Name: זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: חקור פרופיל ריבוזום סלקטיבי לזיהוי גלובלי של אינטראקציות בין תרגומים משותפים ב-Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר של אינטראקציות אלו בקרבת רזולוציית קודון ותורמת להבנת מנגנוני מחלות הקשורות לקיפול חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה על הדיונים הפוריים ולמוחמד מחזומי על הקריאה הביקורתית בכתב היד. עבודה זו מומנה על ידי מענק ISF (הקרן הישראלית למדע) 2106/20.

<ol><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+reveals+the+cotranslational+chaperone+action+of+trigger+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo.</a> Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+as+a+tool+for+studying+the+interaction+of+chaperones+and+targeting+factors+with+nascent+polypeptide+chains+and+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).</li>
<li>Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+to+study+interactions+of+translating+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Knorr, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-NatA+architecture+reveals+that+rRNA+expansion+segments+coordinate+N-terminal+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).</li>
<li>Matsuo, Y., Inada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+collision+sensor+Hel2+functions+as+preventive+quality+control+in+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway.</a> Cell Reports. 34 (12), (2021).</li>
<li>Döring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Ssb-Nascent+chain+interactions+reveals+principles+of+Hsp70-assisted+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+signal-independent+SRP+preloading+during+membrane+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting.</a> Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolbox+for+PCR-based+tagging+of+yeast+genes%3A+New+fluorescent+proteins%2C+more+markers+and+promoter+substitution+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes.</a> Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).</li>
<li>Levi, O., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Gene+Engineering+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae.</a> Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
<li>Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf</a> (2019).</li>
<li>Kanagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+and+artifacts+in+multitemplate+polymerase+chain+reactions+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR).</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), (2021).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ribosome-associated+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).</li>
<li>Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+translation+in+budding+yeast+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820(2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

כאן, הפרוטוקול מפרט את גישת פרופיל הריבוזומים הסלקטיבית ללכידת אינטראקציות של תרגום משותף ברזולוציה של כמעט קודון. ככל שהריבוזום עולה כמרכז לתיאום הופעת השרשרת המתהווה לתוך הציטופלסמה הצפופה, זוהי שיטה חיונית לזיהוי ואפיון האינטראקציות השונות של התרגום המשותף הנדרשות כדי להבטיח פרוטאום תפקודי, כמו גם לחקר מחלות שונות. נכון להיום, SeRP היא השיטה היחידה שיכולה ללכוד ולאפיין את האינטראקציות הללו, באופן ישיר, in vivo 14,15,16.</s...

Selective Ribosome Profiling (SeRP) היא השיטה היחידה, עד כה, הלוכדת ומאפיינת אינטראקציות תרגום משותף, in vivo, באופן ישיר 1,2,3,4,5,6. SeRP מאפשר פרופיל גלובלי של אינטראקציות של כל גורם עם תרגום ריבוזומים ברזולוציה של כמעט קודון 2,7.
השיטה מסתמכת על הקפאת הבזק של תאים גדלים ושמירה על תרגום פעיל. לאחר מכן, ליזטים של תאים מטופלים באמצעות RNase I כדי לעכל את כל ה-mRNA בתא, למעט שברי mRNA המוגנים על-ידי ריבוזומים המכונים "עקבות ריבוזומים". לאחר מכן מתפצלים המדגם לשני חלקים; חלק אחד משמש ישירות לבידוד של כל עקבות הריבוזומליות התאיות, המייצגות את כל התרגום המתמשך בתא. החלק השני משמש לטיהור זיקה של תת-קבוצה ספציפית של ריבוזומים הקשורים לגורם עניין, לדוגמה: שינוי אנזימים, גורמי טרנסלוקציה, מלווים מתקפלים ואינטראקציות של הרכבה מורכבת. עקבות הריבוזומליות המטוהרות זיקה נקראות באופן קולקטיבי האינטראקציה. לאחר מכן, ה-mRNA המוגנים בריבוזום מופקים ומשמשים ליצירת ספריית cDNA, ולאחר מכן לריצוף עמוק.
ניתוח השוואתי של סך כל דגימות התרגום והאינטראקציה מאפשר זיהוי של כל האורפים המתקשרים עם גורם העניין, כמו גם אפיון של כל פרופיל אינטראקציה של orf. פרופיל זה מדווח על רצפי ההתחלה והסיום המדויקים של ההתקשרות שמהם ניתן להסיק את הקודונים המפוענחים ואת השאריות המתאימות של שרשרת הפוליפפטידים המתהווה, כמו גם על שינויי מהירות הריבוזומים במהלך האינטראקציה 7,8. איור 1 מתאר את הפרוטוקול כשרטוט.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2.jpg"> איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול SeRP. פרוטוקול זה יכול להתבצע בשלמותו תוך 7-10 ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table><tbody><tr><td>3'-זרחן 28 nt בקרת RNA אוליגונוקלאוטיד</td><td>IDT</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>טיהור HPLC ללא RNase; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'אתנול</td></tr> <tr><td>מוחלט</td><td>VWR</td><td>20821</td><td></td></tr><tr><td>פנול חומצה&ndash; כלורופורם</td><td>אמביון</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן: עכבר חד שלטי אנטי-HA</td><td>Merck</td><td>11583816001</td><td>12CA5</td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>רוט</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>ATP*</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD</td><td>211820</td><td></td></tr><tr><td>בקטו טריפטון</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>211699 תמצית שמרי בקטו</td><td>BD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>בסטטין הידרוכלוריד</td><td>רוט</td><td>2937.2</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase II ssDNA Ligase*</td><td>Epicentre</td><td>CL9025K</td><td>100 U/&mu; L</td></tr><tr><td>תמיסת צביעה קולואידית Coomassie</td><td>Roth</td><td>4829</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, טבליות קוקטייל מעכבות פרוטאז נטולות EDTA Roche</td><td>Diagnostics</td><td>29384100</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Biological Industries</td><td>A0879</td><td></td></tr><tr><td>DEPC מים מטופלים ומסוננים סטריליים*</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז נטול מים</td><td>Merck</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>דיאתילפירוקרבונט</td><td>Roth</td><td>K028</td><td></td></tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד*</td>סולם DNA <td>276855</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>, 10 bp O'RangeRuler*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1313</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת DNA*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0631</td><td>6&times;</td></tr><tr><td>DNase I,</td> סט תמיסות <td>dNTP ללא רוש</td><td>4716728001</td><td>רקומביננטי</td></tr><tr><td>*</td><td>NEB</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA*</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>VWR</td><td>24388.260.</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גליצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67419-1ML-F</td><td>1 M</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td>15 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>HF פולימראז *</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>HK מ- S. cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6380-1.5KU</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>AppliChem</td><td>A1305</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;-D-1-תיוגלקטופירנוסיד</td><td>רוט</td><td>CN08</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td></td><td>רוט T832.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>רוט</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>KH<תת>2</תת>PO<תת>4</תת></td><td>רוט</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>רוט</td><td>CN33.4</td><td></td></tr><tr><td>Linker L(rt)</td><td>IDT</td> הזמנה <td></td><td>מותאמת אישית</td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td><td></td>נוזלי</tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Roth</td><td>T879.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl*</td><td>Invitrogen</td><td>AM97606</td><td>5 M</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 4 חרוזים מהירים המופעלים על ידי NHS GE</td><td>Life Sciences</td><td>17090601</td><td></td></tr><tr><td>תחליף Nonidet P 40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Roth</td><td>2936.2</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתיל סולפוניל פלואוריד</td><td>Roth</td><td>6367</td><td></td></tr><tr><td>ג'לים טרומיים</td><td>Bio-Rad</td><td>5671034</td><td>10% ו-12%</td></tr> <tr><td>RNase I</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SDS, 20%</td> <td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>RNase</td></tr><tr><td>free נתרן אצטט*</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td>3 M, pH 5.5</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Merck</td><td>S8032-100G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Roth</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד*</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>1 N</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase מעכב</td><td>אמביון</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III טרנססיפטאז הפוך*</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold*</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד קינאז*</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ליגאז 2*</td><td>NEB</td><td>M0242L</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל פוליאקרילאמיד TBE*</td><td>Novex</td><td>EC6215BOX</td><td>8%</td></tr> <tr><td>TBE&ndash; ג'ל אוריאה פוליאקרילאמיד*</td><td>Novex</td><td>EC68752BOX</td><td>10%</td></tr> <tr><td>TBE&ndash; ג'ל אוריאה פוליאקרילאמיד*</td><td>Novex</td><td>EC6885BOX</td><td>15%</td></tr> <tr><td>TBE&ndash; מאגר דגימת אוריאה*</td><td>Novex</td><td>LC6876</td><td>פעמיים;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9851</td><td>1 M, pH 7.0</td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>1 M, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure 10&times; מאגר TBE*</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>* - לאטם להכנת</td><td></td><td></td><td></td>ספרייה</tr><tr><td>ומהדק קפיץ, 90 מ"מ,</td> <td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>XX1009020 בקבוק מפרק טחון 1 ליטר,</td> <td>Millipore</td><td>XX1504705</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

בשנים האחרונות התברר כי ריבוזומים לא רק מפענחים את ה-mRNA שלנו אלא גם מנחים את הופעתה של שרשרת הפוליפפטידים לסביבה התאית הצפופה. ריבוזומים מספקים את הפלטפורמה לקשירה מבוקרת מרחבית וקינטית של גורמי מיקוד ממברנה, אנזימים משנים ומלווים מתקפלים. אפילו ההרכבה לקומפלקסים אוליגומריים מסדר גבוה, כמו גם לשלבי היווצרות רשת חלבונים-חלבונים, התגלו לאחרונה כמתואמים עם סינתזה.
כאן אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה שפותחה כדי ללכוד אינטראקציות תרגום משותף in vivo. אנו נפרט את שלבי טיהור הזיקה השונים הנדרשים ללכידת קומפלקסים של שרשרת ריבוזום-מתהווה יחד עם אינטראקציות תרגום משותף, כמו גם את שלבי מיצוי ה-mRNA, הרחקת הגודל, השעתוק ההפוך, הריצוף העמוק וניתוח הביג-דאטה, הנדרשים כדי לפענח אינטראקציות של תרגום משותף ברזולוציה של כמעט קודון.

כפי שמודגם בתרשים הזרימה של פרוטוקול זה (איור 1), התאים גודלו לפאזה של רישום, ולאחר מכן נאספו במהירות על ידי סינון ונשחקו על ידי שחיקה קריוגנית. לאחר מכן חולק הליסאט לשניים: האחד עבור עקבות mRNA כוללות המוגנות על-ידי ריבוזומים והשני עבור עקבות mRNA נבחרות המוגנות על-ידי ריבוזומים, שבהן ביצענו טיהור זיקה כדי למשוך מטה את קומפלקסי השרשראות המתהוות של חלבון-ריבוזום-מתהווה. הבטחנו את ביטוי החלבון המתויג ואת הצלחת המשיכה כלפי מטה על ידי ניתוח כתמים מערבי, כפי שניתן לראות באיו...

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויי שרשרת מתהווים המכוונים למסלולי קיפול והרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזומים סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר in vivo של אינטראקציות אלה במודל אאוקריוט Saccaromyces cerevisiae. פרופיל ריבוזומים סלקטיבי הוא השיטה היחידה עד כה שלוכדת ומאפיינת אינטראקציות בין תרגומים משותפים in vivo באופן ישיר.פרופיל ריבוזומים סלקטיבי מאפשר פרופיל גלובלי של כל הגורמים והאינטראקציות עם תרגום ריבוזומים ברזולוציה של כמעט קודון. התחילו באיסוף תאי השמרים הבנויים המכילים את החלבונים המתויגים הרצויים. בצע ליזיס תאי באמצעות טחינה קריוגנית במפעל מיקסר פעמיים במשך שתי דקות ב 30 הרץ.צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 30, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את הליזאט, ולאסוף את supernatant. העברת 200 מיקרוליטרים של הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוג' לצורך ניתוח RNA כולל ו-700 מיקרוליטרים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה לטיהור חיסוני. לעכל את דגימת הרנ"א הכוללת שהופרדה בעבר באמצעות 10 יחידות של RNase I למשך 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס על מתלה ערבוב מסתובב ב-30 סיבובים לדקה.הכן את תערובת המאסטר של כרית הסוכרוז כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, טען את הדגימה על 400 מיקרוליטרים של כרית הסוכרוז והצנטריפוגה למשך 90 דקות ב 245, 000 פעמים G ובארבע מעלות צלזיוס. הסר את ה-supernatant במהירות באמצעות משאבת ואקום וכיסה כדוריות עם 150 מיקרוליטרים של מאגר ליזיס.אבטחו את הדגימה באמצעות עטיפת פרפין והחזירו את הכדורים על ידי טלטול במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס ב-300 סיבובים לדקה. שטפו 100 עד 400 מיקרוליטרים של מטריצת קשירה של זיקה לכל דגימה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר ליזיס על ידי שימוש חוזר במטריצת הזיקה במאגר הליזיס. לאחר מכן, סובבו ב-30 סיבובים לדקה עם מתלה ערבוב מסתובב בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לזרז על ידי צנטריפוגה. יש להשליך את הנוזל העליון ולחזור על תהליך זה שלוש פעמים. הוסיפו את מטריצת קשירת הזיקה לדגימת הטיהור החיסוני שהופרדה בעבר ועיכלו אותה באמצעות RNase I.סובבו אותה במשך 25 דקות ב-30 סיבובים לדקה וארבע מעלות צלזיוס עם מתלה ערבוב מסתובב כדי לקשור את החלבון למטריצת הזיקה.הכן את תערובת המאסטר של מאגר הכביסה כמתואר בכתב היד של הטקסט. שטפו את מטריצת קשירה של זיקה עם מיליליטר אחד של חיץ שטיפה למשך כדקה, תוך סיבוב במדף התערובת. לאחר מכן, לזרז על ידי צנטריפוגה ב 3000 פעמים G במשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את הנוזל העליון.חזרו על הפעולה שלוש פעמים. יש לשטוף פעמיים נוספות במיליליטר אחד של מאגר שטיפה, בכל פעם במשך חמש דקות, תוך סיבוב במדף התערובת. לזרז שוב על ידי צנטריפוגה.השתמש ב-50 מיקרוליטרים של חרוזים לאליטיון חלבונים עם אותה כמות של מאגר דגימות פי 2. צנטריפוגה כדי לכדור את החרוזים ולהשליך את הנוזל העליון. Elute עם 700 מיקרוליטרים של 10 מילימולאר טריס.לאחר מכן, להקפיא חנקן נוזלי. הסר את הדגימה מחנקן נוזלי ואחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לשמש למיצוי RNA לאחר מכן. הערך את ההצלחה של שלב טיהור הזיקה על ידי כתם מערבי או צביעת Coomassie עם aliquots של כל שלב באמצעות IP מדומה על זן לא מתויג, מסוג פראי כבקרה לקשירת קשר לא ספציפית למטריצת הזיקה.תוצאות כתם מערבי לאחר טיהור הזיקה הדגימו את הצלחת ביטוי החלבון המתויג. בידוד של עקבות מוגנות ריבוזומים אומת באמצעות התוצאות מהביואנליזר. תוך יצירת ספריית cDNA לריצוף עמוק וניתוח ביג דאטה, תת-מחזור מוביל לתפוקה נמוכה.עם זאת, כאשר ה- dNTPs עדיין קיימים, התגובה ממשיכה, ומייצרת ממצאי PCR ארוכים יותר עם רצפים כימריים עקב מוצרי PCR המתחילים את עצמם. הספרייה שנוצרה אומתה עוד יותר על ידי אלקטרופורזה של דנ"א ברגישות גבוהה לצורך התפלגות וכימות בגודל מדויק. ספריית הרצף נחתכה עבור מתאמים וברקודים והקריאות שהתקבלו חולקו לקבוצות שונות של רצפי קידוד, אינטרונים ורצפים אינטרגניים.פרופילי ריבוזום המנתחים אינטראקציות תרגומיות משותפות של Vma2p עם מלווה הקשור לריבוזום Ssb1p, Pfk2p ו- Fas1p מוצגים כאן עם הסכימה הניסיונית של כל טיהור זיקה. הייתה תפוסת ריבוזומים לאורך מסגרת הקריאה הפתוחה של סך התרגומים בהשוואה לאינטראקציות Ssb1, Pfk2p ו- Fas1p. העשרה ממוצעת של Ssb1p, Pfk2p ו- Fas1p בכל מיקום ריבוזום לאורך מסגרת הקריאה הפתוחה מוצגת כאן.שיטה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של האינטראקציות השונות בין התרגומים המשותפים, ומבטיחה פרוטאום תפקודי, כמו גם חקר מחלות שונות. נכון להיום, פרופיל ריבוזומים סלקטיבי הוא השיטה היחידה שיכולה ללכוד ולאפיין את האינטראקציות הללו באופן ישיר in vivo.

global-identification-co-translational-interaction-networks-selective

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ"א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

תרגום ריבוזומים מפענח שלושה נוקלאוטידים לכל קודון לפפטידים. תנועתם לאורך mRNA, שנתפסה על ידי פרופיל ריבוזום, מייצרת את העקבות המציגות תקופת שלישייה אופיינית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש RiboCode כדי לפענח תכונה בולטת זו מנתוני פרופיל ריבוזום כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל ברמת התמלול המלא.

De novo זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל עם נתוני יצירת פרופילים של ריבוזום

חקור פרופיל ריבוזום סלקטיבי לזיהוי גלובלי של אינטראקציות בין תרגומים משותפים ב-Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר של אינטראקציות אלו בקרבת רזולוציית קודון ותורמת להבנת מנגנוני מחלות הקשורות לקיפול חלבונים.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

גלה סרטונים נוספים