כימות של תחרות בין-בקטריאלית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חד-תאית
2 בספטמבר 2021
כתב יד זה מתאר שיטה לשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית חד-תאית כדי לדמיין ולתמת תחרות חיידקים בקוקולטורה.
שיטה זו נועדה לכמת תחרות תלוית מגע באמצעות מערכת הפרשת סוג VI בין זני חיידקים ברמת התא הבודד. טכניקה זו משתמשת בשטח התא הכולל ולא בספירת תאים כדי לכמת תחרויות חיידקים, מה שמקל על חוקרים ללא גישה קניינית לתוכנת ניתוח תמונה. שיטה זו יכולה להשתנות בקלות כדי לכמת תחרות בין חיידקים מגוונים הניתנים לתחנות.
בנוסף, ניתן למטב את ההתקנה הניסיונית לשימוש במיקרוסקופים זקופים או הפוכים. ראשית, להכין את פתרון כרית אגרוז על ידי המסת 2% הפשרה נמוכה agarose לתוך PBS ימי. מחממים את התמיסה לזמן קצר במשך כ -30 שניות במיקרוגל ובמערבולת עד שהאגורוז מומס לחלוטין.
שמור על פתרון זה באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש. לאחר מכן, לעטוף חתיכת קלטת מעבדה סביב שקופית זכוכית חמש פעמים. גלישה חוזרת של סרט מדידה באותה שקופית, כך שהמרחק בין שתי חלקי הקלטת קטן במעט מרוחב הכיסוי.
כדי להבטיח משטח כרית אגרוז שטוח, תמיסת אגרוז חמה פיפטה בין שתי חתיכות הסרט ומיד לשים כיסוי על גבי כך כיסוי יוצר קשר עם הנוזל ודוחף החוצה את כל בועות בתמיסת agarose. תן כרית אגרוז להתמצץ בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן לחתוך כרית אגרוז זה עם סכין גילוח לארבעה רפידות 5 מילימטר מרובע לשמש להדמיה.
כדי להכין את הזנים לדגירה משותפת, פס החוצה כל זן מן המלאי קפוא על לוחות אגר LBS בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לדגורת לילה ב 24 מעלות צלזיוס. למחרת, לבחור שתי מושבות מכל זן ו resuspend המושבות באנטיביוטיקה בתוספת LBS בינוני. דגירה מושבות respended לילה ב 24 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סיבובים לדקה.
למחרת בבוקר, תת-תרבות כל ביולוגי לשכפל אחד לתוך 1, 000 פעמים בינוני LBS טרי ללא אנטיביוטיקה ודגרה עד התאים מגיעים לצפיפות אופטית של כ 1.5 ב 600 ננומטר. למדוד ולתעד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר עבור כל הדגימות. לנרמל כל מדגם לצפיפות אופטית של אחד על ידי דילול התרבות עם מדיום LBS.
מערבבים את שני הזנים המתחרים ביחס שווה על ידי הוספת 30 מיקרוליטרים של כל זן מנורמל לצינור 1.5 מיליליטר שכותרתו. מערבולת את תרבות המתח המעורבת למשך שנייה עד שתי שניות. מערבבים את הזנים המתחרים עבור כל שכפול ביולוגי וטיפול כדי ליצור בסך הכל ארבעה צינורות זנים מעורבים.
מרכז כל תרבית מעורבת פי שלושה על ידי צנטריפוגה כדי להבטיח תאים מתחרים צפופים מספיק להרג תלוי מגע במהלך דגירה משותפת. יש להשליך את הסופר-נט, להזרים כל גלולה ל-20 מיקרו-ליטרים של מדיום LBS ולבצע הליכי ריכוז עבור כל דגימה. אם הדמיה על מיקרוסקופ הפוך, התחילו באיתור שני מיקרוליטרים של תרבות מעורבת על החלק התחתון של צלחת פטרי באורך 35 מ"מ והנחו את כרית האגורוז מעל נקודת הדגירה המשותפת.
מניחים כיסוי זכוכית עגולה 12 מ"מ מעל כרית האגורוז. תצפית חוזרת והצבת כיסויים לשלוש התרבויות המעורבות הנותרות, מה שיביא לתמונה של ארבע מנות. לפני שתמשיך קדימה, תן לשקופיות לשבת על הספסל במשך כחמש דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב על כרית אגר כדי למנוע תנועה במהלך תהליך ההדמיה.
התחל על-ידי התמקדות בתאים המשתמשים ב- DIC כדי למזער אפקטי ליקונומיקה. בהתבסס על הגודל הממוצע של תא חיידקי יחיד, השתמש במטרה שמן 100X. התאם את זמן החשיפה ואת הגדרות הרכישה עבור כל ערוץ עם זיהוי רקע מינימלי.
בחר לפחות חמישה שדות תצוגה ורכוש תמונות בכל ערוץ מתאים. פתח את תוכנת ניתוח התמונה וייבוא קבצי התמונה לניתוח. המר את התמונה לגווני אפור, הפרד את הערוצים ולהתחיל על-ידי הוספת סף ויצירת מסיכה בינארית של התמונה המעובדת מראש.
בחרו 'נתח' ולאחר מכן מהתפריט הנפתח, בחרו 'קבע קנה מידה' והזן את הערכים המתאימים להגדרת המיקרוסקופיה. לאחר מכן, עבור אל הגדרת מדידות ובחר אזור. תחת הכרטיסיה ניתוח, בחר ניתוח חלקיקים באמצעות הגדרות ברירת המחדל.
אם קיימים פסולת במדגם, ניתן להתאים את הגודל או המעגליות כדי לסנן חלקיקים שאינם תאים. בחר הצג ולאחר מכן חלוקה לרמות כך שהפלט של ניתוח סינון החוצה יכלול חלוקה לרמות ממוספרת של כל החלקיקים שנותחו. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני לניתוח וגרף נוספים.
תמונות הפלואורסצנטיות הייצוגיות של כל טיפול ניסיוני מוצגות. ריכוז תרבית מעורבת לפני התצפית הביא לתאי יעד מעוגלים או נעלמים במשך שעתיים, מה שמצביע על עיכוב מוצלח. כאשר התרבות המעורבת אינה מרוכזת, התאים נשארים מפוזרים בשקופית.
ללא מגע מספיק בין תא לתא, זן המטרה אינו מעוכב על ידי הזן הקטלני. תאי המטרה לא נעלמו ולא התעגלו כאשר דוגר עם מוטציה T6SS בתנאים צפופים או מפוזרים. לפיכך, המטרה הייתה חסרת מעצורים באף אחד מהטיפולים.
תוצאות ניתוח החלקיקים גרפו ונותחו הן עבור זן היעד והן עבור זן המעכב. יותר מ-100% מאזור היעד ההתחלתי בנקודת הזמן הסופית מייצג עלייה נטו ביעד ונמוך מ-100% משטח היעד הראשוני הצביע על ירידה נטו ביעד. הצמיחה נטו של זן המדכא נצפתה בכל הטיפולים.
עם זאת, אחוז השטח הראשוני עבור זן המעכב היה גבוה משמעותית כאשר מעכב מסוג בר היה דוגר יחד עם היעד בתנאים צפופים בהשוואה לכל הטיפולים האחרים. כדי לקבל תמונות ברורות, כרית אגרוז צריך להיות שטוח ככל האפשר. גזור חתיכות סרט הדבקה לפני גלישתן סביב השקופית כדי לוודא שהן באותו אורך.
סקירה
מחקר זה מציג שיטה המשתמשת במיקרוסקופית פלואורסצנטית של תא יחיד כדי לבחון תחרות חיידקית בתרבית משותפת, תוך התמקדות בתחרות תלוית מגע המתווכת על ידי מערכת ההפרשה מסוג VI. הפרוטוקול מאפשר כימות על בסיס שטח התא הכולל, מה שהופך אותו לנגיש לחוקרים שחסרים תוכנת ניתוח תמונות מתמחה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- תחרות מיקרוביאלית
- אינטראקציות תאיות
- טכניקות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- תחרות תלוית מגע בין חיידקים היא קריטית להבנת האקולוגיה המיקרוביאלית.
- מערכת ההפרשה מסוג VI משחקת תפקיד משמעותי באינטראקציות בין-חיידקיות.
- שיטות קיימות עשויות לדרוש תוכנת ניתוח תמונות מתמחה, מה שמגביל את הנגישות עבור חוקרים רבים.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תא יחיד
- כימות של תחרות חיידקית באמצעות שטח התא הכולל
- הכנה שלב אחר שלב של רפידות אגרוז וזנים חיידקיים לצורך הדמיה
תוצאות עיקריות
- הריכוז של תרבויות מעורבות שיפר באופן יעיל את עיכוב התאים המטרה.
- הוכח שהצמיחה הנטו של זני המעכבים משתנה בתנאים שונים.
- הדגיש את החשיבות של מגע תא-לתא ביעילות העיכוב.
מסקנות
- המחקר מציג שיטה פשוטה ומתאימה לכימות תחרות חיידקית.
- עבודה זו עוזרת להבנת אינטראקציות מיקרוביאליות וניתן ליישמה על מיקרובים שונים שניתן לתרבתם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative single-cell fluorescence imaging of interbacterial competition enables precise interrogation of microbial interactions that shape microbiome structure and function. This approach provides reproducible, accessible measurement of competitive dynamics, supporting mechanistic de-risking and target validation in microbiome-focused discovery. The method's adaptability and quantitative outputs position it as a reusable capability for early-stage R&D and translational microbiome research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of contact-dependent bacterial antagonism at single-cell resolution.
- Supports functional validation of microbial effectors such as the type VI secretion system in competitive contexts.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between contact-dependent and independent effects.
- Provides quantitative metrics for hypothesis-driven interrogation of microbial interactions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible imaging workflows for evaluating competitive phenotypes across bacterial strains.
- Generates quantitative area-based outputs suitable for comparative analysis and downstream screening.
- Enables assay scalability and platform reuse across diverse culturable isolates and microbiome models.
- Supports robust evaluation of candidate strains or effectors in competitive environments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant microbiome models by enabling quantification of interbacterial dynamics.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of microbial interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of microbiome-targeted therapeutics based on quantitative competition data.
- Facilitates translational biomarker development by linking competitive outcomes to functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbiome-targeted R&D, supporting both hypothesis testing and quantitative screening.
- Discovery Biology: Quantifies competitive interactions to clarify microbial pathways and validate effector function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative area measurements for robust comparison of strain phenotypes.
- Analytics: Enables statistical analysis of competitive outcomes using open-source image analysis tools.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by supporting disease-relevant competition assays.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports broad application across microbiome research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces biological risk in microbiome therapeutic pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to upright or inverted epifluorescence microscopes and open-source analysis software (FIJI/ImageJ).
- Demands cross-team standardization of slide preparation and imaging parameters for reproducibility.
- Adaptable to various culturable bacterial systems with protocol optimization for growth and imaging conditions.
- Dependent on high-quality agarose pad preparation and careful experimental setup for optimal imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Agarose Pad Preparation
1:47
Co-Incubation Strain Preparation
2:37
Bacterial Strains Coincubation
3:35
Slide Setup
4:17
Fluorescence Microscopy
4:46
Image Analysis
5:50
Results: Fluorescence Image Analysis to Assess Target Strain Inhibition in Coincubation Assay
7:08
Conclusion
