מדידת שטף מצע מיטוכונדריאלי בתאים פרומינגוליסין O-פרמיבילים

כי זה בודק שטף מצע המיטוכונדריה שיכול להיות מושפע עם פתולוגיות או טיפולים שונים. לדוגמה, היום נשתמש בו כדי לחשוף את תגובת התא הסרטני לטיפול מטפורמין. זה דורש מספר מינימלי של תאים תוך שכפול מספיק ושליטה מתאימה עבור כל חומר נפרד.

המנתח מיועד לשימוש מחקרי בלבד. טכניקה זו יכולה לזהות שגיאות בחילוף החומרים המיטוכונדריאלי וניתן להשתמש בה כדי להעריך תרופות ללוחמים המשפיעות על המיטוכונדריה. מי שתדגים את ההליך תהיה קרולינה ואנקובה, סטודנטית לתואר ראשון וטכנאית מחקר מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל זרע תאי A549 בצפיפות של 20, 000 תאים לבאר בעמודות, שניים עד 11 של סוסון ים XF 96 תא תרבית מיקרו צלחת. השארת עמודות 1 ו- 12 ריקות כמו בארות רקע. מלאו את הבארות הריקות בנפח שווה של המדיום של תרבית התאים, ואז דגגרו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו-חמצני לחיבור תאים.

לאחר שלוש עד ארבע שעות, להוסיף 100 microliters של תרבית תאים בינונית בבארות. לטפל בעמודים קבוצתיים ניסיוניים שבע עד 11 עם מטפורמין מילימולרי אחד ואת קבוצת הביקורת עם נפח שווה של מים מזוקקים סטריליים, ולאחר מכן להחזיר את הצלחת לאינקובטור. עבור לחות החיישנים, pipette 200 microliters של מים סטריליים לבאר לתוך צלחת השירות.

לאחר מכן החזר בזהירות את מחסנית החיישן תוך כדי טבילת החיישן במים. לדגור את המחסנית באינקובטור ללא פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס עד למחרת. תדליק את המנתח ואת יחידת הבקרה.

הפעל את תוכנת בקרת המכשירים ורכישת הנתונים, ותכנן את פרוטוקול בדיקת ה- assay כמתואר בכתב היד של הטקסט. תחת הגדרות הקבוצה, ליצור ארבע אסטרטגיות הזרקה שבו יציאה A שונה על פי המצע המוזרק שם האסטרטגיות לאחר המצעים או הקיצורים. הקצה אוליגומיצין ליציאה B, FCCP ליציאה C ורוטנון אנטימיצין תערובת ליציאה D.Create ושם שמונה קבוצות, תחת מפת הלוח, להקצות קבוצות לבארות המתאימות.

לאחר מכן שמור את הפרוטוקול כתבנית מוכנה לשימוש. השאר את מתג המנתח על כדי לאפשר את הטמפרטורה להתייצב לילה. למחרת, להשליך את המים מצלחת השירות ולהוסיף 200 microliters של calibrant התחמם מראש לכל באר בלוח השירות.

החזר את המחסנית לאינקובטור ללא פחמן דו חמצני עד למועד ההסתה. לשמור על מקור לחות בתוך האינקובטור ולכבה או להפחית את מהירות המאוורר למינימום, כדי למנוע אידוי מהיר של הכיול. הכן חמישה מיליליטרים של פתרון העבודה של המצעים והמעכבים עם פתרון בדיקת מיטוכונדריאלי פעמיים מינון מראש, 5% BSA ומים סטריליים כמתואר בכתב היד של הטקסט.

לאחר מכן, לטעון את יציאות המזרק עם מצע ומעכבים כמתואר בכתב היד מס. לכיול תחת לשונית הריצה, לחץ על ריצת ההתחלה כדי להתחיל בבדיקה. הכנס את מחסנית הצנזורה הטעונה והמתן להשלמת הכיול.

הכן 20 מיליליטר של בינוני אסאי, על ידי ערבוב פעמיים פתרון בדיקת מיטוכונדריאלי, מים סטריליים ו 5% BSA בצינור 50 מיליליטר. הוסף שני מיקרוליטרים של 10 מיקרומולר רקומביננטי perfringolysin O, כדי להשיג ריכוז של ננומולר אחד. ולהשעות מחדש את התערובת עם צינורות עדינים, הימנעות רועדת מערבולת.

לדגור על הצינור ב 37 מעלות צלזיוס עד השימוש. השתמש פיפטה רב ערוצית לשטוף את התאים ואת וולס הריק פעמיים, באמצעות סידן מחומם מראש פתרון PBS ללא מגנזיום. השלך את ה- PBS והוסף 180 מיקרוליטרים של מדיום ה- assay התחמם מראש עבור פרמביליזציה של תאים.

מיד לאחר permeabilization להחליף את צלחת השירות של מחסנית חיישן מכויל עם צלחת התא המכיל תאים חלחלים ולהתחיל את המדידה. לקבוצת הטיפול היה שיעור גבוה יותר של נשימה תמציתית המושרה. התגובה של תאי A549 לטיפול מטפורמין הייתה גבוהה יותר מאשר Hep G2. עבור הנשימה המושרה פירובט מלאט, תאי A549 הראו אינדוקציה מוגברת לעומת תאי הפ G2 בין חמש ל 15 דקות.

תוצאות דומות התקבלו עבור נשימה המושרה גלוטמט malate ו פלמיטוילקרנטין malate המושרה נשימה. כדי להשיג את הריכוז הנכון של מצע ומעכבים. יש לטעון את אמצעי האחסון הנכון ליציאה הימנית.

כאשר שינוי במסלול מטבולי של מצע מסוים מזוהה, יהיה צורך להעריך את הפונקציה של האנזימים והמשגרים המעורבים במסלול זה.