בקלטת ההוספה באמצעות 10 עד 20 מושבות לדוגמה כמתואר בכתב היד.

מתחת למכסה המנוע הסטרילי, לגרד את המושבות מהצלחות על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של 1X PBS על אגר. בריכה תערובת התאים גירד מן הצלחות לתוך צינורות 50 מיליליטר. מערבולת הספרייה לערבב ביסודיות, ולאחר מכן לפצל מיליליטר אחד של ספריית מוטציות בריכה לכמה צינורות הקפאה.

הוסף מיליליטר אחד של 70%גליצלול לצינורות ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. בחר מצמד ביצה L.villosa ולספור את מספר הביצים ממשיך אם המצמד מכיל יותר מ 100 ביצים. כדי לעקר את כל מצמד הביצים, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של 70% אתנול ושטפים בעדינות את הביצים במשך חמש דקות, ואז מסירים את האתנול ושוטפים את הביצים פעמיים במים אוטומטיים.

מוסיפים 200 מיקרוליטרים של 12% אקונומיקה ושטפו בעדינות את הביצים למשך 30 שניות. הסר את אקונומיקה מיד לשטוף את הביצים שוב שלוש פעמים עם 200 microliters של מים autoclaved. להדביק את הביצים במצמד הביצים המעוקר באמצעות פעמיים 10 עד 6 תאים לכל מיקרוליטר של ספריית המוטציות השטופה ב- PBS.

יומיים לאחר פתח הזחלים הנגוע של הזחלים, אסוף זחלי 100 שניות לכל צינור מיקרופוגה 1.5 מיליליטר ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ליצור את ספריית בקרת ההפריה החוץ גופית, לחסן 250 מיקרוליטרים של פעמיים 10 ל -6 תאים לכל מיקרוליטר של ספריית המוטציות ב 10 מיליליטר של מדיום KB המכיל Kanamycin. לאחר חילוץ DNA מן in vivo ו אין ויטרו ספריות מוטציות גדל, לשתף את ה- DNA עם ultrasonicator.

כדי לבדוק אם הדנ"א היה גזירה לטווח הגודל הרצוי, לטעון חמישה microliters של DNA unsheared ו גזירה לאחר ערבוב עם צבע טעינת ג'ל ביחס אחד לאחד על 1.6% agarose ג'ל לרוץ ב 250 וולט במשך 40 דקות. כדי להכין את קצות השבר הנדרשים לקשירת מתאם, התחל על ידי הוספת שלושה מיקרוליטרים של תערובת האנזימים ושבע מיקרוליטרים של מאגר תגובה ל -50 מיקרוליטרים של ה- DNA הגועה ומערבבים היטב על ידי צנרת. הגדר תרמוציטר עם מכסה מחומם ב גדול או שווה ל 75 מעלות צלזיוס ודגור את הדגימות במשך 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ו 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להחזיק את הטמפרטורה בארבע מעלות צלזיוס.

עבור קשירת מתאם, הוסף 30 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר קשירה, מיקרוליטר אחד של משפר קשירה, ו 2.5 מיקרוליטרים של מתאם מדולל למוצרים של שלב הכנת הקצה. מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה של הדגימה במשך 15 דקות ב 20 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר עם המכסה מחומם כבוי. לאחר 15 דקות, מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של האנזים.

מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה המדגם במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר עם המכסה מחומם גדול או שווה 47 מעלות צלזיוס. כדי לבחור את הגודל של מתאם קשירת DNA פילוח שברים של 250 זוגות בסיס, להתחיל על ידי מערבולת פתרון החרוז המגנטי ומניחים אותו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפני השימוש. מוסיפים פי 0.3 חרוזים ל-96.5 מיקרוליטרים של תערובת הדנ"א המקשר ומערבבים על ידי צנרת יסודית.

לדגור את תערובת החרוזים במשך חמש דקות. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי כדי למשוך את החרוזים ולהסיר שברי DNA בגודל לא רצוי. תן לחרוזים להסתפק במשך חמש דקות ואז להעביר את supernatant ברור לצינור microfuge חדש.

מוסיפים פי 0.15 חרוזים טריים לסופר-טבעי ומערבבים על ידי צנרת טובה. לדגור על תערובת החרוזים במשך חמש דקות ולאחר מכן למקם את הצינורות על עמדה מגנטית כדי למשוך את החרוזים הקשורים לדנ"א היעד. המתן חמש דקות ולאחר מכן להשליך את supernatant, שמירה על החרוזים.

עם החרוזים על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 microliters של 80% אתנול מוכן טרי ולחכות 30 שניות לפני השלכת האתנול מבלי להפריע החרוזים. הסר את הצינורות מהמעמד והוסף 17 מיקרוליטרים של TE 0.1X או TE נמוך, ולאחר מכן לערבב על ידי pipetting 10 פעמים ודגורה התערובת בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. הנח את הצינור על העמדה המגנטית ולקחת 15 microliters של ה- DNA שנבחר בגודל עבור PCR-1.

מערבולת סטרפטבידין חרוזי ומניחים אותם בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפחות. קח 32 מיקרוליטרים של החרוזים ולשטוף אותם עם 500 microliters של 1X לאגד ולשטוף חוצץ. הוסף 32 מיקרוליטרים של 2X לאגד ולשטוף חוצץ ו resuspend החרוזים.

לכך, הוסף 32 מיקרוליטרים של מוצרי PCR-1 המנוקים. מערבבים היטב ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מניחים את תערובת ה- DNA של החרוזים על מעמד מגנטי במשך שתי דקות.

פיפטה את supernatant כמו ביוטין מתויג DNA המכיל את קצה הכניסה נקשר סטרפטאבידין על החרוזים. לשטוף את החרוזים עם 500 microliters של 1X לאגד ולשטוף חוצץ, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים עם 200 microliters של TE נמוך. תקיף מחדש את החרוזים הקשורים לדנ"א ב-17 מיקרוליטרים של TE נמוך. הדנ"א של ספריות המוטציות הגדלות של in vivo ו- במבחנה שחולצו ומפוצלות באולטרסאונד הראו שרוב השברים משתרעים בין 100 ל -400 זוגות בסיסים. המיקום של כניסות בתיווך טרנספוסון על פני ארבעת השיברים של זן גלדיולי Burkholderia גנום ניתן לראות בתרמיל.

ניתן לראות בטבלה סיכום של פלט הרצף ומספר ההוספות והגנים הייחודיים שנפגעו בשלושת השכפולים בספריות vivo ו- במבחנה. הדבר החשוב לזכור הוא לחשב את גודל צוואר הבקבוק של האוכלוסייה במהלך קולוניזציה מארחת כדי לקבל ייצוג הולם של הספרייה במהלך ההדבקה. כמו כן, התאימו למספר תואם של דורות חיידקיים במבחנה ובמארח.

לאחר יצירת ספריית המוטציות של טרנספוסון, ניתן להקרין אותה באמצעי תקשורת סלקטיביים כדי לשחזר מוטנטים המבוססים על הבדלים פנוטיפיים. גנים ספציפיים החשובים למצב יכולים אפוא להיות מזוהים.