הכנת מיקרוקפסולות רב תכליתיות על בסיס משי עמוסות בפלסמידים DNA המקודדים RNA Aptamers ו-Riboswitches

המשמעות של פרוטוקול זה היא בכך שהוא מספק אמצעי לשמירה על תפקוד חיישנים מקודדי DNA על ידי קיבוע תבניות פלסמיד DNA למיקרו-קפסולות תואמות ביולוגיות חדירות למחצה. טכניקת קיבוע ה-DNA המוצעת היא רב-תכליתית. הוא מאפשר ייצור של חיישנים ביולוגיים רב-תכליתיים עם מנגנוני הפעלה שונים במבחנה.

אנו מדמיינים את המיקרו-קפסולות הללו, יחד עם רכיבי החישה המתאימים, יכולות לשמש לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, כולל שחרור מולקולות איתות בסביבות שונות כגון ביופילמים ואיברים. טכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי המערכות הביולוגיות בקנה מידה מיקרו, במיוחד כיצד קיבוע של DNA וצפיפות מולקולרית יכולים להשפיע על הקינטיקה ומנגנון הפעלת הגנים. התחל בתצהיר של שכבת הפוליאתילן הראשונית על חלקיקי הסיליקה הקורבנית, או SiO2, על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת פוליאתילן ל-300 מיקרו-חלקיקים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר.

מערבבים את התערובת ב-ThermoMixer ב-800 סיבובים לדקה בתנאי הסביבה. אוספים את המיקרו-חלקיקים על ידי צנטריפוגה ב-0.2 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ומסירים בזהירות את הסופרנטנט. לאחר 15 דקות, שטפו את המיקרו-חלקיקים ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של מים נטולי יונים ללא DNase ו-RNase על ידי צנטריפוגה ב-0.2 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט לאחר כל צנטריפוגה.

לאחר מכן, התאם את ריכוז פלסמידי ה-DNA מ-50 עד 200 ננוגרם למיקרוליטר עם מים מזוקקים ללא DNase ו-RNase, והשתמש במיליליטר אחד של התמיסות המוכנות כדי להפקיד את ה-DNA על המיקרו-חלקיקים המוכנים בפוליאתילן. מערבבים בעדינות את תערובת המיקרו-חלקיקים ב-ThermoMixer ב-4 מעלות צלזיוס ו-800 סל"ד למשך 15 דקות, ולאחר מכן אוספים את המיקרו-חלקיקים על ידי צנטריפוגה ב-0.2 גרם למשך דקה אחת. סמן את הצינורות עבור פלסמידים של DNA המקודדים ריבו-מתג תיאופילין, יחד עם GFPa1 כ-ThyRS-GFPa1, ופלסמידים של DNA המקודדים אפטמר ברוקולי כ-BrocApt.

הסר בזהירות את הסופרנטנט, ושטוף את המיקרו-חלקיקים ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים ללא DNase ו-RNase כפי שהודגם קודם לכן, והשליך את הסופרנטנט לאחר כל צנטריפוגה. כדי להפקיד את שכבת פיברואין המשי, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת פיברואין משי מימית משוחזרת למיקרו-חלקיקים הנספגים ב-DNA, ומערבול בעדינות את התערובת על ה-ThermoMixer ב-750 סל"ד למשך 15 דקות ב-10 מעלות צלזיוס. אסוף את המיקרו-חלקיקים על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן שטוף אותם פעם אחת עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים ללא DNase ו-RNase, כפי שהוסבר קודם.

חזור על הצנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט. הוסף 0.5 מיליליטר מים מזוקקים DNase ו-RNase, וערבב את המיקרו-חלקיקים על ידי מערבולת. לאחר מכן, טפל במיקרו-חלקיקים עם 0.5 מיליליטר של 100% מתנול ב-10 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ב-ThermoMixer.

לאחר איסוף המיקרו-חלקיקים על ידי צנטריפוגה, טפל בחלקיקים ב-100% מתנול ב-ThermoMixer ב-750 סיבובים לדקה למשך 10 דקות ב-10 מעלות צלזיוס להיווצרות יריעות בטא. צנטריפוגה את התערובת ב-0.2 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף מיקרו-חלקיקים לפני שטיפת החלקיקים פעמיים עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים ללא DNase ו-RNase כפי שהודגם קודם לכן. ממיסים ליבות SiO2 של מיקרו-חלקיקים על ידי הוספת תמיסת חומצה הידרופלואורית של 8% למיקרו-חלקיקי מעטפת ליבה גלולה.

העבירו את תמיסות החלקיקים המומסים למכשירי דיאליזה, ודיאליזה כנגד מים נטולי יונים בכוס. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לאסוף את תרחיף המיקרו-קפסולות המשי ממכשירי דיאליזה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה חדשים של שני מיליליטר. העבירו 100 מיקרוליטר מדגימת המיקרו-קפסולה לבאר אחת של שקופיות זכוכית בעלות שמונה תאים, ואפשרו לקפסולות לשקוע במשך 20 עד 30 דקות לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, או CLSM.

פיפטה 100 מיקרוליטר של מתלי הקפסולות לכל באר של מגלשת זכוכית תא. לכל באר, הוסף ברצף 300 מיקרוליטר של תמיסת הפלואורופור במשקלים מולקולריים משתנים מהנמוך לגבוה ביותר. מערבבים את התערובת על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ונותנים לתערובת לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר עד שהדיפוזיה של תמיסות הפלואורופור מגיעה לשיווי משקל.

מאוחר יותר, העבירו את השקופית ל-CLSM כדי לדמות כל באר באמצעות מטרת טבילת נפט פי 100 באורך גל עירור של 488 ננומטר. זהו את אזור העניין על ידי התאמת מישור המוקד, והתמקדו בקפסולות המופיעות בצורת עיגולים בקוטר הגדול ביותר. בצע תגובת שעתוק/תרגום במבחנה על ידי הוספה רציפה של הרכיבים נטולי התאים לדגימה של מיקרו-קפסולות ודגירת הצינור ב-30 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

בדוק את הקרינה בקורא צלחות באמצעות אורך גל עירור ב-488 ננומטר ופליטה עבור מסנן GFP/FITC בסביבות 510 ננומטר. לבסוף, דמיין את מיקרו-קפסולות המשי במערכת CLSM באמצעות לייזרים ב-488 ו-561 ננומטר. במחקר יוצרו מיקרו-קפסים חזקים של פיברואין משי בגודל הומוגני של כ-4.5 מיקרומטר ועובי מעטפת של כ-500 ננומטר.

החדירות של קליפות קפסולת הפיברואין החלולות של המשי נותחה על ידי ביצוע שיטת חיתוך המשקל המולקולרי. עלייה בריכוז שכבת הפוליאתילן הראשונית מובילה ליציבות קולואידית מוגברת של מיקרו-קפסולות עם קליפות חדירות יותר, בעוד שביטול השכבה הראשונית גורם להצטברות של כמוסות עם ממברנות קליפה פחות חדירות. קינטיקה של ביטוי GFPa1 במהלך הפעלת ThyRS חשפה הפעלה גבוהה יותר של גן GFPa1 מפלסמידים של DNA שנטענו במיקרו-קפסולות משי מאשר DNA בקרה שאינו מכוסה.

בניתוח המייצג מוצגות תמונות CLSM של כמוסות פיברואין משי עמוסות ב-32 עותקי DNA לכל כמוסה לפני ואחרי הדגירה בתעתיק במבחנה, מערכת התרגום. פרופילי עוצמת החתך של כמוסות הפיברואין המשי הדגימו את הביטוי של GFPa1. קינטיקה השעתוק של 20 מיקרו-קפסולות משי שכבתיות עמוסות ב-30 עותקי DNA לכל קפסולה הושוותה ל-DNA ביקורת שאינו מכוסה.

אות הפלט הגבוה יותר ממיקרו-קפסולות משי מאשר דגימות DNA לא מכוסות בריכוזים שווי ערך אישר את היעילות של מיקרו-קפסולות משי. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן ליישם מספר טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כדי לדמות שזירה של DNA במצב משותק ותהליך הפעלת גנים מנותק במבחנה. ניתן ליישם טכניקה זו כדי לענות על דינמיקה ברמה המולקולרית בתאים מלאכותיים מינימליים.

באופן ספציפי, בשילוב עם אלמנטים גנטיים מתאימים, ניתן להשתמש במיקרו-קפסולות לחקר תקשורת בין תאים.