Name: רצף הכנסה טרנספוסון ככלי להבהב גורמי קולוניזציה חיידקיים בבורקהולדריה גלדיולי סימביונט של לגריה וילוסה בילס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: חקור שיטות ריצוף הכנסה טרנספוזון לזיהוי גורמי קולוניזציה חיידקיים ב-Burkholderia gladioli סימביונט של Lagria villosa. שיטה זו מאפשרת הבנה מולקולרית של יחסי סימביוזה בחסרי חוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'ונבום לי על שסיפק את זן E. coli WM3064+pRL27 להטיה והדרכה בהליך, קתרין הופמאייר על שעזרה בפתרון בעיות במהלך יצירת ספריית המוטציות, ופרופ' אנדרה רודריגז לתמיכה באיסוף חרקים ורכישת היתרים. אנו מודים גם רבקה ינקה ודאגמר קלבש על התמיכה באיסוף וגידול החרקים. אנו מודים לרשויות הברזילאיות על מתן היתרי הגישה הבאים, איסוף, וייצוא של דגימות חרקים: אישור SISBIO Nr. 45742-1, 45742-7 ו 45742-10, תהליך CNPq nº 01300.004320/2014-21 ו 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF ו 20BR035212/DF). מחקר זה נתמך על ידי מימון של קרן המדע הגרמנית (DFG) מענקי מחקר FL1051/1-1 ו KA2846/6-1.

<ol><li>Cain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+advances+in+transposon-insertion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A decade of advances in transposon-insertion sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).</li>
<li>Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+analysis+of+transposon+insertion+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).</li>
<li>Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+querying+bacterial+genomes+with+transposon-insertion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing.</a> RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).</li>
<li>Flórez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-producing+symbionts+dynamically+transition+between+plant+pathogenicity+and+insect-defensive+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism.</a> Nature Communications. 8 (1), 15172(2017).</li>
<li>Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+dynamics+and+strain+diversity+in+the+defensive+mutualism+between+Lagria+beetles+and+Burkholderia%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia.</a> Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).</li>
<li>Flórez, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antifungal+polyketide+associated+with+horizontally+acquired+genes+supports+symbiont-mediated+defense+in+Lagria+villosa+beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles.</a> Nature Communications. 9 (1), 2478(2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2012).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FeatureCounts%3A+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+three+secretion+system+in+attaching+and+effacing+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type three secretion system in attaching and effacing pathogens.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129(2016).</li>
<li>Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+and+anti-host+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion and anti-host effectors.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).</li>
<li>Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+and+bacterial+pathogenicity%3A+From+molecules+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Physicians%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease.</a> Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).</li>
<li>Silva, A. J., Benitez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+biofilms+and+cholera+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330(2016).</li>
<li>Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+pathogenic+Escherichia+coli%3A+structure%2C+role+in+virulence%2C+and+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1965(2019).</li>
<li>Ribet, D., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacterial+pathogens+colonize+their+hosts+and+invade+deeper+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues.</a> Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+Type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068(2010).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kill+and+cure%3A+genomic+phylogeny+and+bioactivity+of+Burkholderia+gladioli+bacteria+capable+of+pathogenic+and+beneficial+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomics%22%5BJournal%5D)">Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles.</a> Microbial Genomics. 7 (1), 000515(2021).</li>
<li>Takeshita, K., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riptortuspedestris+and+Burkholderia+symbiont%3A+an+ideal+model+system+for+insect-microbe+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations.</a> Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).</li>
<li>Powell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screen+identifies+host+colonization+determinants+in+a+bacterial+gut+symbiont%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).</li>
<li>Brooks, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+discovery+of+colonization+determinants+in+the+squid+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).</li>
<li>Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+genetic+manipulation+of+Burkholderia+gladioli+pathovar+cocovenenans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans.</a> BMC Research Notes. 3 (308), (2010).</li>
<li>Garcia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+thailandensis%3A+Genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation.</a> Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).</li>
<li>Headd, B., Bradford, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conjugation+window+in+an+Escherichia+coli+K-12+strain+with+an+IncFII+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948(2020).</li>
<li>Van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+A+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-defined+transposon+mutant+library+of+Burkholderia+thailandensis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis.</a> mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).</li>
<li>Wong, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+essential+genes+in+Burkholderia+cenocepacia+J2315+identified+by+genome-wide+TraDIS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1288(2016).</li>
<li>Moule, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+saturation+mutagenesis+of+Burkholderia+pseudomallei+K96243+predicts+essential+genes+and+novel+targets+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development.</a> mBio. 5 (1), 00926(2014).</li>
<li>Ding, Q., Tan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Himar1+transposon+for+efficient+random+mutagenesis+in+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1842(2017).</li>
<li>Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+site+preference+of+Mu%2C+Tn5%2C+and+Tn7+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons.</a> Mobile DNA. 3, 3(2012).</li>
<li>Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+Tn5+target+specificity%3A+Preference+for+insertion+at+G%2FC+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs.</a> Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).</li>
<li>Ará Ujo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+and+transposon+mutagenesis+of+Burkholderia+seminalis+TC3.4.2R3+identify+genes+contributing+to+suppression+of+orchid+necrosis+caused+by+B.+gladioli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli.</a> Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).</li>
<li>Dobritsa, A. P., Samadpour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reclassification+of+Burkholderiainsecticola+as+Caballeroniainsecticola+comb.+nov.+and+reliability+of+conserved+signature+indels+as+molecular+synapomorphies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).</li>
<li>Ohbayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect%27s+intestinal+organ+for+symbiont+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insect's intestinal organ for symbiont sorting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).</li>
<li>Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+conjugated+polyyne+biosynthesis+in+phytopathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).</li>
<li>Atkins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Burkholderia+pseudomallei%2C+auxotrophic+in+the+branched+chain+amino+acid+biosynthetic+pathway%2C+is+attenuated+and+protective+in+a+murine+model+of+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis.</a> Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים הנוגע למחקר.

ספריית מוטציות טרנספוסון של B. גלדיולי נוצרה כדי לזהות גורמי קולוניזציה מארחים חשובים באינטראקציה הסימביוטית בין סלק L. villosa וחיידקי B. גלדיולי. הצעדים העיקריים בפרוטוקול היו הטיות, זיהום מארח, הכנת ספריית DNA ורצף.
כמו זנים רבים של Burkholderia הם מקובלים על שינוי גנטי על ידי הטיות24,25, plasmid נושא את קלטת טרנספוסון והכנסת אנטיביוטיקה היה מצומד בהצלחה לתוך היעד B. זן גלדיולי Lv-StA מ E. coli. ניסיונות טרנספורמציה קודמים על ידי אלקטרופורציה הניבו נמוך מאוד כמעט ללא טרנספורמטים של גלדיולי B. מומלץ לייעל את טכניקת הטרנספורמציה עבור האורגניזם היעד להניב ביעילות מספר רב של טרנספורמטים.
סבב אחד של הטיות ו-40 נקודות הטיות שיבשו 3,736 גנים ב-B. גלדיולי Lv-StA. במבט לאחור, יהיה צורך בסבבים מרובים של הטיות כדי לשבש את רוב 7,468 הגנים ולקבל ספרייה רוויה. ראוי לציין, זמן הדגירה במהלך ההטיות לא הורשה לעלות על 12-18 שעות, המהווה את סוף שלב הצמיחה המעריכי של B. גלדיולי. מתן אפשרות להטיות מעבר לשלב הצמיחה המעריכי של תאי חיידקים מקטין את סיכויי ההצלחה להשיג טרנס-קונצ'וגנטים26. לכן, יש להתאים את תקופת ההטיות בהתאם לצמיחת המינים החיידקיים.
כדי לבצע בהצלחה ניסוי הכולל זיהום של ספריות מוטציות במארח, חשוב להעריך את גודל צוואר הבקבוק של אוכלוסיית החיידקים במהלך ההתיישבות ואת מגוון המוטנטים בספרייה לפני זיהום1,2,27. כהכנה לניסוי, הערכנו את המספר המינימלי של לחפשיות שיש להדביק כדי שיהיה סיכוי גבוה שכל מוטציה בספרייה תידגם ותורשה להתיישב. זמן ייצור החיידקים המשוער ב-vivo ומספר הדורות למשך הניסוי חושבו גם הם. תרבות ההחמה גדלה אז למספר דומה של דורות על ידי התאמת זמן הדגירה. לניסוי זיהום דומה אצל מארחים אחרים שאינם מודלים, היכולת לשמור על תרבות מעבדה ומקור קבוע של האורגניזמים המארחים רצויה.
בעקבות צמיחת ספריית המוטציות ב- vivo ובאיסוף במבחנה ובדגימה, בוצע פרוטוקול הכנת ספריית DNA שונה לרצף החדרת טרנספוסון. השינוי בפרוטוקול כלל עיצוב פריימרים PCR מותאמים אישית והוספת שלבי PCR לבחירה עבור שברי DNA המכילים את קלטת הכניסה. מאחר שהפרוטוקול הותאם אישית, מחזורי PCR נוספים בפרוטוקול הגבירו את הסיכון לפשטנות יתר וקבלת מקטעי מתאם-מתאם היברידיים בספריות הקצה. לפיכך, מומלץ לשלב ניקוי סופי (ללא בחירת גודל) לאחר שני PCRs, שכן הוא מסייע בהסרת שברים אלה. התפלגות הגודל של ספריות הדנ"א הייתה עדיין רחבה מהצפוי. עם זאת, הגדלת עומק הרצף סיפקה מספיק נתונים שסוננו במהלך ניתוח ביואינפורמטיקה, והשיגה תוצאות משביעות רצון.
מכיוון שמוטגנסיזה בתיווך טרנספוסון מייצרת אלפי כניסות אקראיות בניסוי אחד, ניתן ליצור ספרייה רוויה של מוטציות המכילה את כולם מלבד המוטנטים שבהם גנים החיוניים לצמיחת חיידקים שובשו. סביר להניח שלא עבדנו עם ספריית מוטציות רוויה, בהתחשב בהערכות של גנים חיוניים במחקרים אחרים על Burkholderia sp. 28,29. ספריה לא רוויה בכל זאת מסייעת לחקור גנים מועמדים שונים למחקרים נוספים באמצעות מוטגנזה ממוקדת. לפני הניסויים, חשוב גם לזכור כי כמה transposons יש אתרי יעד הכנסה ספציפיים המגבירים את שפע המוטנטים ב loci מסוימים בגנום30. טרנספונים של מרינר ידועים כמטרה לאתרי AT עבור הכנסה31, ו- Tn5 טרנספונים יש הטיה GC32,33. הכללת שלבים במהלך ניתוח ביואינפורמטיקה לזיהוי נקודות חמות עבור תוספות טרנספוסון תסייע בהערכת כל הטיית הפצה.
למרות שנוטה לכישלונות, ניסוי רצף הכנסה טרנספוסון מעוצב היטב יכול להיות כלי רב עוצמה לזיהוי גנים חשובים ומותנים רבים בחיידקים בתוך ניסוי אחד. לדוגמה, תריסר גנים בבורקהולדריה seminalis חשוב לדיכוי של נמק עלי סחלב זוהו על ידי שילוב של mutagenesis טרנספוסון וגנומיקה34. מעבר לבורקהולדריה, כמה גנים ותנועתיות ומשגרים זוהו כגורמי קולוניזציה חשובים בסימביונטים של אפיס מליפרה (דבורת הדבש)22, ובשיתוי ויבריו פישרי של אופרימנה סקולופס (דיונון בובטייל הוואי)23 באמצעות הגישה של מוטאגנסיס בהחדרת טרנספון.
כגישה חלופית, מוטגנזה טרנספוסון עשויה להיות מלווה על ידי הקרנה עבור מוטציות בודדות באמצעות מדיה סלקטיבית במקום רצף. סינון פנוטיפי או bioassays כדי לזהות ליקויים, כגון תנועתיות, ייצור של מטבוליטים משניים ביואקטיביים, או auxotrophies ספציפי, הם אפשריים. לדוגמה, הקרנה של חרקים Burkholderia (מחדש לסוג Caballeronia35) ספריית מוטציות טרנספוסון היה המפתח בזיהוי כי סימביונטים להשתמש בגנים תנועתיות להתיישבות ריפטורוס pedestris, מארח החרקים שלהם36. יתר על כן, באמצעות מוטגנסיס טרנספוסון והקרנה פנוטיפית, אשכול הגנים הביוסינתזה עבור קריויננסין מטבוליט משני ביואקטיבי זוהה Burkholderia caryophylli37. מוטציה אוקסוטרופית של Burkholderia pseudomallei זוהתה בעקבות מוטגנזה טרנספוסון והקרנה והוא מועמד אפשרי לחיסון מוחלש נגד melioidosis, מחלה מסוכנת בבני אדם ובעלי חיים38. לכן, מוטאגנזה טרנספוסון ורצף היא גישה חשובה בחקר התכונות המולקולריות של חיידקים החשובים לאינטראקציות עם המארחים שלהם בהתאמה באסוציאציות פתוגניות או הדדיות.

Burkholderia גלדיולי יכול לעסוק בקשר סימביוטי עם לאגריה villosa bes, משחק תפקיד חשוב בהגנה נגד אנטגוניסטים מיקרוביאליים של מארח חרקים4,5,6. נקבות האשכים מספר זנים של B. גלדיולי אביזר בלוטות מיוחדים למערכת הרבייה. על הטלת ביצים, נקבות למרוח B. תאי גלדיולי על פני הביצה שבו תרכובות מיקרוביאלית המיוצרות על ידי B. גלדיולי לעכב זיהומים על ידי פטריות אנטומופתוגניים4,6. במהלך התפתחות עוברית מאוחרת או מוקדם לאחר צוהר הזחלים, החיידקים ליישב פולשים cuticular על פני השטח של הזחלים. למרות לוקליזציה מיוחדת זו ומסלול שידור אנכי של הסימבינטים, L. villosa יכול ככל הנראה גם לרכוש B. גלדיולי אופקית מהסביבה4. יתר על כן, לפחות שלושה זנים של B. גלדיולי נמצאו בשיתוף עם L. villosa4,6. בין אלה, B. גלדיולי Lv-StA הוא היחיד כי הוא מקובל לטפח במבחנה.
ב. גלדיולי גודל הגנום של Lv-StA הוא 8.56 מגה-בתיםומכיל 7,468 גנים. איזה מהגנים האלה חשוב לחיידקי ב. גלדיולי כדי ליישב את מארח החילולי? כדי לענות על שאלה זו, השתמשנו ברצף טרנספוסון-החדרה (Tn-seq), שיטה חקרנית לזיהויגניםמיקרוביאליים חיוניים מותנים 1,2,3. ספריית מוטציות של B. גלדיולי Lv-StA נוצרה באמצעות טרנספוסון Tn5. באמצעות הטיות מתאי התורם של אשריצ'יה קולי ל- B. gladioli Lv-StA, הועברה פלסמיד pRL27 הנושא את טרנספוסון Tn5 וקסטה עמידות לאנטיביוטיקה המוקפת בחזרות הפוכות (איור 1). כך נוצרה קבוצה של מוטנטים הנושאים בנפרד שיבושים של 3,736 גנים סימביונטים (איור 2).
מאגר המוטציות הודבק על ביצי שולחן כדי לזהות את גורמי ההתיישבות, וכבקרה, גדל גם במבחנה במדיום קינגס B (KB). לאחר שאפשרו מספיק זמן להתיישבות, נאספו זחלים בקעו ונאספו להפקת דנ"א. שברי דנ"א המכילים את ההוספה טרנספוסון ואת האזור הגנומי האגף של B. גלדיולי Lv-StA נבחרו באמצעות פרוטוקול הכנת ספריית DNA שונה לרצף. קריאת עיבוד איכות ואחריו ניתוח עם DESeq2 בוצע כדי לזהות גנים ספציפיים חיוני עבור B. גלדיולי Lv-StA ליישב זחלי L. villosa כאשר מועברים דרך פני הביצה.

<table><tbody><tr><td>2,6- חומצה דיאמינופימלית</td><td>אלפא Aesar</td><td>B22391</td><td>עבור E.coli WM3064+ pRL27</td></tr><tr><td>אגר - אגר</td><td>רוט</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>ביוזים</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי AMPure XP (חרוזים מג'נטיים + פוליאתילן גליקול + מלחים)</td> <td>בקמן קולטר</td><td>A63880</td><td>בחירת גודל בשלב 6.6</td></tr><tr><td>אקונומיקה (NaOCl) 12%</td> <td>רוט</td><td>9062</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2 v.2.4.2</td><td></td><td></td><td>כלי ביואינפרומטי למיפוי קריאה. הפניה 10 בכתב היד הראשי.</td></tr><tr><td>Buffer-S</td><td>Peqlab</td><td>PEQL01-1020</td><td>עבור PCRs</td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>Sarstedt</td><td>83.1830</td><td></td></tr><tr><td>Cutadapt v.2.10</td><td></td><td></td><td>כלי ביואינפורמטי להסרת רצפי מתאם ספציפיים מהקריאות. הפניה 8 בכתב היד הראשי.</td></tr><tr><td>חבילת DESeq2</td><td></td><td></td><td>RStudio להערכת שפע מוטנטי דיפרנציאלי. משמש בדרך כלל לניתוח RNAseq. הפניה 12 בכתב היד הראשי.</td></tr><tr><td>סולם DNA 100 bp</td><td>Roth</td><td>T834.1</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0182</td><td>PCR לאישור הצלחת הצימוד</td></tr><tr><td>EDTA, מלח ד-נתרן</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure ערכת טיהור DNA ו-RNA מלאה</td><td>Lucigen</td><td>MC85200</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>FastQC v.0.11.8</td><td></td><td></td><td>כלי ביואינפורמטי להערכת איכות נתוני הריצוף. הפניה 7 בכתב היד הראשי.</td></tr><tr><td>FeatureCounts v.2.0.1</td><td></td><td></td><td>כלי ביואינפורמטי להשגת ספירת קריאה לכל תכונה גנומית. הפניה 11 בכתב היד הראשי.</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>רוט</td><td>7530</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Serva</td><td>26899</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Roth</td><td>PO27</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</sub</td><td>>Roth</td><td>P030</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos עבור Illumina (סט פריימרים אינדקס 1)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הכנה לספריית DNA NEBNext Ultra II עבור Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td></td></tr><tr><td>פפטון (פולי סויה)</td> <td>Roth</td><td>2365</td><td>עבור Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td></tr><tr><td>peqGOLD 'Hot' Taq- DNA פולימראז</td><td>VWR</td><td>PEQL01-1020</td><td>PCR לאישור הצלחת צימוד</td></tr><tr><td>לוחות פטרי - 145 x 20 מ"מ</td><td>Roth</td><td>XH90.1</td><td>לבחירת מצמדים טרנס-מצומדים</td></tr><tr><td>לוחות פטרי - 90 x 16 מ"מ</td><td>Roth</td><td>N221.2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, גרמניה)</td><td></td><td></td><td>בדיקת איכות לאחר הכנת ספריית DNA</td></tr><tr><td>חרוזי סטרפטווידין</td><td>Roth</td><td>HP57.1</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז</td><td>VWR</td><td>01-1020</td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic v.0.36</td><td></td><td></td><td>כלי ביואינפורמטי לחיתוך קריאות באיכות נמוכה וגם רצפי מתאם. הפניה 9 בכתב היד הראשי.</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td>Roth</td><td>9090.1</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth</td><td>2366</td><td>עבור Escherichia coli WM3064+pRL27 LB</td></tr><tr><td>בינוני אולטרסאונד</td><td>Bandelin</td><td>GM 70 HD</td><td>לגזירה</td></tr><tr><td>אנזים USER (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII)</td> <td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td>קשירה שלב 6.5.2</td></tr><tr><td>תמצית</td> <td>שמריםרוט</td><td>2363</td><td></td></tr></tbody></table>

רצף הכנסה טרנספוסון ככלי להבהב גורמי קולוניזציה חיידקיים בבורקהולדריה גלדיולי סימביונט של לגריה וילוסה בילס

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

הסקת תפקוד הגנים על ידי מניפולציה של פעילותם היא כלי חיוני להבנת היסודות הגנטיים של רוב התהליכים הביולוגיים. ההתקדמות במיקרוביולוגיה מולקולרית ראתה את הופעתן של טכניקות מוטגנסיס מגוונות למניפולציה של גנים. ביניהם, רצף הכנסה טרנספוסון (Tn-seq) הוא כלי בעל ערך כדי להעריך בו זמנית את הפונקציונליות של גנים מועמדים רבים בצורה לא מנוטרלת. הטכניקה הייתה המפתח לזיהוי מנגנונים מולקולריים להתיישבות של פונדקאים אאוקריוטים במספר חיידקים פתוגניים וכמה סימביונים מועילים.
כאן, Tn-seq הוקמה כשיטה לזיהוי גורמי קולוניזציה בסימביונט גלדיולי של איילת לאגריה וילוסה. על ידי הטיות, Tn5 טרנספוסון בתיווך החדרה של קלטת עמידות לאנטיביוטיקה מתבצעת במקומות גנומיים אקראיים B. גלדיולי. כדי לזהות את ההשפעה של הפרעות גנטיות על היכולת של החיידקים ליישב את מארח היין, הספרייה הנוצרת B. גלדיולי טרנספוסון-מוטציה מחוסנת על ביצי היין, בעוד שליטה גדלה במבחנה במדיום תרבות נוזלית. לאחר מתן מספיק זמן להתיישבות, DNA מופק מתוך in vivo וספריות גידול במבחנה. בעקבות פרוטוקול הכנת ספריית DNA, דגימות הדנ"א מוכנות לרצף של החדרת טרנספוסון. שברי דנ"א המכילים את הקצה של ההחדרה הטרנספוסון ואת ה- DNA החיידקי האגף נבחרים, ואתרי המוטציה נקבעים על ידי רצף הרחק מקצה ההחדרה של טרנספוסון. לבסוף, על ידי ניתוח והשוואה של התדרים של כל מוטציה בין ספריות in vivo וספריות במבחנה, ניתן לחזות את החשיבות של גנים סימביונט ספציפיים במהלך קולוניזציה של חילוקיות.

חיידקים הקשורים לפונדקאי יכולים להעסיק מספר גורמים כדי ליצור קשר, כולל אלה בתיווך הידבקות, תנועתיות, כימוטקסיס, תגובות מתח, או מובילים ספציפיים. בעוד גורמים חשובים עבור אינטראקציות פתוגן מארח דווחו עבור מספר חיידקים13,14,15,16,17,18, כולל חברים בסוג Burkholderia19,20, פחות מחקרים חקרו את המנגנונים המולקולריים המשמשים סימביונים מועילים עבור קולוניזציה21,22,23 . באמצעות רצף החדרת טרנספוסון, המטרה הייתה לזהות גורמים מולקולריים המאפשרים B. גלדיולי ליישב את L. villosa bes.
מוטגנזה בתיווך טרנספוסון בוצעה באמצעות pRL27 plasmid, הנושא טרנספוסון Tn5 וקלטת התנגדות קנאמיצין מוקף על ידי הפוך אתרים חוזרים. הפלסמיד הוכנס לתוך היעד B. תאי גלדיולי Lv-StA על ידי הטיות עם תורם פלסמיד E. coli WM3064 (כפי שמוצג באיור 1). לאחר ההטיה, תערובת ההטיה המכילה את נמען הגלדיולי B. ותאי התורם E. coli היו מצופים על לוחות אגר סלקטיביים המכילים קנאמיצין. היעדר DAP על הצלחות חיסל את התאים התורמים E. coli, ואת נוכחותו של kanamycin שנבחר עבור מוצלח B. גלדיולי Lv-StA transconjugants. הספרייה המוטנטית B. gladioli Lv-StA שהתקבלה מקציר 100,000 המושבות הטרנס-יבשתיות הוכנה לרצף באמצעות ערכת הכנת ספריית דנ"א מותאמת ובריימרים מותאמים אישית. איור 2 מדגיש את שלבי ההכנה לספריית הדנ"א. רצף הניב 4 קריאות מזווגות של מיו; 3,736 גנים מתוך 7,468 גנים ב B. גלדיולי Lv-StA שובשו.
כדי לזהות מוטנטים שהיו פגומים בהתיישבות בפונדקאי, ספריית המוטציות B. gladioli Lv-StA נדבקה בביצי היין וגדלה במבחנה במדיום KB כשליטה. גודל צוואר הבקבוק של קולוניזציה in vivo חושב לפני הניסוי. מספר ידוע של תאי B. גלדיולי Lv-StA נדבקו בביצי אשקלה, ומספר התאים המתיישבים בזחלי הכוכב הראשון שקעו זה עתה הושג על ידי ציפוי השעיה מכל זחל וספירת יחידות יוצרות מושבה לאדם. חישובים אלה נעשו כדי להבטיח שמספר התאים המתיישבים מספיק כדי להעריך את כל או אחוז גבוה של המוטנטים בספרייה על יכולתם ליישב את הפונדקאי. בנוסף, זמן הצמיחה בין אין במבחנה לבין תנאי vivo היה מנורמל בהתבסס על מספר הדורות חיידקים כדי להפוך דגימות אלה לשווה.
לאחר שהביצים בקעו, נאספו 1,296 זחלים ב-13 בריכות. התרבויות המוטנטיות במבחנה המקבילות גדלו ואוחסנו כמניות גליסול. DNA של in vivo וספריות מוטציות גדל במבחנה הוצא ופוצל ultrasonicator. איור 3 מציג את התפלגות הגודל של הדנ"א הנמרץ, שבו רוב השברים משתרעים על פני 100 עד 400 bp, כצפוי. שלב זה בוצע לאחר פרוטוקול הכנת ספריית DNA שונה לרצף. בכל שלב של הפרוטוקול, הריכוז של ה- DNA הנותר נבדק כדי לוודא כי הצעדים בוצעו כראוי כדי לעקוב אחר אובדן של DNA. בדיקת איכות (ראה טבלת החומרים) לפני הרצף העלתה כי ספריות הדנ"א הכילו שברי DNA גדולים באופן בלתי צפוי (&gt;800 bp), והדבר היה בולט יותר בספריות in vivo. בהתחשב בקושי לייעל את קיבוץ השברים בנתיבי הרצף, היה צורך להגדיל את עומק הרצף ל-10 קריאות זיו בספריות in vivo כדי להשיג את מספר הקריאות הרצוי. ניתוח תוצאות הרצף העלה כי ממוצע של 4 Mio קורא בספריות in vivo ו 3.1 Mio קורא בספריות במבחנה הכיל את קצה Transposon בסוף 5 'של Read-1 (טבלה 9), אשר היה משביע רצון לניסוי זה. התפלגות 24,224 ההוספות הייחודיות ברחבי הגנום של B. gladioli בספרייה המקורית מוצגת באיור 4. ניתוח שנערך באמצעות DESeq2 גילה כי השפע של 271 מוטציות היה שונה באופן משמעותי בין in vivo לבין תנאי במבחנה. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> איור 3: ג'לים של מוטציה וספריות דנ"א. (א)ג'ל אגרוז עם דנ"א לא נגף של מוטציה בנתיב x וסולם של 1 kbp לקנה מידה. (ב)ג'ל עם ספריית דנ"א גיהית. גדלי הרצועה של הסולם בנתיב הראשון מסומנים בצד שמאל. שלושת הנתיבים הראשונים a, b ו- c מכילים שברי DNA גרוסים של ספריות in vivo . נתיבים d, e, f ו- g מכילים שברי דנ"א גועכים של ספריות ההחצטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> איור 4: מיקום אתרי הכנסה ייחודיים בספרייה המקורית על פני ארבעת השרידים בגנום גלדיולי Lv-StA של בורקהולדריה. כל פס לאורך ציר ה- x ממוקם באתר של הוספה. הגובה של סרגל לאורך ציר ה- y תואם למספר הקריאות המשויכות לאתר זה. שים לב כי שני כרומוזומים ושני plasmids מוצגים באורך מלא ולכן יש קשקשים שונים על ציר x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">קינגס בי מדיום/ אגר</td>
		</tr>
<tr>
<td>פפטון (פולי סויה)</td>
			<td>20 גרם/ל'</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1.5 גרם/ל'</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1.5 גרם/ל'</td>
		</tr>
<tr>
<td>אגר</td>
			<td>15 גרם/ל'</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מומס במים מזוקקים</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB בינוני/אגר</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריפטון</td>
			<td>10 גר'/ל'</td>
		</tr>
<tr>
<td>תמצית שמרים</td>
			<td>5 גרם/ל'</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 גר'/ל'</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מומס במים מזוקקים</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: רכיבי מדיה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>לא.</td>
			<td>פריימרים</td>
			<td colspan="2">רצף</td>
			<td>טמפרטורת חישול PCR. (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13–2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>לוח 2: פריימרים כדי לאשר את הצלחת ההטיות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
			<td>אמצעי אחסון (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים מטוהרים ב-HPLC</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer S (ספציפיות גבוהה)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 מ"ר)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (2 מ"מ)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר 1 (22:00/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר 2 (22:00/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>טאק (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ מאסטרמיקס</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>תבנית</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: תמהיל מאסטר PCR כדי לאשר את ההצלחה של הטיות. קיצורים: HPLC = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים; dNTPs = deoxynucleoside triphosphate.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שלבים</td>
			<td>טמפרטורה °C (55°F)</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה ראשונית</td>
			<td>95</td>
			<td>3 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה</td>
			<td>95</td>
			<td>שנות ה-40</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>חישול</td>
			<td>58.2</td>
			<td>שנות ה-40</td>
			<td>30 עד 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>סיומת</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>הארכה סופית</td>
			<td>72</td>
			<td>4 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>אחז</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: תנאי PCR כדי לאשר את הצלחת ההטיות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פריימרים</td>
			<td colspan="2">רצף</td>
			<td>ת"מ °C</td>
			<td>שימוש</td>
			<td>מקור</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר ביוטינילי ספציפי לטרנספוסון</td>
			<td colspan="2">5'-ביוטין-ACAGGAACACTTAGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>מנהג</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר PCR אוניברסלי שהשתנה</td>
			<td colspan="2">5'- אטגאטאקגאקאקאגאטק TACACTCTCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>מנהג</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר אינדקס</td>
			<td colspan="3">עיין במדריך של היצרן</td>
			<td>6.7.1. PCR I &amp;6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext מולטיפלקס אוליגוס עבור אילומינה (פריימרים אינדקס להגדיר 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מתאם</td>
			<td colspan="3">עיין במדריך של היצרן</td>
			<td>6.5. קשירת מתאם</td>
			<td>ערכת הכנה לספריית DNA של NEBNext אולטרה II עבור אילומינה</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: פריימרים ומתאם עבור PCR I ו- II במהלך הכנת ספריית DNA. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תערובת PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>שברי DNA עם קשירת מתאם</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext אולטרה II Q5 תערובת מאסטר</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר אינדקס (10 pmol / μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר ביוטינילציה ספציפי טרנספוסון (10 pmol / μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ אמצעי אחסון</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 6: הכנת ספריית DNA -תמהיל מאסטר PCR I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שלבים</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה ראשונית</td>
			<td>98 °C (77 °F)</td>
			<td>שנות ה-30</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה</td>
			<td>98 °C (77 °F)</td>
			<td>שנות ה-10</td>
			<td rowspan="3">6 עד 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>חישול</td>
			<td>65 °C (75 °F)</td>
			<td>שנות ה-30</td>
		</tr>
<tr>
<td>סיומת</td>
			<td>72 °C (72 °F)</td>
			<td>שנות ה-30</td>
		</tr>
<tr>
<td>הארכה סופית</td>
			<td>72 °C (72 °F)</td>
			<td>2 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>אחז</td>
			<td>16 °C (77 °F)</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 7: הכנת ספריית DNA -תנאיPCR I ו- II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תערובת PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנ"א שנבחר על-ידי חרוזים</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext אולטרה II Q5 תערובת מאסטר</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר אינדקס</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר PCR אוניברסלי שהשתנה</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ אמצעי אחסון</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 8: הכנת ספריית DNA -תמהיל מאסטר PCR II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">ספריות</td>
			<td>איניבו-1</td>
			<td>איניבו-2</td>
			<td>איניבו-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>ספריה מקורית</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">לא. של קריאות (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">לא. של קריאות המכילות Tn – קצה בקצה 5' של Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bowtie2 שיעור יישור כולל (%) (לקריאה-1 בלבד)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מספר הוספות ייחודיות</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מספר הגנים שנפגעו</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 9: סיכום של פלט רצף ותדירות הכנסה של טרנספוסון לכל ספריה. קיצור: PE = קצה מזווג.

זוהי שיטה מותאמת לזיהוי גורמי קולוניזציה חרקים מועמדים בסימביונט מועיל Burkholderia. מארח חיפושית נגוע בספריית מוטציות אקראית שנוצרת באמצעות mutagenesis טרנספוסון, ומורכבות הספרייה לאחר קולוניזציה מושוות לשליטה גדל במבחנה.

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

פרוטוקול זה שימושי לביצוע מניפולציה גנטית על חיידקים סימביוטיים, במקרה זה, במיוחד על Burkholderia, וזיהוי הגנים החיוניים ליישב מארח חרקים. רצף החדרת טרנספוסון הוא כלי רב עוצמה לזיהוי מספר רב של גנים חיוניים מותנים בו זמנית בניסוי יחיד. התחל על ידי חיסון תרבות תורם טרי של תורם E.coli ב 10 מיליליטר של מדיום LB בתוספת Kanamycin ו DAP תחת מכסה המנוע סטרילי.זן גלדיולי בורקהולדריה מסורס תאי נמען בחמישה מיליליטר של בינוני KB. לדגור על התרבויות ב 30 מעלות צלזיוס לילה על שייקר ב 250 סל"ד. לאחר צמיחה של לילה, צנטריפוגה ארבעה מיליליטר של כל אחת מהתרבויות ב 9, 600 פעמים G במשך שש דקות כדי כדורי התאים ולהשליך את supernatant.מתחת למכסה המנוע הסטרילי, יש לשטוף את תרביות התאים המנושלים במדיום KB המכיל DAP. ולבסוף, resuspend התרבויות בנפרד בארבעה מיליליטר של KB בתוספת מדיום DAP. בצינור טרי של 15 מיליליטר, מערבבים 250 מיקרוליטרים של תאי התורם ה- E.coli שנשטפו עם מיליליטר אחד של זן הגלדיולי של ברקהולדריה שנשטף A תאים נמענים.ספוט 10 microliters של תערובת תא ההטיות זה על לוחות אגר KB המכילים DAP. אפשר לצלחת לנוח באין מפריע במכסה המנוע הסטרילי בטמפרטורת החדר במשך שעה. לדגור על הצלחות עם כתמי ההטיה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 12 עד 18 שעות.לאחר הדגירה, להוסיף שניים עד ארבעה מיליליטר של 1X PBS על הצלחות מתחת למכסה המנוע סטרילי ולהשתמש מגרד תאים כדי לשחרר את כתמי ההטיות החיידקיים הבוגרים מן agar. ואז פיפטה, תערובת התאים הצמודים לשני צינורות מיקרו-פוגה של מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 9, 600 פעמים G במשך שתי דקות.השלך את supernatant ולשטוף את הכדור פעמיים במיליליטר אחד של 1X PBS על ידי צנרת למעלה ולמטה. resuspend הכדור הסופי ב 1, 200 microliters של 1X PBS. מערבבים היטב ומפיצים 100 מיקרוליטרים של תערובת התאים על לוחות אגר KB גדולים בתוספת קנאמיצין ודגרה ב 30 מעלות צלזיוס לילה.לספור את המספר הכולל של מושבות transconjugant על שלוש הצלחות ולהעריך כדי לחשב את המספר המשוער של מוטציות שהושגו בכל הלוחות. כדי להגדיל את הסיכויים לקבל ספרייה ייצוגית, ודא כי המספר הכולל של מושבות הוא פי כמה גבוה יותר מאשר המספר הכולל של הגנים בגנום. כדי לאשר את הצלחת ההטיות, בצע PCR המתמקד בקלטת ההוספה באמצעות 10 עד 20 מושבות לדוגמה כמתואר בכתב היד.מתחת למכסה המנוע הסטרילי, לגרד את המושבות מהצלחות על ידי הוספת אחד עד שני מיליליטר של 1X PBS על אגר. בריכה תערובת התאים גירד מן הצלחות לתוך צינורות 50 מיליליטר. מערבולת הספרייה לערבב ביסודיות, ולאחר מכן לפצל מיליליטר אחד של ספריית מוטציות בריכה לכמה צינורות הקפאה.הוסף מיליליטר אחד של 70%גליצלול לצינורות ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. בחר מצמד ביצה L.villosa ולספור את מספר הביצים ממשיך אם המצמד מכיל יותר מ 100 ביצים. כדי לעקר את כל מצמד הביצים, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של 70% אתנול ושטפים בעדינות את הביצים במשך חמש דקות, ואז מסירים את האתנול ושוטפים את הביצים פעמיים במים אוטומטיים.מוסיפים 200 מיקרוליטרים של 12% אקונומיקה ושטפו בעדינות את הביצים למשך 30 שניות. הסר את אקונומיקה מיד לשטוף את הביצים שוב שלוש פעמים עם 200 microliters של מים autoclaved. להדביק את הביצים במצמד הביצים המעוקר באמצעות פעמיים 10 עד 6 תאים לכל מיקרוליטר של ספריית המוטציות השטופה ב- PBS.יומיים לאחר פתח הזחלים הנגוע של הזחלים, אסוף זחלי 100 שניות לכל צינור מיקרופוגה 1.5 מיליליטר ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ליצור את ספריית בקרת ההפריה החוץ גופית, לחסן 250 מיקרוליטרים של פעמיים 10 ל -6 תאים לכל מיקרוליטר של ספריית המוטציות ב 10 מיליליטר של מדיום KB המכיל Kanamycin. לאחר חילוץ DNA מן in vivo ו אין ויטרו ספריות מוטציות גדל, לשתף את ה- DNA עם ultrasonicator.כדי לבדוק אם הדנ"א היה גזירה לטווח הגודל הרצוי, לטעון חמישה microliters של DNA unsheared ו גזירה לאחר ערבוב עם צבע טעינת ג'ל ביחס אחד לאחד על 1.6% agarose ג'ל לרוץ ב 250 וולט במשך 40 דקות. כדי להכין את קצות השבר הנדרשים לקשירת מתאם, התחל על ידי הוספת שלושה מיקרוליטרים של תערובת האנזימים ושבע מיקרוליטרים של מאגר תגובה ל -50 מיקרוליטרים של ה- DNA הגועה ומערבבים היטב על ידי צנרת. הגדר תרמוציטר עם מכסה מחומם ב גדול או שווה ל 75 מעלות צלזיוס ודגור את הדגימות במשך 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ו 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להחזיק את הטמפרטורה בארבע מעלות צלזיוס.עבור קשירת מתאם, הוסף 30 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר קשירה, מיקרוליטר אחד של משפר קשירה, ו 2.5 מיקרוליטרים של מתאם מדולל למוצרים של שלב הכנת הקצה. מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה של הדגימה במשך 15 דקות ב 20 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר עם המכסה מחומם כבוי. לאחר 15 דקות, מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של האנזים.מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה המדגם במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר עם המכסה מחומם גדול או שווה 47 מעלות צלזיוס. כדי לבחור את הגודל של מתאם קשירת DNA פילוח שברים של 250 זוגות בסיס, להתחיל על ידי מערבולת פתרון החרוז המגנטי ומניחים אותו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפני השימוש. מוסיפים פי 0.3 חרוזים ל-96.5 מיקרוליטרים של תערובת הדנ"א המקשר ומערבבים על ידי צנרת יסודית.לדגור את תערובת החרוזים במשך חמש דקות. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי כדי למשוך את החרוזים ולהסיר שברי DNA בגודל לא רצוי. תן לחרוזים להסתפק במשך חמש דקות ואז להעביר את supernatant ברור לצינור microfuge חדש.מוסיפים פי 0.15 חרוזים טריים לסופר-טבעי ומערבבים על ידי צנרת טובה. לדגור על תערובת החרוזים במשך חמש דקות ולאחר מכן למקם את הצינורות על עמדה מגנטית כדי למשוך את החרוזים הקשורים לדנ"א היעד. המתן חמש דקות ולאחר מכן להשליך את supernatant, שמירה על החרוזים.עם החרוזים על הדוכן המגנטי, להוסיף 200 microliters של 80% אתנול מוכן טרי ולחכות 30 שניות לפני השלכת האתנול מבלי להפריע החרוזים. הסר את הצינורות מהמעמד והוסף 17 מיקרוליטרים של TE 0.1X או TE נמוך, ולאחר מכן לערבב על ידי pipetting 10 פעמים ודגורה התערובת בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. הנח את הצינור על העמדה המגנטית ולקחת 15 microliters של ה- DNA שנבחר בגודל עבור PCR-1.מערבולת סטרפטבידין חרוזי ומניחים אותם בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפחות. קח 32 מיקרוליטרים של החרוזים ולשטוף אותם עם 500 microliters של 1X לאגד ולשטוף חוצץ. הוסף 32 מיקרוליטרים של 2X לאגד ולשטוף חוצץ ו resuspend החרוזים.לכך, הוסף 32 מיקרוליטרים של מוצרי PCR-1 המנוקים. מערבבים היטב ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מניחים את תערובת ה- DNA של החרוזים על מעמד מגנטי במשך שתי דקות.פיפטה את supernatant כמו ביוטין מתויג DNA המכיל את קצה הכניסה נקשר סטרפטאבידין על החרוזים. לשטוף את החרוזים עם 500 microliters של 1X לאגד ולשטוף חוצץ, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים עם 200 microliters של TE נמוך. תקיף מחדש את החרוזים הקשורים לדנ"א ב-17 מיקרוליטרים של TE נמוך. הדנ"א של ספריות המוטציות הגדלות של in vivo ו- במבחנה שחולצו ומפוצלות באולטרסאונד הראו שרוב השברים משתרעים בין 100 ל -400 זוגות בסיסים. המיקום של כניסות בתיווך טרנספוסון על פני ארבעת השיברים של זן גלדיולי Burkholderia גנום ניתן לראות בתרמיל.ניתן לראות בטבלה סיכום של פלט הרצף ומספר ההוספות והגנים הייחודיים שנפגעו בשלושת השכפולים בספריות vivo ו- במבחנה. הדבר החשוב לזכור הוא לחשב את גודל צוואר הבקבוק של האוכלוסייה במהלך קולוניזציה מארחת כדי לקבל ייצוג הולם של הספרייה במהלך ההדבקה. כמו כן, התאימו למספר תואם של דורות חיידקיים במבחנה ובמארח.לאחר יצירת ספריית המוטציות של טרנספוסון, ניתן להקרין אותה באמצעי תקשורת סלקטיביים כדי לשחזר מוטנטים המבוססים על הבדלים פנוטיפיים. גנים ספציפיים החשובים למצב יכולים אפוא להיות מזוהים.

transposon-insertion-sequencing-as-tool-to-elucidate-bacterial

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Kazi, M. I., et. al., יצירת ספריות החדרת טרנספוזונים בחיידקים גראם-שליליים לריצוף תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את הבחירה, הכימות והשימור של חיידקים נמענים גראם-שליליים הנושאים החדרות טרנספוזונים על סמך עמידות לקנמיצין.

בידוד של חיידקים גראם-שליליים עם החדרת טרנספוזון גנומי

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

. כאן, עוצמת הכניסה אקראי בתיווך transposon של רכיב ה-DNA ללא קידוד שימש כדי לפתור את מעמדה כרומוזומלית אופטימלית.

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

המובאת כאן היא שיטה פשוטה ליצירת ספריית ההכנסה transposon בצפיפות גבוהה ב- Escherichia coli או שיגלה flexneri באמצעות קוניוגציה. פרוטוקול זה מאפשר היצירה של אוסף של מאות אלפי מוטציות ייחודיות של חיידקים על ידי החדרת גנומית אקראי transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

נתאר כאן טכניקה המשלבת מוטגנזה מכוונת transposon עם תפוקה גבוהה רצף כדי לזהות ולכמת transposon מוטציות leptospiral ברקמות לאחר אתגר של אוגרים. פרוטוקול זה יכול לשמש המוטנטים מסך עבור הישרדות והפצה בבעלי חיים, ניתן להחיל גם על מחקרים במבחנה .

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

המבחן rotorod משמש כדי להעריך את מצב המנוע בתנועת הליכה של חמי פרקינסון חולדות אנלוגי.

השימוש Rotorod כשיטה לניתוח איכותי של הליכה עכברוש

חקור שיטות ריצוף הכנסה טרנספוזון לזיהוי גורמי קולוניזציה חיידקיים ב-Burkholderia gladioli סימביונט של Lagria villosa. שיטה זו מאפשרת הבנה מולקולרית של יחסי סימביוזה בחסרי חוליות.

רצף הכנסה טרנספוסון ככלי להבהב גורמי קולוניזציה חיידקיים בבורקהולדריה גלדיולי סימביונט של לגריה וילוסה בילס

גלה סרטונים נוספים