שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת Staphylococcus aureus ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית

האנזים הגנה על בדיקות לאפשר ללמוד את היקף הפנמת Staph aureus ואת יכולתה לשרוד בתוך תאים דבקים, כמו גם את היעילות של תרכובת מיקרוביאלית. בדיקת ההגנה המשופרת מפני אנזימים מפשטת מאוד את הטיפול הטכני, ומאפשרת לשחזר חיידקים מופנמים מתאים ותאים חלשים בהשעיה. מדגים את ההליך יהיה ג'וסלין ריגייל, רופא ודוקטורנט מהמעבדה שלי.

יומיים לפני ההדבקה, זרעו תאי אפיתל A549 בצפיפות של 2.0 כפול 10 עד התאים החמישיים למיליליטר לבאר של צלחת של 24 באר ודגרו את התאים במשך 48 שעות ב 36 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני, עד שהם מגיעים 100% מפגש. ביום ההסמכה, להסיר ולהשליך את המדיום התרבותי בילה משלוש בארות ייעודי לספירת תאי A549, ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיום זיהום מלא המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר של Hoechst 33342 ומיקרוגרם אחד למיליליטר של יוד פרופיליום. לדגור על התאים במשך 30 דקות, ולאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה, לספור את מספר התאים ולחשב את הכדאיות התא.

כדי להכין את ההשעיה החיידקית, לחלק 25 מיליליטר של זיהום מלא בינוני בצינור, וקדם מלחמה זה ב 36 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להתאים את השעיית Staphylococcus aureus למנת יתר של 0.5 במדיום זיהום מלא באמצעות מד צפיפות תאים, ולאחר מכן להכין 20 מיליליטר של השעיה חיידקית עבור חיסון התא על ידי דילול התרבות במדיום זיהום מלא כדי להשיג MOI של אחד על פי מספר התאים לבאר. לאחר מכן, באמצעות לוחית ספירלה אוטומטית, לקבוע את עומס staphylococcus aureus של ההשעיה החיידקית מדוללת לשמש לשלב חיסון התא, ולדגירה את לוחות אגר במשך 18 עד 24 שעות ב 36 מעלות צלזיוס.

למחרת, לספור את מספר המושבות עם מונה מושבה כדי לחשב את MOI המדויק עבור כל זן נבדק. לפני חיסון התא, התבונן בכל באר של צלחת 24-well על ידי מיקרוסקופיה הגדלה נמוכה כדי להבטיח כי התאים בריאים וגדלים כצפוי, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את המדיום תרבית התא בילה מן הצלחת 24-well ולהוסיף 500 microliters של השעיית חיידקים לכל באר המכילה 100% תאים משוחחים. לדגור על התאים במשך שעתיים ב 36 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני.

כדי לכמת את החיידקים התאיים עם בדיקת ההגנה על אנזימים משופרת, הכינו מאגר תמוגה 4x, 2% טריטון X-100, טריפסין-EDTA ומניות ליסוסטיפין בפתרונות עבודה כפי שהוזכרו בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, להכין 6.25 מיליליטר של זיהום שלם בינוני בתוספת ליזוזטפין על ידי הוספת שישה מיליליטר של זיהום מלא בינוני ל 250 microliters של פתרון העבודה ליסוסטיפין. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של מדיום זיהום מלא בתוספת ליזוזטפין לתוך כל באר בעדינות להתסיס את הצלחת על ידי מערבולת את הצלחת ביד.

כדי לאפשר לליסוסטיפין להרוג את החיידקים החוץ-תאיים, לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 36 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני, ולאחר מכן לנטרל את lysostaphin על ידי הוספת 10 microliters של proteinase K ב 20 מיקרוגרם למיליליטר לתוך כל באר ודגורת התאים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של 4x תמוגה חוצץ ליזה ליזה את התאים על ידי הלם אוסמוטי, ולדגירה את התאים במשך 10 דקות ב 36 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, pipette התא ליסמה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח כי התאים הם lysed לחלוטין הומוגני, ולאחר מכן להשתמש צלחת ספירלה אוטומטית כדי לקבוע את עומס aureus Staphylococcus של כל באר לדגור על לוחות אגר במשך 18 עד 24 שעות ב 36 מעלות צלזיוס.

למחרת, לספור את מספר המושבות עם מונה מושבה כדי לחשב את עומס Staphylococcus aureus תאי של כל באר. הפנמה של שני זנים של Staphylococcus aureus על ידי תאי אפיתל A549 מתואר כאן. באמצעות הגנה על האנזים, הכולל שטיפות להסרת ליזוזטפין, העומסים התאיים הממוצעים היו 4.46 ו-0.49 לוג cfu למיליליטר עבור סוג הבר SF8300 והמוטציה האיזוגנית שחסרה את הגנים fnbA ו- B, בהתאמה.

באמצעות הגנה משופרת על אנזימים המשתמשת בחלבון K כדי לנטרל ליסוסטאפין, העומסים היו 4.53 ו 0.56 cfu יומן למיליליטר, בהתאמה. פעילות תאית של ונקוצין, ריפאמפיצין, levofloxacin נגד Staphylococcus aureus נמדד באמצעות הגנה על אנזימים assay מתואר כאן. המטענים התאיים הממוצעים היו 4.57 cfu יומן למיליליטר לשליטה, 4.51 עבור vancomycin, 3.03 עבור rifampicin ו 2.91 עבור levofloxacin.

שטיפות אינטנסיביות להסרת האנזים נוטות לנתק את התאים הנגועים ביותר, אשר יכולים לתת תוצאות לא מדויקות ולתמוך בשימוש בפרוטוקול המשופר. בדיקת ההגנה המשופרת מפני אנזימים מקלה על חקר הפנמת Staph aureus עם אורגנויד, וניתן להתאים אותה בקלות במערכת סינון תוכן גבוהה המשמשת על ידי הצבת