כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

כדורי תאי סרטן השד המתוארים כאן יאפשרו לחוקרים לחקור מנגנונים מולקולריים של אינטראקציות תאי אנדותל של תאים סרטניים המעורבים בשגשוג ובגלמת תאים סרטניים. היתרון העיקרי של מודל תלת-ממד זה הוא שהוא מספק סידור תאי מציאותי יותר המשפרת את אמינות המסקנות לגבי הפתופיזיולוגיה והטיפול בסרטן השד. מדגימה את ההליך תהיה ג'ובאנה אזאריטו, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.

התחל על ידי טיפול או טרנספקט של התאים מצופים במשך 24 שעות, או לפי הצורך. לזיהוי התפלגות תאים בספירואיד, יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של תמיסת מלח מאוזנת של Hanks'Balanced Solution או HBSS, המכיל סידן ומגנזיום ולהישאר ב- HUVECs באמצעות 0.5 מיקרוגרם לצבע כחול מיליליטר. ותאי MCF-7 המשתמשים בצבע ירוק מיקרומולרי 0.5 מדוללים ביחס למדיום הצמיחה.

מניחים את הצלחת לתוך 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים CO2 אינקובטור במשך 30 עד 40 דקות. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של HBSS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של סוכן מחדש ניתוק אנזימטי, שהוא 0.25% טריפסין עבור HUVEC ו 0.5% נסיעות בארבעה MCF-7 לכל צלחת חומה באמצעות פיפטה P1000.

בחר כל סוג תא בנפרד בצינור פוליסטירן תחתון עגול חמישה מיליליטר, ולהוסיף מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי 10% או בינוני FCS באמצעות פיפטה P1000 כדי לעצור את התגובה אנזימטית. ואז צנטריפוגה ההשעיות התא ב 250 פעמים G במשך חמש דקות. בזהירות לשאוף supernatant ולהשעות את התאים במיליליטר אחד של מדיום ללא סטרואידים.

השתמש 100 microliters של כל השעיה תא מדולל עם 10 מיליליטר של דילול 2 כדי לקבוע את מספר התא הכולל. הפעל את המחשב ורוקן על-ידי לחיצה על לחצני הפונקציה וההפעלה, עם פתרון דילול 2 במתקפת מונה התא. השתמש בגדר כארבע ולחץ על התחל למדוד את הריק עם פתרון 2 דילול טרי.

שנה את מבחן הניקוד עם 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים ב 10 מיליליטר של פתרון דילול 2. השתמש בגדר כארבע ולחץ על התחל למדוד את הדגימות. שים לב למספר התאים למיליליטר על הצג הדיגיטלי, ואז להכין חמישה מיליליטר של כל מתלה תא ולערבב אותם כדי לקבל נפח סופי של 10 מיליליטר ביחס אחד לאחד, באמצעות pipette חוזר ידני כדי pipette החוצה 100 microliters של השעיית התא לתוך כל באר של צלחת U-bottom 96 טוב.

מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור בתנאי תרבית רקמות סטנדרטיים ולבדוק היווצרות כדוריות לאחר 48 שעות. צלם תמונות של כדוריות אלה בהגדלה של 40 X באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. להכנת תרבות הטיפה התלויה מערבבים את מתלי התאים ביחס של אחד לאחד כדי לקבל נפח סופי של שני מיליליטר.

השתמש פיפטה P20 כדי לראות את תערובת התא בצורה של 15 טיפות microliter על עופרת הפוכה של צלחת פטרי 10 ס"מ. הפוך את המכסה עם טיפות ולהוסיף חמישה מיליליטר של EBM-2 בסיס בינוני בתחתית המנה כדי למנוע אידוי של טיפות. לאסוף כ 50 כדוריות בצינור 1.5 מיליליטר עם קצה המעיים של פיפטה מיקרוליטר P200.

אפשר להם להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח המשיכה ולאחר מכן להשליך את supernatant. תקן את כדורי זה עם 500 מיקרוליטרים של 4%PFA לשעה אחת בטמפרטורת החדר. מרתיחים 2%תמיסת נובל אלגור ב-PBS באמצעות פלטה חמה עם ערבוב מגנטי במשך שלוש עד חמש דקות כדי להמיס את האבקה האוגורית לחלוטין ומצוננת לסביבות 60 מעלות צלזיוס.

הסר PFA עם פיפטה P1000, לשטוף את הכדורידים האלה עם 500 microliters של PBS ולאפשר להם משקעים. לאחר התיישב להשליך את supernatant בזהירות pipette 600 microliters של פתרון אגורה לתוך צינור 1.5 מיליליטר עם כדורי והניחו את הצינור מיד בצנטריפוגה עם רוטור אופקי ב 177 פעמים G במשך שתי דקות. הוסף מחרוזת קצרה באמצע פתרון אגרו כדי להסיר בקלות את התקע מהצינור.

לחזק את תקע אגרו על קרח, או בארבע מעלות צלזיוס להוסיף 500 microliters של PBS לתוך צינור 1.5 מיליליטר כדי למנוע ייבוש הכדור. השג תמונות של מקטעים כדוריים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. חשב את כמות הפתרון הדרוש כדי להוסיף 10 microliters לכל באר של תערובת של סידן Aam ואתידיום homodimers מדולל באמצעות EBM-2 ביחס אחד עד 50.

מוסיפים את תערובת הכתמים לספרואידים ומניחים את הצלחת באינקובטור תחת התקן, תנאי תרבית הרקמות במשך 30 עד 60 דקות. השג תמונות בהגדלה של 40 X באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. בלוחות התחתית של כדוריות נצפתה היווצרות כדורית 48 שעות לאחר זריעת תאי MCF שבעה.

עם זאת, היווצרות כדורית לא נצפתה במקרה של תאי אנדותל או תאי לימפה. זריעת ה- MCF שבעה בתוספת תאי אנדותל או MCF שבע בתוספת תאי לימפה ביחס של אחד לאחד הביאה גם להיווצרות כדורית. צמיחה רציפה תלוית זמן של MCF שבע ספרואיד נרשם נע בין 24 ל 120 שעות.

גודל כדורי גדל מ 100 מיקרומטר לכ 200 מיקרומטר מעל בחמישה ימים. עם קצב צמיחה מוגבר נצפתה כדורי שטופלו עם ממריץ הצמיחה. המבנה של כדורי ואת הצורה של התאים שלהם לא הראו חריגות בעקבות transfection עם שליטה אוליגונוקלאוטידים בנוכחות ליפופקטמין.

תאים המבטאים את הסמן הרב שלהם Ki-67 הופצו באופן הומוגני בספירואידים אלה. Cleave כדי caspase שלושה כתמים של כדורי זה הראה תאים אדישים לאחר ארבעה ימים של תרבות. מחקר של התאים בספירואידים אלה עם CD-31 ו- Ki-67 גילה כי 55% מהתאים הם אפיתל 45%הם אנדותל ו -25% מהתאים מתרבים.

כדי להעריך את אחוז התאים החיים והמתים ארבעה כדורים בני ארבעה ימים היו מוכתמים בסידן Aam ואתידיום-הומודימר. ספרואיד שנחשב זה עתה גם כתם על תאים מתים וחיים גילה כי כדורי רגישים מאוד לתנאי הקפאה. בעת ביצוע הפרוטוקול שלו, ודא כי תאים בריאים משמשים לערבב אפרודיטה דבר נוסף לזכור יהיה למנוע נזק אפרודיטה אלה במהלך כובע DP כדי להשיג קטעים טובים גם להבטיח לחך אפרודיטה לפני פני פילמורים.

מודל זה יכול להשתפר עוד יותר על ידי הכללת תאים אחרים, כגון פיברובלסטים המעורבים בהתקדמות הגידול ושימוש בו כדי להעריך את היעילות של סוכנים טיפוליים המתמקדים בצמיחה סרטן.