Name: מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: חקור מעברי פאזה אופטוגנטיים של TDP-43 בנוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני ניוון עצבי ב-ALS ולבחון מועמדים לטיפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן SERIKA (KA), מספרי מענק KAKENHI JP19K06933 (KA) ו JP20H05345 (KA).

כל עבודות הדגים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אישור מספר 24-2) של המכון הלאומי לגנטיקה (יפן), אשר יש לו ביטחון לרווחת בעלי חיים בקובץ (מספר אבטחה A5561-01) במשרד לרווחת בעלי חיים במעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH, ארה"ב).
1. בניית BACs לביטוי של גן TDP-43 אופטוגנטי ממקדם mnr2b
<ol><li>הכנת BAC<ol>
<li>רכש שיבוט BAC דג זברה המכיל לוקוס mnr2b דג זברה (CH211-172N16, גנומיקה BACPAC). לטהר את ה- DNA BAC מתרבות LB לילה 5 מ"ל של DH10B Escherichia coli (E. coli) מחסה CH211-172N16 כמתואר התחממות et al.18.</li>
		<li>להפוך CH211-172N16 לתוך SW102 E. coli תאים על ידי אלקטרופורציה, כמתואר התחממות et al.18. הערה: טיהור ה- DNA של BAC מה - E. coli באותו יום של אלקטרופורציה בדרך כלל נותן שיעור הצלחה גבוה יותר של טרנספורמציה BAC18. אחרת, DNA BAC מטוהר נשמר ב -20 °C (50 °F) עד לשימוש.</li>
		<li>הציגו את קלטת ה-iTol2-amp עבור טול2 בתיווך BAC transgenesis19 לעמוד השדרה של CH211-172N16 על ידי אלקטרופורציה, כמתואר ב Asakawa et al.20.<ol>
<li>הפוך מלאי גליצריל של E. שיבוטי תאי קולי הנושאים CH211-172N16 עם אינטגרציית קלטת iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) לאחר אישור השילוב ההומולוגי בתיווך רקומבינציה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) (Ex Taq) באמצעות צמד הפריימרים Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') ו- pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') והתנאים הבאים: שלב denaturation ב 98 °C (5 °F) במשך 1 דקות, ואחריו 25 מחזורים של denaturation ב 95 °C (75 °F) עבור 10 s, חישול פריימר ב 55 °C (15 °F) וסיומת פריימר ב 72 °C (72 °F) עבור 1 דקות, מגביר מוצר PCR של 354 זוגות בסיס (bp).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h בנייה<ol>
<li>בנה פלסמיד הנושא את קלטת הביטוי עבור TDP-43/TARDBP האנושי מסוג בר (TDP-43h) המתויג עם mRFP1 ו CRY2olig ב- N- ו- C-termini, בהתאמה (להלן, opTDP-43h)14. הערה: שבר opTDP-43h צריך להיות מוקף עם רצף מקדם גנים hsp70l דג זברה (650 bp) ופוליאדנילציה (polyA) רצף אות, ואחריו גן התנגדות kanamycin (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.</li>
		<li>להגביר את קלטת hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan עם פריימרים כי anneal hsp70l וקאן ומכילים 45 רצפי bp של הזרם במעלה ובמורד הזרם של קודונים יוזם של הגן mnr2b על ידי PCR (GXL DNA פולימראז) באמצעות זוג פריימר mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') ו- Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') עם התנאים הבאים: שלב דנטורציה ב 98 °C (75 °F) למשך דקה אחת, ואחריו 30 מחזורים של denaturation ב 95 °C (70 °F) עבור 10 °C, חישול פריימר ב 55 °C עבור 15 s, והרחבת פריימר ב 68 °C (70 °F) עבור 30 s, מגביר מוצר PCR של ~ 5.7 bp.</li>
		<li>הפרד את מוצרי ה- PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (100 V) ולטהר את hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan הלהקה DNA עם עמוד DNA. התאם את הריכוז של מגירת hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan ל- 50 ננוגרם/μL במאגר Tris-EDTA (TE) המכיל 10 מ"מ מטר טריס-HCl (pH 8.0) ו- 1 mM EDTA.</li>
		<li>הציגו את קלטת hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan לקלטת CH211-172N16-iTol2A על ידי אלקטרופורציה כמתואר בהתחממות ואח' 18 ובחרו טרנספורמטים עמידים בפני אמפיצילין וקנמיצין על לוחות אגר LB. CH211-172N16-iTol2A הנושאת את קלטת hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan מוגדרת כ- mnr2b-hs:opTDP-43h.</li>
		<li>לטהר mnr2b-hs:opTDP-43h באמצעות ערכת טיהור BAC ולהמיס אותו ב 250 ng/μL ב TE לאחר מיצוי פנול / כלורופורם.</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z בנייה<ol>
<li>בנה פלסמיד נוסף הנושא את ברזנט מסוג בר של דג הזברה המתויג בחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) במבנה N-terminus שלו (EGFP-TDP-43z) במקום opTDP-43h אך הוא זהה אחרת למבנה hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. השתמש EGFP-TDP-43z כמו בקרה פנימית לגירוי האור של opTDP-43h.</li>
		<li>לבנות CH211-172N16-iTol2A מחסה hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan קלטת בלוקוס mnr2b כמתואר 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A הנושאת את קלטת hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan מוגדרת כ- mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.</li>
	</ol></li>
</ol>2. טול2 טרנסגנזה בתיווך BAC בדג זברה
<ol><li>הכן את פתרון ההזרקה המכיל 40 mM KCl, פנול אדום (10% v / v), 25 ng / μL של mnr2b-hs:opTDP-43h DNA, ו 25 ננוגרם / μL טול2 transposase mRNA19.</li>
	<li>הזריקו 1 nL של תמיסת ההזרקה (טיפה בקוטר של כ -123 מיקרומטר מכויל בשמן מינרלי) לתוך ציטוסול של עוברים דגי זברה מסוג בר בשלב תא אחד. מסך הדגים המוזרקים להיווצרות של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) אגרגטים חיוביים ברקמות עובריות שונות, כולל נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה, תחת סטריאופיקוסקופ פלואורסצנטי ב 2-3 ימים לאחר ההפריה (dpf). העלו את הדגים החיוביים RFP לבגרות.</li>
	<li>הזרק את ה- DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA כמתואר ב- 2.1 ו - 2.2. העלו דגים חיוביים לבגרות.</li>
	<li>לאחר מספר חודשים, לשים דגים מוזרקים מינית ודגים מסוג בר בזוגות בכלובי הזדווגות סטנדרטיים 2 L כדי להשיג צאצאי F1. דגי F1 מסך ב 3 dpf עבור RFP (opTDP-43h) או EGFP (EGFP-TDP-43z) פלואורסצנטיות בעמוד מנוע עמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בעדשה אובייקטיבית Plan-Neofluar 5x/0.15. בדרך כלל, דג מייסד אחד מזוהה מ 10−20 דגים מוזרקים (שיעור העברת חיידקים הוא 5%−10%).</li>
	<li>לבודד ולהשוות Tg מרובים [mnr2b-hs:opTDP-43h] ו Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] מוסיף מדגי מייסד שונים, כמו העוצמה, אבל לא את התבנית, של opTDP-43h או EGFP-TDP-43z ביטוי עשוי להשתנות בין דגים מייסד עקב אפקטים מיקום כרומוזומלי.</li>
	<li>קרוס Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ו- Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] קווי דגים להשגת צאצאים המכילים Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים ביחס מנדליאני.</li>
	<li>הרימו את הדגים בצלחת פלסטיק המכילה 30 מ"ל של חוצץ E3 (5 mM NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl2, 0.33 מ"מ MgSO4, 10-5% מתילן כחול) והוסיפו 0.003% (w/v) N-פנילטיאורה ב 8-10 שעות לאחר ההפריה (hpf) כדי לעכב מלנוגנזה.</li>
	<li>מכסים את צלחת הפלסטיק בנייר אלומיניום לאחר 30 כ"ס.</li>
</ol>3. הכנת נורית LED להארה של אור כחול
<ol><li>הפעלת לוח LED באמצעות היישום המשויך המותקן בטאבלט/טלפון. שים את הבדיקה של ספקטרומטר לתוך באר ריקה של צלחת 6 טוב ולהתאים את אור ה- LED אל אורך הגל לשיאו ~ 456 ננומטר דרך היישום. מקם את החיישן האופטי של מד כוח אופטי בבאר הריקה והתאם את עוצמת נורית ה- LED (~ 0.61 mW / cm2). ניתן לשמור את הגדרת נורית ה- LED וניתן לאחזר אותה ביישום.</li>
	<li>הציגו את הגדרת צלחת / LED פאנל לאינקובטור ב 28 °C (70 °F). סיים שלב זה לפני שהדמיה של דגים מתחילה ב 48 כ"ס.</li>
</ol>4. הדמיה של זחלי דגי זברה המבטאים TDP-43 אופטוגנטי
<ol><li>בחר Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים לפחות לפני 47 כ"ס, בהתבסס על RFP (opTDP-43h) או EGFP (EGFP-TDP-43z) פלואורסצנטיות בעמודת מנוע עמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות המתואר לעיל.</li>
	<li>Dechorionate the Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים.</li>
	<li>מחממים 1% טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז המכיל 250 מיקרוגרם /מ"ל של אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונט ב 42 °C (52 °F).</li>
	<li>לזמן קצר מרדים Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] דגים מהונדסים כפולים ב 48 כ"ס ב- E3 חוצץ המכיל את אותו ריכוז של טריסאן.</li>
	<li>שים טיפה של 1% מראש טמפרטורת ההיתוך נמוכה agarose על צלחת בסיס זכוכית בטמפרטורת החדר. הקוטר של טיפת אגרוז בצורת כיפה על צלחת הזכוכית הוא 8-10 מ"מ.</li>
	<li>בעזרת פיפטת פסטר, מוסיפים את הדגים המורדדים לטמפרטורת ההיתוך הנמוכה על צלחת בסיס הזכוכית, ואז מערבבים על ידי צנרת כמה פעמים. מזער את כמות חוצץ E3 שנוסף לאגרוז יחד עם הדגים.</li>
	<li>לשמור על הדג בצד שלה באמצעות מחט מזרק במהלך התגבשות של agarose (בדרך כלל ~ 1 דקות) כדי להבטיח כי חוט השדרה נמצא במצב אופקי מתאים. לאחר ההתמצקות, לשים כמה טיפות של חוצץ E3 על דגים בצורת כיפה בצורת אגרוז רכוב.</li>
	<li>רכש מקטעי z קונפוקליים סדרתיים של חוט השדרה על-ידי סריקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית של טבילת מים 20x עם הצמצם המספרי 1.00, תוך שימוש במהירות סריקה של 4.0 מיקרו-פיקסל לפיקסל (12 סיביות לפיקסל), גודל צעד של 1.0 מיקרומטר לפרוסה למטרה, ושילוב של אורכי גל עירור/פליטה: ערוץ 1) 473/510 ננומטר עבור EGFP ו ערוץ 2) 559/583 ננומטר עבור mRFP1. הערה: הקלואקה בצד הגחון של הדג כלולה באזורי העניין (ROI) כהתייחסות, המסייעת לזהות ולהשוות את מקטעי עמוד השדרה (רמות 16-17) לאורך נקודות הזמן.</li>
	<li>הסר את הדג מן agarose על ידי פיצוח בזהירות את agarose עם מחט מזרק ברגע ההדמיה הושלמה. שמור את משך הזמן הדג מוטבע באגרוז קצר ככל האפשר, אם כי הטמעת אגרוז במשך <30 דקות אינה משפיעה על הכדאיות של הדג.</li>
</ol>5. גירוי קל של דגים המבטאים opTDP-43h על ידי הארת שדה של אור דיודה פולט אור כחול (LED)
<ol><li>הוסף 7.5 מ"ל של חוצץ E3 לבאר והצב את דגי Tg[mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים לתוך הבאר. מניחים את המנה בעלת ששת הטובות על לוח ה-LED על ידי שמירה על המנה ועל לוח ה-LED במרחק של 5 מ"מ זה מזה עם מרווח (לדוגמה, עם חמש כוסות שקופיות מוערמות).</li>
	<li>הפעל את נורית ה-LED הכחולה. שמור על חלק Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] דגים מהונדסים כפולים בצלחת נפרדת של שש בארות מכוסה בנייר אלומיניום כאשר יש צורך בדגים ללא שליטה (כלומר, בתנאים כהים)14.</li>
	<li>לאחר התאורה (למשל, עבור 24 שעות ב 72 כ"ס באיור 3), צלם את חוט השדרה של הדג המואר על ידי חזרה על השלבים 4.3 - 4.9.</li>
</ol>6. הדמיה של רילוקיישן ציטופלסמי של TDP-43 אופטוגנטי בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה
<ol><li>פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ/Fiji21 (גירסה: 2.1.0/1.53c), תוכנית עיבוד תמונה בקוד פתוח Java שפותחה על ידי NIH Image, אשר ניתן להוריד https://imagej.net/Fiji/Downloads.</li>
	<li>השתמש בפס הגלילה Z כדי לעבור דרך מישורי המוקד. צור הקרנה בעוצמה המרבית של פרוסות מרובות על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | פרוייקט Z | עוצמה מרבית והגדרת התחל פרוסה וחתוך פרוסה המכסים את ההמיסגמנטים של עמוד עמוד השדרה.</li>
	<li>פצל את התמונה הרב-ערוצית לשתי תמונות בערוץ יחיד על-ידי לחיצה על תמונה | | צבע ערוצים מפוצלים.</li>
	<li>שפר את האות EGFP-TDP-43z כדי להבטיח כי EGFP-TDP-43z ציטופלסמי יהיה גלוי בבירור על ידי לחיצה על תמונה | כוונון | בהירות/ניגודיות והתאמת מינימום
</li>
	<li>פתח את מנהל ההפרשה על-ידי לחיצה על נתח | כלים | מנהל רורי. מצא את התאים הניתנים לזיהוי בשתי התמונות ב-48 כ"ס ו-72 כ"ס, בהתבסס על מיקומם היחסי של גופי התא. הגדר את ROIs על ידי חלוקת קווי המתאר של גופי תאים של נוירונים מוטוריים יחידים בעמוד השדרה שדמיינו על-ידי האות EGFP-TDP-43z באמצעות בחירות Freehand ולאחר מכן לחיצה על Add[t] במנהל ה- ROI.</li>
	<li>הגדר ציר ראשי של הסומה על-ידי ציור קו ישר באמצעות ישר ולחיצה על נתח | פרופיל התוויה עבור תמונות EGFP-TDP-43z (C1) ו- opTDP-43h (C2) ב- 48 ו- 72 כ"ס.</li>
	<li>נרמל את פרופיל התוויית הפרופיל על-ידי חלוקת הערכים בערך הגדול ביותר עבור כל אות EGFP-TDP-43z ו- opTDP-43h. התווה את הערכים המנורמלים עם קואורדינטות x-y, כאשר x ו- y מייצגים את הציר העיקרי של עוצמות סומה ופלואורסצנטיות יחסית, בהתאמה, באמצעות גרף XY בתוכנה סטטיסטית.</li>
</ol>7. השוואה רצימטרית בין אותות opTDP-43h ו- EGFP-TDP-43z באמצעות ImageJ/Fiji
<ol><li>פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ/Fiji והגדר בדיקות RO עבור תאים בודדים חיוביים ל- mnr2b באמצעות תמונת הקרנה בעוצמה מרבית של EGFP-TDP-43z כמו ב- 6.1-6.5. הוסף ROI מחוץ לחוט השדרה הגחוני (למשל, notochord) כדי לייצג את אות הרקע (ROI ברקע).</li>
	<li>עבור כל תמונה של EGFP-TDP-43z ו- opTDP-43, צור הקרנה של פרוסות מרובות על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | פרוייקט Z | סכום פרוסות והגדר את 'התחל פרוסה' ו'עצור פרוסה' שמכסה את עמודת המנוע המיסטיפינלית.</li>
	<li>פתחו את מנהל ההקרנה של ROI שנוצר עם תמונת ההקרנה בעוצמה המרבית. הצג את ההנפקות בתמונה Sum Slices על-ידי בחירת חלון התמונה עבור EGFP-TDP-43z ולאחר מכן לחיצה על הצג הכל במנהל ההפרשה. לחץ על מדידה במנהל ההשערות כדי להשיג ערכים ממוצעים עבור כל עלה על ההשערות.</li>
	<li>רכוש ערכים ממוצעים עבור opTDP-43h לאחר אותו הליך שסופק ב- 7.3.</li>
	<li>עבור כל ROI, לאחר חיסור הממוצע עבור ROI הרקע, חלק את הממוצע מופחת עבור opTDP-43h על ידי הממוצע מופחת עבור EGFP-TDP-43z כדי לקבל את הערך היחסי. ניתן להשוות את הערכים היחסיים בין נקודות זמן שונות ולהציגם באמצעות גרף עמודות בתוכנת פריזמה.</li>
</ol>

<ol><li>Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+and+size+scaling+of+membrane-less+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles.</a> Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).</li>
<li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-liquid+phase+separation+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+rna+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).</li>
<li>Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+biophysics+and+neurology%3A+aberrant+phase+transitions+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).</li>
<li>Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+ribostasis%3A+RNA-protein+granules+in+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders.</a> Cell. 154 (4), 727-736 (2013).</li>
<li>Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+genes+in+the+genomic+era+and+their+implications+for+FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">ALS genes in the genomic era and their implications for FTD.</a> Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).</li>
<li>Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+therapeutic+potential+of+liquid-liquid+phase+separation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).</li>
<li>Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+disorder+in+proteins+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).</li>
<li>Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+ALS%3A+the+FUS+about+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rethinking ALS: the FUS about TDP-43.</a> Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).</li>
<li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-phaseted+problems+of+TDP-43+in+selective+neuronal+vulnerability+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optogenetic+induction+of+stress+granules+is+cytotoxic+and+reveals+the+evolution+of+ALS-FTD+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology.</a> Elife. 8, 39578(2019).</li>
<li>Mann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Binding+Antagonizes+Neurotoxic+Phase+Transitions+of+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43.</a> Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).</li>
<li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modulation+of+TDP-43+oligomerization+accelerates+ALS-related+pathologies+in+the+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 1004(2020).</li>
<li>Otte, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+TDP-43+nucleation+induces+persistent+insoluble+species+and+progressive+motor+dysfunction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo.</a> Neurobiology of Disease. 146, 105078(2020).</li>
<li>Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mnx+genes+in+endocrine+and+exocrine+pancreas+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation.</a> Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).</li>
<li>Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Mnx+proteins+specify+one+motoneuron+subtype+and+suppress+acquisition+of+interneuron+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics.</a> Neural Development. 7, 35(2012).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Research. 33 (4), 36(2005).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925(2014).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li>
<li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605(2020).</li>
</ol>

KA ו- KK הם ממציאי הקניין הרוחני המתואר בכתב יד זה ופטנטים זמניים הוגשו על ידי המכון הלאומי לגנטיקה.

הביטוי בתיווך mnr2b-BAC של opTDP-43h ו- EGFP-TDP-43z בדגי זברה מספק הזדמנות ייחודית להדמיה חיה של מעבר שלב TDP-43 בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה. השקיפות האופטית של רקמות הגוף של זחלי דגי זברה מאפשרת גירוי אופטוגנטי פשוט ולא פולשני של opTDP-43h. השוואות בין נוירונים מוטוריים יחידים בעמוד השדרה לאורך זמן הראו כי אוליגומריזציה תלוית אור של opTDP-43h גורמת להתקבצות הציטופלסמית שלה, המזכירה פתולוגיה של ALS.
אחד הפרמטרים הקריטיים המגדירים את התנהגות הפאזה של חלבון עם הפרעה מהותית הוא ריכו...

גרגרי ריבונוקלאופרוטאין (RNP) שולטים בשלל פעילויות תאיות בגרעין ובציטופלסמה על ידי הרכבת מחיצות ללא ממברנה באמצעות הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS), תופעה שבה נוזל הומוגני מתפוגג לשני שלבים נוזליים נפרדים1,2. ה- LLPS המופסק של חלבונים מחייבי RNA המתפקדים בדרך כלל כרכיבי גרגירי RNP מקדמים מעבר פאזה חריג, מה שמוביל לצבירה של חלבונים. תהליך זה היה מעורב במחלות נוירו-מפותחות ונוירודגנרטיביות3,4,5. ההערכה המדויקת של קשר סיבתי בין LLPS חריג של חלבונים מחייבי RNA ופתוגנזה של מחלות חיונית לקביעת האם וכיצד ניתן לנצל LLPS כיעד טיפולי יעיל. LLPS של חלבונים מחייבי RNA קל יחסית ללמוד במבחנה ובמודלים חד-תאיים אך קשה באורגניזמים רב-תאיים, במיוחד בחולייתנים. דרישה קריטית לניתוח LLPS כזה בתאים בודדים בתוך סביבת רקמות היא לבטא ביציב בדיקה עבור הדמיה ומניפולציה של LLPS בסוג של עניין תאים פגיעים למחלה.
טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא הפרעה נוירולוגית קטלנית בסופו של דבר שבה נוירונים מוטוריים של המוח וחוט השדרה הולכים לאיבוד באופן סלקטיבי ומתקדם עקב ניוון. עד כה, מוטציות ביותר מ-25 גנים קושרו לצורה תורשתית (או משפחתית) של ALS, המהווה 5%-10% מכלל מקרי ה-ALS, וחלק מהגנים הגורמים ל-ALS מקודדים חלבונים מחייבי RNA המורכבים מ-RNPs, כגון hnRNPA1, TDP-43 ו-FUS6,7. יתר על כן, הצורה ספורדית של ALS, המהווה 90%-95% מכלל מקרי ALS, מאופיינת בצבירה ציטופלסמית של TDP-43 המופקדת בנוירונים מוטוריים מתנוונים. מאפיין מרכזי של חלבונים אלה הקשורים ALS RNA מחייב הוא האזורים שלהם הפרעה מהותית (IDRs) או תחומים בעלי מורכבות נמוכה, כי חסרים מבנים תלת ממדיים מסודרים ולתווך אינטראקציות חלבון חלבון חלש עם חלבונים רבים ושונים המניעים LLPS7,8. העובדה כי מוטציות הגורמות ALS מתרחשות לעתים קרובות IDRs הוביל את הרעיון כי LLPS חריג ומעבר פאזה של חלבונים אלה הקשורים ALS עשויים לעמוד בבסיס ALS פתוגנזה9,10.
לאחרונה, פותחה שיטת optoDroplet, טכניקה אופטוגנטית מבוססת Cryptochrome 2 המאפשרת אפנון של אינטראקציות חלבון-חלבון על ידי אור, פותחה כדי לגרום למעבר פאזה של חלבונים עם IDRs11. כמו טכניקה זו הורחבה בהצלחה TDP-43, זה החל לחשוף את המנגנונים הבסיסיים מעבר פאזה פתולוגית של TDP-43 ואת הציטוטוקסיות הקשורים שלה12,13,14,15. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה גנטית כדי לספק TDP-43 אופטוגנטי לסוגי תאים פגיעים ALS, כלומר, נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה בדגי זברה באמצעות BAC עבור הגן mnr2b / mnx2b קידוד חלבון homeodomain עבור מפרט נוירון מוטורי16,17. השקיפות הגבוהה של זחלי דגי הזברה מאפשרת גירוי אור פשוט ולא פולשני של TDP-43 האופטוגנטי שמפעיל את מעבר הפאזה שלו בתאי העצב של מנוע עמוד השדרה. אנו מציגים גם זרימת עבודה בסיסית להדמיה חיה של נוירונים מוטוריים של דגי זברה וניתוח תמונה באמצעות תוכנת פיג'י / ImageJ הזמינה באופן חופשי כדי לאפיין את התגובות של TDP-43 האופטוגנטי לגירוי האור. שיטות אלה מאפשרות חקירה של מעבר שלב TDP-43 בסביבה תאית פגיעה ALS וצריכים לסייע בחקר ההשלכות הפתולוגיות שלה ברמות התאיות וההתנהגותיות.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>צלחת בסיס זכוכית</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>פאנל LED</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>ערכת חכמה יותר של Nanoleaf AURORA</td> Mupid-2plus TAKARA AD110 NucleoBond BAC100 MACHEREY-NAGEL 740579 NuSieve GTG Agarose LONZA 50181 עדשת אובייקטיבית Olympus XLUMPlanFL N 20&times;/1.00 עדשת אובייקט ZEISS Plan-Neofluar 5x/0.15 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד כוח אופטי</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>חיישן אופטי</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אדומה פנול 0.5%</td> <td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>צלחת שש בארות</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת ספקטרומטר BLUE-Wave</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>דג זברה BAC שיבוט CH211-172N16</td><td>BACPAC Genomics</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

מעבר שלב אופטוגנטי של tdp-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

צבירת חלבונים חריגה ופגיעות עצבית סלקטיבית הם שני סימני היכר עיקריים של מחלות ניווניות. קשרים סיבתיים בין תכונות אלה עשויים להיחקר על ידי שליטה במעבר הפאזה של חלבון הקשור למחלה בסוג תא פגיע, אם כי גישה ניסיונית זו הוגבלה עד כה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון RNA / DNA מחייב TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה למידול צבירה ציטופלסמית של TDP-43 המתרחשת בנוירונים מוטוריים מנוונים בטרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS). אנו מתארים שיטה גנטית מבוססת כרומוזום מלאכותי חיידקי (BAC) כדי לספק גרסה אופטוגנטית TDP-43 באופן סלקטיבי לנוירונים המוטוריים בעמוד השדרה של דגי זברה. השקיפות הגבוהה של זחלי דגי זברה מאפשרת מעבר פאזה של TDP-43 האופטוגנטי בתאי העצב של מנוע עמוד השדרה על ידי תאורה חיצונית פשוטה באמצעות דיודה פולטת אור (LED) נגד דגים בלתי מרוסנים. אנו מציגים גם זרימת עבודה בסיסית של הדמיה חיה של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של דגי הזברה וניתוח תמונה עם תוכנת פיג'י / ImageJ זמינה באופן חופשי כדי לאפיין את התגובות של TDP-43 האופטוגנטי לתאורת האור. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של מעבר שלב TDP-43 ויצירת צבירה בסביבה תאית פגיעה ALS, אשר אמור להקל על חקירה של ההשלכות התאיות וההתנהגותיות שלה.

הדמיה חיה של חלבוני TDP-43 אופטוגנטיים ולא אופטוגנטיים בתאי העצב המוטוריים mnr2b+ של זחלי דגי זברה כדי לגרום למעבר שלב TDP-43 בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה בדגי זברה, TDP-43h אנושי המתויג עם mRFP1 ו CRY2olig22 ב- N- ו- C-termini, בהתאמה, נבנה והוגדר כ- opTDP-43h14 (איור 1A). שבר הגן opTDP-43h הוכנס ל-BAC המכיל את הלוקוס mnr2b (איור 1B). BAC ...

אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום למעבר פאזה של חלבון מחייב DNA TAR 43 (TDP-43) על ידי אור בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה באמצעות דגי זברה כמודל.

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

אז פרוטוקול זה מאפשר לנו לגרום למעברי פאזה פתולוגיים של TDP-43 ולטפל בהשלכות התאיות שלהם בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה ב- vivo, אשר רלוונטי להבנה מדוע נוירונים מוטוריים מתנוונים ב- ALS. בשל השקיפות הגבוהה של זחלי דגי זברה, הנוירונים המוטוריים בחוט השדרה נראים ישירות. אז אפשר לדמיין את ההתנהגות הדינמית של TDP-43 עובר מעברי פאזה בתאי עצב מוטוריים יחידים בעמוד השדרה.שיטה זו מציעה מודל חייתי חדשני של ALS. אנו מאמינים כי כל שיטה שיכולה למנוע את המעבר שלב TDP-43 המושרה אור וצבירה במודל ALS זה עשוי להיות מועמד פוטנציאלי לטיפול ALS. חלבונים אחרים הקשורים ALS עם אזורים עם הפרעה מהותית ניתן לבטא לחקור neurotoxicity הקשורים מעברי פאזה חריגים.המפתח להצלחה בגישה זו הוא לבטא את TDP-43 האופטוגנטי בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה ברמה הלא-טוקסיקית. BAC transgenesis הוא צעד גוזל זמן, אבל ברגע שאתה יוצר דג מהונדס תקין, השלבים הבאים הם יחסית קלים ופשוטים. כדי להתחיל, הפעל את הדיודה פולטת האור, או את החלונית LED, באמצעות היישום המשויך המותקן בטאבלט או בטלפון.לאחר מכן, מניחים את גשושית הספקטרומטר לבאר ריקה של מנה של 6 בארות. לאחר מכן, באמצעות היישום, התאם את נורית ה- LED לאורכו גל שהגיע לשיא של 456 ננומטר. מקם את החיישן האופטי של מד כוח אופטי בבאר הריקה והתאם את עוצמת נורית ה- LED.לאחר מכן מניחים את המנה עם הגדרת פאנל LED לתוך אינקובטור בשעה 28 C.להדמיה של זחלי דג זברה מבטא TDP-43 אופטוגנטי, dechorionate הדגים מהונדסים כפולים ומרדים אותם במאגר E3 המכיל 250 גרם / מ"ל של טריקן. לאחר מכן, לחמם 1% טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז המכיל 250 גרם / מ"ל של אתיל 3-aminobenzoate מתנסולפונט ב 42 C.Then לשים טיפה של אגרוז על צלחת בסיס זכוכית. הקוטר של טיפת אגרוז בצורת כיפה על צלחת הזכוכית צריך להיות 8 עד 10 מ"מ.לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר, מוסיפים את הדגים המנודים לאגרוז על צלחת על בסיס זכוכית. מזער את כמות חוצץ E3 הוסיף לאגרוז יחד עם הדג. לאחר מכן, לערבב על ידי צנרת כמה פעמים.במהלך התגבשות של agarose, לשמור על הדג על הצד שלה באמצעות מחט מזרק, כך חוט השדרה נמצא במצב אופקי מתאים. לאחר האגרוז התגבש, להוסיף כמה טיפות של חוצץ E3 על דגים בצורת כיפה בצורת אגרוז. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בעדשה אובייקטיבית טבילת מים 20 פעמים, לרכוש קטעי z קונפוקליים סדרתיים של חוט השדרה.כלול את cloaca בצד הגחון של הדג באזורים של עניין כהתייחסות לזהות ולהשוות את מקטעי עמוד השדרה על פני נקודות הזמן. ברגע ההדמיה הושלמה, להשתמש במחט מזרק כדי לפצח בזהירות את האגורוז ולהסיר את הדג מן agarose. שמור את משך הזמן הדג מוטבע באגרוז קצר ככל האפשר, אם כי הטמעת אגרוז במשך פחות מ -30 דקות אינה משפיעה על הכדאיות של הדג.הוסיפו 7.5 מ"ל של חוצץ E3 לבאר אחת של מנה של 6-well והכניסו את הדגים הכפולים-מהונדסים בתמונה לבאר הזו. לאחר מכן, מניחים את המנה על לוח ה-LED, שומרים על המנה ועל לוח ה-LED במרחק של 5 מ"מ זה מזה עם מרווח, והדליקו את נורית ה-LED הכחולה. שמור כמה דגים מהונדסים כפולים בצלחת נפרדת 6-באר מכוסה בנייר אלומיניום עבור דגים שליטה unilluminated.לאחר זמן ההארה הרצוי, צילם את חוט השדרה של הדג המואר כפי שהוכח קודם לכן. רילוקיישן ציטופלסמי של opTDP-43h בתאי עצב מוטוריים יחידים בעמוד השדרה היה חזותי על ידי הפרדת תמונות סדרת z שנרכשו בגיל 48. ו-72 שעות לאחר ההפריה לכל ערוץ EGFP-TDP-43z ו-opTDP-43h.מתמונות הקרנה בעוצמה מקסימלית של EGFP-TDP-43z, נוירון עמוד שדרה מבודד יחיד הניתן לזיהוי בשניהם 48. ו-72 שעות לאחר ההפריה נבחרו. אזורים מעניינים המכסים את הסומסה של הנוירונים המוטוריים נקבעו על ידי התחקות אחר קצה אות EGFP ב 48.ו-72 שעות לאחר ההפריה. עוצמת הפלואורסצנטית המנורמלת לאורך הציר העיקרי של הסומה הייתה שרטטה. וב-48 שעות לאחר ההפריה, הדפוסים של שני האותות חפפו במידה רבה זה לזה.לעומת זאת, ב 72 שעות, השיא עבור אות opTDP-43h נמצא באזור שבו האות EGFP-TDP-43z היה נמוך, המציין את המעבר הציטופלסמי של opTDP-43h. כדי לכמת את האותות opTDP-43h ו- EGFP-TDP-43z לפני ואחרי גירוי אור כחול, כמה תמונות הקרנה פרוסות עבור כל ערוץ של אותן תמונות מסדרת z הופקו בגיל 48. ו-72 שעות לאחר ההפריה.מתוך ארבעת התאים mnr2b+שנחקרו, תא 1, הציג במיוחד אות EGFP-TDP-43z רווי. כמויות יחסיות של opTDP-43h ל- EGFP-TDP-43z חושבו על-ידי חלוקת ערך ה- RFP בערך GFP. תאים 2 עד 4 מוצגים רמות הפחתת opTDP-43h לאחר תאורת אור כחול.חשוב למזער את הזמן שהדגים מוטבעים באגרוז כדי לשמור על בריאותם. על ידי התאמת העוצמה ומשך הזמן של תאורת LED, אנו שולטים במעבר שלב TDP-43 באופן מוסדר זמני, אשר יכול לעזור לנתח התקדמות של מעבר פאזה TDP-43 פתולוגי בנויר העצב המוטורי.

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מתאר טכניקות אופטוגנטיות על ידי הפעלת נוירונים סומטוסנסוריים מהונדסים גנטית ורישום תגובה התנהגותית מעוררת באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

Optogenetics של דגי זברה: הפעלת נוירון סומטוסנסורי מהונדס גנטית לחקר תגובות התנהגותיות של זחלים

בסרטון זה אנו מתארים בדיקת הפרדת פאזה, שבה חלבונים תוך-תאיים המורכבים מאזורים בעלי אי-סדר מהותי המאוחים לתחום אוליגומריזציה רגיש לאור מושרים באמצעות חשיפה לאור כחול כדי לשייך את עצמם למעובים דמויי נוזל חסרי קרום.

בדיקת הפרדת פאזות חלבון: שיטה אופטוגנטית להפרדת שלב חלבון קושר RNA מוטנטי בנוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

סרטון זה מדגים בדיקה לא פולשנית לחקר אלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה. עם מדידת סליל הזנב בעוברים כתוצאה מדפולריזציה ספונטנית של הנוירונים המוטוריים של חוט השדרה, מוחל חוסם תעלות נתרן כדי להפחית את תדירות הסליל. לאחר מכן, העוברים משותקים באגרוז ומונחים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנוירונים המוטוריים המהונדסים גנטית מבטאים ביו-חיישן חישת מתח עם תורם ופלואורופור מקבל. ירידה בפליטה פלואורופורית מקבלת מצביעה על ירידה בדפולריזציה הספונטנית של נוירונים מוטוריים עקב חוסם תעלות...

גישה לא פולשנית לחקר האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה

טכניקות Optogenetic הפכו אותו ניתן ללמוד על התרומה של נוירונים ספציפיים להתנהגות. אנו מתארים שיטה בדג זברת זחל להפעלת נוירונים חושיים יחידים להביע channelrhodopsin ריאנט (שף) עם מדינה-דיודה שאובה מוצקה ליזר (DPSS) ולהקליט את ההתנהגויות שהושרו עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לחקור את התכונות החשמליות של תאים מעוררים בתנאים הפיזיולוגיים הלא פולשניים ביותר על ידי שימוש בעוברי דג הזברה במערכת in vivo יחד עם מחוון מתח מקודד גנטית (GEVI) מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) המתבטא באופן סלקטיבי בסוג התא המעניין.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

אופטוגנטיקה היא כלי רב עוצמה עם יישומים רחבי היקף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול.

ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

פרוטוקול זה קובע פרדיגמת פנוטיפ התנהגותית בזחלים של דגי זברה שטופלו ב-MPTP כדי להעריך ליקויים מוטוריים ולא מוטוריים הדומים למחלת פרקינסון.

פרופיל פנוטיפי של פנוטיפים התנהגותיים דמויי פרקינסון שנגרמו על ידי MPTP בזחלי דגי זברה בהתבסס על ניסוי התנהגותי

חקור מעברי פאזה אופטוגנטיים של TDP-43 בנוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני ניוון עצבי ב-ALS ולבחון מועמדים לטיפול.

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

גלה סרטונים נוספים