Name: זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: למד זיהוי ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים אפרנטים וגאליים בעכברים באמצעות הכלאה במקום מולטיפלקס. שיטה זו מאפשרת מיפוי מדויק של פרופילים תעתיקיים בתאים הטרוגניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי נוירואנטומיה / היסתולוגיה / הליבה הזרקת המוח במימון מענק NIH #5P01DK119130-02. המחברים רוצים להכיר בסיוע של UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (בראשות ד"ר פלפס) וצוותו (אבהיג'יט באגדה ומרסל מאטלן), הנתמכים בחלקם על ידי מענק NIH #1S10OD021684-01, משאב משותף של מרכז הסרטן הרולד סי סימונס, הנתמך בחלקו על ידי מענק תמיכה במרכז הסרטן של NCI, P30 CA142543.

הערה: עכברים המשמשים במחקר זה היו זכרים מסוג בר על רקע C57BL / 6J טהור. בסך הכל 4 עכברים שימשו מולטיפלקס ISH. כל העכברים היו בערך בני 8 שבועות בזמן ההקרבה. עכבר זכר אחד (בערך בן שנה) שימש גם להדגמת פלואורסצנטיות אנדוגני הקשורה להזדקנות. בעלי חיים שוכנו בכלובים מאווררים בתוך מתקן מחסום עם גישה למזון ומים. הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי UT Southwestern בחנה ואישרה את הנהלים המתוארים להלן. פרטים על ריאגנטים וכלים ניתן למצוא בטבלת החומרים.
1. אוסף דוגמאות
<ol><li>ביום ההקרבה, לתת מנת יתר של הידרציה כלורל (500 מ"ג/ק"ג, i.p.) לעכברים. לחדיר את העכברים מרדים עמוק באופן transcardially באמצעות משאבה peristaltic עם 5 מ"ל של 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ואחריו 50 מ"ל של 10% פורמלין בטמפרטורת החדר. הערה: זה נעשה במכסה אדים כדי למנוע שאיפת פורמלין.</li>
	<li>כמו להנהון, פטרוסאלי, הגרעינים הצוואר מותכים ליצור מסה גנגליונית אחת בעכבר15, בזהירות לאסוף את כל המסה הגנגליונית vagal מכל צד (שמאל וימין) בעזרת היקף ניתוח ומספריים קפיציים עדינים ומלקחיים (ראה טבלת החומרים).</li>
	<li>בעת עריפת ראש העכבר עם זוג מספריים גדולים (ראה טבלת החומרים),הימנעו מריסוק גזע המוח.</li>
	<li>בעקבות גישת ניתוח שתוארה בעבר בחולדה40, להסיר את שרירי עצם החזה ו omohyoid לרוחב קנה הנשימה עם מלקחיים קטנים (שולחן החומרים) כדי לחשוף את עצם העורף. נקה את כל האזור של שריר, רקמת שומן, ורקמת הלחמית עד העורק הראשי, עצב vagus, העצב hypoglossal, מגנום foramen נראים. חותכים את כל העצב ההיפוגלוסאלי עם מספריים קפיציים קטנים(שולחן החומרים).</li>
	<li>חפשו את גנגליון הנודן כמסה שקופה קרוב למגנוםפורם 15. באמצעות מספריים קטנים (שולחן החומרים),בזהירות לשבור את העצם העורפית כדי לחשוף עוד יותר את גנגליון הצוואר. חפש מלנוציטים שחורים על פני השטח של וריד הצוואר כציון דרך חזותי.</li>
	<li>לחתוך חיבורים עצביים בין המסה הגנגלית vagal ולחלץ את כל המסה הגנגליונית על ידי משיכה בעדינות על הקצה ההיקפי של עצב vagus ובו זמנית חיתוך גנגליון הצוואר לכיוון גזע המוח עם מספריים קפיץ קטן(שולחן החומרים).</li>
	<li>הסר את רקמת הלחמית ואת השומן דבק עצב vagus ומסה גנגליונית ככל האפשר.</li>
	<li>כפי שקל לאבד גנגליון אחד במהלך ההעברה מצינור אחד לשני, לשמור ~ 0.5 ס"מ של עצב vagus כדי להקל על טיפול ולוקליזציה של דגימות.</li>
	<li>מניחים גרעינים בעזרת מלקחיים עדינים בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ודגרה ב 4 °C (5 °F) בפורמלין במשך 24 שעות ועם 30% סוכרוז עוד 24 שעות.</li>
	<li>מקם גרעינים בתוך טיפה קטנה (~ 4 מ"מ Ø) של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינוני על פיסת רדיד אלומיניום. לאחר מכן, להקפיא את הדגימה על מצע של קרח יבש.</li>
	<li>לחתוך את הדגימות עם cryostat ב -20 °C לחלקים של עובי 14 מיקרומטר ולאסוף על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כמו 3 סדרה 42 מיקרומטר זה מזה. הערה: הימנעו מהצבת מקטעים קרובים לשולי השקופית. כדי להציל ריאגנטים, לשמור על קטעי הרקמה ארוזים היטב ככל האפשר, אך ללא חפיפה.</li>
	<li>לאחסן את הדגימות במקפיא -80 °C עד הצורך עבור ISH במשך 6 חודשים לפחות. הערה: עיין באיור 1 לפתרון בעיות עבור פלואורסצנטיות אנדוגנית.</li>
</ol>2. טיפול מקדים ו-ISH
<ol><li>לפני יום הניסויים, כלי זכוכית מעבדה autoclave לשמש ISH, כולל כלים מכתימים וצנצנות חוצץ כביסה. הערה: בעוד עבודה בתנאים ללא RNase אינה קריטית, ללבוש כפפות בכל עת. שמור RNase בקבוקי פתרון טיהור (שולחן החומרים) בהישג יד במקרה זיהום חשוד.</li>
	<li>ביום הראשון, להביא את השקופיות לטמפרטורת החדר על ספסל המוקדש במיוחד ISH. שוטפים את השקופיות ב-1x PBS ואופים אותן במשך 30 דקות ב-60 מעלות צלזיוס בתנור אפייה(שולחן חומרים).</li>
	<li>לאחר לתקן את השקופיות ב 4% פורמלין במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>הביאו את ריאגנטים בערכת מולטיפלקס(שולחן החומרים)לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ייבשו את השקופיות ב-50%, 70% ו-100% אתנול למשך 5 דקות כל אחת. יש למרוח את תמיסת H2O2 על הדגימות למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים כפולים (ddH2O).</li>
	<li>לטפל בדגימות עם ריאגנט אחזור היעד במשך 5 דקות, לשטוף ddH2O ואחריו 100% אתנול, ואוויר יבש. באמצעות עט הידרופובי, ליצור מחסום סביב הדגימות. הערה: אין להחיל את המחסום ההידרופובי קרוב מדי לחלקי הרקמה.</li>
	<li>החל פרוטאז במשך 30 דקות ב 40 °C (40 °C) בתנור הכלאה(שולחן החומרים).</li>
	<li>בינתיים, לפני המלחמה של הבדיקות ב 40 °C (50 °F) ולקרר אותם בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לדגור את השקופיות עם השילוב הרצוי של בדיקות היעד (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; או Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) למשך 2 שעות ב-40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה.</li>
	<li>דגירה רקמת שליטה שלילית עם דיהידרודיפיקולינט רדוקטאז (DapB) יעד C1 בדיקה עבור 2 שעות ב 40 °C (50 °F) בתנור הכלאה.</li>
	<li>יש לשטוף את השקופיות במאגר הכביסה ולאחסן למשך הלילה ב-5x תמיסת מלח נתרן סיטראט (SSC) בטמפרטורת החדר. לנוחות, לפצל את הניסוי ליומיים. למחרת, לשטוף את השקופיות עם חוצץ לשטוף ולדגירה אותם עם ריאגנטים הגברה המפורטים להלן (ראה מדריך למשתמש בטבלת החומרים).</li>
	<li>החל AMP1 (30 דקות ב 40 °C ),AMP2 (30 דקות ב 40 °C (70 °F), ו AMP 3 (15 דקות ב 40 °C (50 °F). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.</li>
	<li>להמיס כל צבע אופל (שולחן החומרים) דימתיל גופרתית ולאחסן את הפתרונות ב 4 °C (50 °F) עד הצורך.</li>
	<li>עבור ערוץ 1, לדגור את השקופיות עם HRP-C1 (15 דקות ב 40 °C) ואופל 520 (צבע ירוק; דילול 1/1,500; 30 דקות ב 40 °C). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.</li>
	<li>עבור ערוץ 2, לדגור את השקופיות עם HRP-C2 (15 דקות ב 40 °C (570° C) ואופל 570 (צבע צהוב; דילול 1/1,500; במשך 30 דקות ב 40 °C (50 °F). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.</li>
	<li>עבור ערוץ 3, לדגור על השקופיות עם HRP-C3 (15 דקות ב 40 °C (40 °C) ואופל 690 (צבע אדום רחוק; דילול 1/1,500; במשך 30 דקות ב 40 °C (40 °C). יש לשטוף במאגר הכביסה בין כל שלב.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות ולחשוף אותם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) עבור 30 s.</li>
	<li>יש למרוח מיד על כל שקופית ולהניח כיסוי על מקטע הרקמה.</li>
	<li>שמור את הרקמות אופקיות במחזיק שקופית ב 4 °C (5 °F) עד הדמיה.</li>
</ol>3. מיקרוסקופיה וניתוח נתונים
הערה: ניתן לדמיין נתוני מולטיפלקס ISH עם מגוון רחב של מכשירים עם המסננים המתאימים. עם זאת, שיטת הדמיה מועדפת היא מיקרוסקופיה קונפוקלית עם מטרות 20x ו 63x (שמן); עיין בדיון מהסיבות. עיין באיור 2 לקביעת יחס האות לרעש האופטימלי.
<ol><li>השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בקווי לייזר 488, 561 ו- 633 ננומטר. השתמש בפרמטרים הבאים רכישה (ראה טבלה 1): אופל 690 (HeNe 633 ננומטר, טווח זיהוי 668-696 ננומטר, כוח 2.0, רווח 724); אופל 570 (לייזר DPSS 561 ננומטר, טווח זיהוי 579-627 ננומטר, <כוח 15.0, <גיין 450); אופל 520 (לייזר ארגון 488 ננומטר, טווח זיהוי 499-535 ננומטר, <כוח 6.0, <גיין 830); DAPI (לייזר דיודה 405, טווח זיהוי 415-502 ננומטר, < כוח 12.0, <גיין 532).</li>
	<li>כדי לשפר את איכות התמונות, רכש עם קו בממוצע של 4 וגודל פיקסלים של לפחות 1024 x 1024. הערה: הפרמטרים לעיל מסופקים רק כדוגמה, ושינויים מומלצים בהתאם למכשיר אחד, הגדלה (20x או 63x), רמות ביטוי ורמות אנדוגניות של פלואורסצנטיות עבור כל רקמה נתונה.</li>
	<li>לאחר סיפוק הפרמטרים הרכישה, לאסוף תמונות באמצעות אותן הגדרות. ייחס צבעים כוזבים לכל ערוץ כדי להקל על הפריט החזותי. הערה: לדוגמה, אדום (Phox2b או Prdm12), ציאן (Cck1r), צהוב (Ghsr) ואפור (DAPI).</li>
	<li>בצע ספירת תאים באמצעות התמונות הדיגיטליות על-ידי זיהוי קווי המתאר של פרופילים חיוביים ל- RNAscope עם גרעין אחד מוכתם קלות ב- DAPI. חשב את אחוז הפרופילים החיוביים ל- RNAscope המבטאים כל תעתיק [איור 3A-C].</li>
	<li>כדי לשפר את ההקפדה והדיוק של האומדנים, לספור לפחות 2,000 פרופילים עצביים מלפחות 4 בעלי חיים שונים. בצע ספירה מגנעים שמאל וימין בנפרד.</li>
	<li>הזן את הנתונים בתרשים עוגה עם המספר הכולל של פרופילים שנספרו.</li>
	<li>השתמש בתוכנת הדמיה כדי להשיג תמונות ולתפור יחד תמונות 20x. השתמש ImageJ-פיג'י ותוכנה אחרת תמונה ועיצוב כדי ליצור את הלוחות הסופיים. יש למרוח התאמות על ניגודיות וקלילות באופן אחיד על כל התמונות.</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הטכניקה של ISH הומצאה בסוף שנות ה -6042. עם זאת, זה לא עד אמצע שנות השמונים כי זה הוחל על גילוי mRNAs במערכות העצבים המרכזיות והיקפות43,44. בהתחשב בהטרוגניות של מערכת העצבים ובעיות חוזרות ונשנות בנוגדנים, לוקליזציה של תעתיק מסוים ברמה התאית נותרה כלי שלא יסולא בפז. עם זאת, שיטות ISH המסורתיות נותרו מייגעות ורגישות במידה ניכרת. למרבה המזל, מחקר זה השתמש בהליך ISH רגיש מאוד בשם RNAscope, אשר בדרך כלל אינו מייצר רקע ומאפשר זיהוי של מספר תמליל...

גופי התאים של זרים vagal כלולים בגרעפי הצוואר, פטרוסאל ונודים1,2,3. האקסונים שלהם נוסעים יחד דרך כמה ענפים של עצב הוואגוס לשטחים קרניוקרוויים, בית החזה והבטן4,5,6,7. מן סופם הקרבי, afferents vagal יכול להגיב למגוון רחב של גירויים פיזיולוגיים ומזיקים8,9,10. עם זאת, ההתפלגות של מולקולות איתות וקולטנים המעורבים חישת vagal נשאר מאופיין בצורה גרועה. הסיבה לכך היא שגרעי הוואגל, למרות גודלם הקטן, מבטאים קשת רחבה של קולטנים, כולל מספר גדול של GPCRs8,11,12,13. יתר על כן, נוירונים afferent vagal הם הטרוגניים מטבעם ולהציג פרופילים מולקולריים ברורים14. כדי לסבך את העניין, הגרעינים הצוואריים, הפטרוסאליים והנודים מחוברים לעכבר, ובכך יוצרים מסה גנגליונית אחת. לבסוף, בתת קבוצה של בעלי חיים, גנגליון הנודים מחובר לגנגליון צוואר הרחם העליון האוהד15.
בעבר, חוקרים פנו אימונוהיסטוכימיה ללמוד את האיפור הנוירוכימי של נוירונים afferent vagal16,17,18. בעוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים מאומתים היא שימושית, התוצאות של מחקרים אימונוהיסטוכימיים חייבים להתפרש בזהירות. לדוגמה, מאמצים רבים לזהות נוגדנים ספציפיים נגד GPCRs נכשלו19,20,21,22,23,24,25, מוביל חוקרים למסקנה כי רוב הנוגדנים נגד GPCRs אינם אמינים. כדי לעקוף בעיות אלה, PCR כמותי (qPCR) שימש נרחב להערכת ביטוי גנים במסה גנגל גנגליוני מכרסם26,27,28,29. עם זאת, בחינת ביטוי גנים באמצעות qPCR מתרחשת במחיר של אובדן מידע מרחבי. בפרט, לא ניתן לחזות כמה תאים או אילו סוגי תאים מבטאים גן מסוים של עניין (למשל, לולאה לעומת תאי הצוואר). בעיות חוזרות ונשנות כוללות גם את הזיהום עם רקמות סמוכות ואת הכללת אורכים משתנים של עצב vagus, גרעיני צוואר הרחם מעולה, וגרעיני הצוואר במהלך ניתוח15. כתוצאה מהקשיים הנ"ל, המחלוקת מקיפה את הביטוי וההפצה של מספר GPCRs בנוירונים זרים vagal. דוגמה תמוהה במיוחד מתייחסת לקולטן הגרלין (Ghsr). בעוד כמה מחקרים מצאו ביטוי נרחב של קולטן זה נוירונים afferent vagal30,31,32, אחרים מצאו Ghsr mRNA להיות כמעט בלתי ניתן לגילוי בגנגליון הנודים11,14. מיפוי מפורט של Ghsr mRNA במסה גנגליוני הוא אפוא מוצדק.
בהכלאה במקום (ISH) שימש גם להערכת דפוסי ביטוי גנים במסה הגנגלית הוואגליונית7,11,12,33,34,35. מכיוון שטכניקות מבוססות RNA נשארות אמינות וספציפיות יותר מאשר טכניקות מבוססות נוגדנים ברובהנסיבות 36,37, מחקרי ISH הוכיחו ערך להבנה טובה יותר של הקידוד הנוירוכימי של נוירונים עבים. עם זאת, טכניקות ISH המסורתיות עצמן אינן נטולות אזהרות. ISH רדיואקטיבי הוא רגיש אבל מייצר רקע ונשאר מסורבל38. ISH לא רדיואקטיבי הוא פחות מסובך אבל גם פחות רגיש38. לעומת זאת, שיטת RNAscope ISH שפותחה לאחרונה רגישה מאוד ומייצרת רקע מינימלי39. המחקר הנוכחי יישם מולטיפלקס פלואורסצנטי RNAscope לגילוי של GPCRs נוירונים afferent vagal של העכבר. התמקדנו במיפוי ההתפלגות של Ghsr והשווינו את תפוצתו לזו של קולטן cholecystokinin (Cck1r), GPCR אחר ידוע לבוא לידי ביטוי גנגליון הנודים34. לבסוף, שני גורמי שעתוק, הומיאובוקס 2b (Phox2b) וחלבון אצבע אבץ 12 (Prdm12), שימשו כסמנים סלקטיביים לנוירונים נודים ורידים, בהתאמה14. מבלי לדמיין Phox2b או Prdm12, זה יהיה מאתגר לזהות וריד לעומת נודים afferents בוודאות. מלכודות טכניות פוטנציאליות נדונות גם לאורך המאמר.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763-80</td><td></td></tr><tr><td>&deg; מקפיא C</td><td>PHCBI</td><td>MDF-DU901VHA-PA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td>תוכנת צילום ועיצוב</td><td>Adobe</td><td></td></tr><tr><td>תנור אפייה</td><td>תרמו מדעי</td><td>דגם: 658</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 כיסוי Airyscan</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>מעבדות לחקר המוח</td><td>2460-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecomount</td><td>Biocare Medical</td><td>EM 897L</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr>תנור<td>HybEZ</td><td></td><td></td><td>תנור היברידיזציה</td></tr><tr><td>עט הידרופובי</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים גדולות</td><td>הנרי שיין</td><td>100-7561</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרו צנטריפוגה</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Minipump זרימה משתנה</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Opal 520</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1487001KT</td><td>סמן ביולוגי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1488001KT</td><td>סמן ביולוגי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1497001KT</td><td>סמן ביולוגי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>ProLong זהב מדיום הרכבה Antifade Mountant</td><td></td><td></td><td>לתאים עם תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>323100</td><td>ערכת מולטיפלקס</td></tr><tr><td>RNAscope עכבר Cck1r-C3</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>313751-C3</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope בדיקה עכבר DapB</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope בדיקה עכבר Ghsr</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td></td><td></td>426141</tr><tr><td>RNAscope בדיקה עכבר Phox2b-C2</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>407861-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope בדיקה עכבר Prdm12-C2</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>524371-C2</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Rnase תמיסת טיהור</td></tr><tr><td>מספריים חיתוך קטנות</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z265977</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופיות</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek OCT בינוני</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>מדריך למשתמש</td><td>ACD</td><td>323100 USM</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים</td><td>Roboz</td><td>RS 5620</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Imaging Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון g בנוירונים afferent עכבר vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

מחקר זה מתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) של הגרעינים וריד הצוואר-לולאה העכבר, עם דגש מיוחד על זיהוי הביטוי של קולטנים חלבון G (GPCRs). גרעיני וריד הצוואר-לולאה קבועים בפורמלין עובדו עם טכנולוגיית RNAscope כדי לזהות בו זמנית את הביטוי של שני GPCRs מייצגים (קולטני cholecystokinin ו ghrelin) בשילוב עם גן סמן אחד של או לולאה (תיבת הומיאוbox דמוית זיווג 2b, Phox2b) או נוירונים מושבעים ורידיים (חלבון אצבע אבץ יחסי ציבור 12, Prdm12). גרעינים מסומנים צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבוע את דפוסי ההפצה והביטוי של התעתיקים הנ"ל. בקצרה, נוירונים afferent Phox2b נמצאו לבטא בשפע את קולטן cholecystokinin (Cck1r) אבל לא את קולטן גרלין (Ghsr). תת-קבוצה קטנה של נוירונים afferent Prdm12 נמצא גם להביע Ghsr ו / או Cck1r. אזהרות טכניות פוטנציאליות בעיצוב, עיבוד, ופרשנות של מולטיפלקס ISH נדונים. הגישה המתוארת במאמר זה עשויה לסייע למדענים ביצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים זרים vagal.

בעוד RNAScope יכול להיות מיושם על בעלי חיים בכל גיל, מין, או רקע גנטי, מומלץ לעבוד עם מבוגרים צעירים (&lt;3 חודשים). הסיבה לכך היא כי ממצאים פלואורסצנטיים (למשל, lipofuscin) הם ממצאים נפוצים נוירונים של בעלי חיים מבוגרים41. הגרעינים הקבועים בפורמלין מעכברים מבוגרים מכילים לעתים קרובות פלואורסצנטיות אנדוגנית אינטנסיבית באופן מפתיע, שניתן לטעות בה בקלות בהכתמה אמיתית(איור 1A,B). בכל מקרה, מומלץ לאמת את רמות הפלואורסצנטיות האנדוגנית ברקמה לפני העיבוד.</p...

מולטיפלקס בהכלאה במקום (ISH) הועסק כדי לדמיין בו זמנית את התמלילים עבור שני קולטנים מצמידי חלבון G וגורם שעתוק אחד בכל הקומפלקס הגנגליוני של העכבר הבוגר. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מפות מדויקות של פרופילי התמלול של נוירונים vagal afferent.

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

הליך זה רגיש מאוד ומאפשר הדמיה של מספר תמלילים עם רקע מינימלי. שיטה זו יכולה ליצור מפות מדויקות של פרופיל התמלול של סוגי תאים הטרוגניים מאוד. אם נדגים את ההליך, אני וג'ונסון בוב-מנואל, טכנאי מחקר במעבדה.התחל על ידי איסוף המסה הגנגלית הוואגליונית כולה מהעכבר בן שמונת השבועות מכל צד, בעזרת היקף ניתוח ומכשירים כירורגיים. לאחר עריפת ראשו של העכבר, השתמש במלקחיים קטנים כדי להסיר את עצם החזה ואת השרירים omohyoid לרוחב קנה הנשימה כדי לחשוף את העצם העורפית. נקה את כל האזור של שרירים ורקמות עד העורק הראשי, העצב הוואגוס hypoglossal ומגנום foramen גלויים.ואז לחתוך את כל העצב hypoglossal עם מספריים קפיציים קטנים. אתר עבור גנגליון הנודד כמסה שקופה קרוב למגנום פורם. בעזרת מספריים קטנים, שברו בזהירות את עצם העורף.כדי לחשוף את גנגליון הצוואר עוד יותר, אתר מלנוציטים שחורים על פני השטח של הצוואר כציון דרך חזותי. כאשר הגנגליונים נמצאים, לחתוך את הקשרים העצביים בין המסה הגנגליונית vagal ולמשוך בעדינות על הקצה ההיקפי של עצב הוואגוס ובו זמנית חיתוך גנגליון הצוואר לכיוון גזע המוח עם מספריים קפיץ קטן להפקת המסה הגנגליונית כולה. הסר את רקמת הלחמית, המסה הגנגליונית והשומן שנדבק לעצב הוואגוס.שמירה על כחצי סנטימטר של עצב vagus כדי להקל על טיפול ולוקליזציה של דגימות. מניחים את להסיר הגרעינים בעזרת מלקחיים עדינים בצינורות צנטריפוגות מיקרו 1.5 מילימטרים. ודגרה ב-4 מעלות צלזיוס בפורמלין במשך 24 שעות.ואז עם 30% סוכרוז ל-24 שעות. לאחר הדגירה, למקם את הגרעינים בתוך טיפה של קוטר ארבעה מילימטר של מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי על פיסת רדיד אלומיניום. ולביטוי את הדגימה על מצע של קרח יבש.חותכים את הדגימות הקפואות עם קריוסטט לחלקים של עובי של 14 מיקרומטר במינוס 20 מעלות צלזיוס ולאסוף את החלקים החתוכים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כמו שלוש סדרות 42 מיקרומטר זה מזה. לשטוף את השקופיות עם מקטעי רקמות PBS. ואופים במשך 30 דקות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור אפייה.לאחר מכן, postfix השקופיות ב 4%פורמלין במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מייבשים את השקופיות באופן סדרתי ב-50%70% וב-100% אתנול למשך חמש דקות כל אחת. ולהחיל תמיסת מי חמצן על הדגימות במשך 10 דקות לפני שטיפה במים מזוקקים כפולים.עבור הכלאה במקום, או ISH, לטפל בדגימות עם ריאגנט אחזור היעד במשך חמש דקות. לאחר מכן לשטוף ברצף את הדגימות במים מזוקקים כפולים 100%אתנול ואחריו ייבוש אוויר. באמצעות עט הידרופובי, ליצור מחסום סביב הדגימות.בעוד הדגימות מטופלות בפרוטאז במשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס ותנור הכלאה, מחמם מראש את הבדיקות ב -40 מעלות צלזיוס ומצנן אותן בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר המעבר מהתנור, לדגור על השקופיות עם השילוב הרצוי של בדיקות היעד במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. דגירה רקמת שליטה שלילית עם דיהידרודיפיקולינט רדוקטאז או DapB, גשושית C1 היעד במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.יש לשטוף את השקופיות במאגר הכביסה ולאחסן חמש פעמים נתרן מלוח סיטראט בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת, לשטוף את השקופיות עם חוצץ לשטוף לפני הדגירה עם ריאגנטים הגברה. ולהתייחס עם ריאגנטים ספציפיים לערוץ כמתואר בכתב היד.לשטוף את השקופיות ואחריו טיפול עם DapB במשך 30 שניות. לאחר מכן מיד להחיל את מדיום הרכבה על כל שקופית ומניחים להחליק כיסוי על קטע הרקמה. שמור את הרקמות אופקיות במחזיק שקופית בארבע מעלות צלזיוס עד הדמיה.הכן מיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה על-ידי הגדרת הפרמטרים הנדרשים. רכש את התמונות עם קו בממוצע של ארבעה וגודל פיקסלים של לפחות 1024 עד 1024 כדי לשפר את איכות התמונות. לאחר מרוצה הפרמטרים הרכישה, להתחיל לרכוש את התמונות באמצעות אותן הגדרות.ייחס צבעים כוזבים לכל ערוץ כדי להקל על הפריט החזותי. באמצעות התמונות הדיגיטליות, בצע ספירת תאים על-ידי זיהוי קווי המתאר של פרופילים חיוביים של טווח RNA עם גרעין אחד מוכתם קלות עם DapB. חשב את אחוז הפרופילים החיוביים של טווח ה- RNA המבטאים כל תעתיק.פרמטרי הרכישה האופטימליים נבחרו עבור כל לייזר בהתבסס על הפלואורסצנטיות הלא מוגדרת המתקבלת ברקמת הבקרה השלילית. הפלואורסצנטיות האנדוגנית בגנגליון הנודות של עכבר צעיר היא מינימלית. ודגרה עם גשושית DapB, זה לא הביא אותות.בלייזר כוח מוגבר ורווח עם לייזר 488 ננומטר, רקע לא רצוי ונקודות פלואורסצנטיות אקראיות מופיעים. טכניקת היקף הרנ"א הוחלה כדי לזהות שלושה גנים בקטעי רקמות של המסה הגנגלית של הווגל. פרופיל הרקמה היה חיובי עבור GHSR ו- CCK1R.הפרופיל כלל גם תמלילי Phox2b וגם CCK1R בחלק rostral של גנגליון הנודים. כתוצאה של מולטיפלקס ISH בנוירונים afferent הנודים, אותות Phox2b שנצברו במיוחד נוירונים afferent, הממוקם גנגליון הנודים. אותות CCK1R שכותרתו אינטנסיבית נוירונים רבים בגנגליון הנודים.בהגדלה נמוכה, תאים המבטאים אותות CCK1R או GSHR נמוכים לא ניתן היה לראות בקלות. DapB עזר לדמיין את הרקמה ולזהות נוירונים vagal afferent עם גרעין גדול ומוכתם קלות. בהגדלה גבוהה, פרופילים חיוביים Phox2b ניכרים.פרופילים 2 ו-3 הם תאי Phox2b עם אותות CCK1R גבוהים ומתונים. פרופיל ארבע ביטא הן את GHSR והן את CCK1R. כתוצאה של מולטיפלקס ISH של נוירונים afferent הצוואר, התמליל PRDM12 ניתן לראות במיוחד שנצבר נוירונים afferent הממוקם גנגליון הצוואר.בהגדלה גבוהה, אותות מתונים עבור CCK1R זוהו בפרופילים 1 ו -2. פרופיל שלוש הוא נציג של תאי PRDM12 שלילי עבור CCK1R או GHSR. עקביות של ביתור היא גורם חשוב.חשוב באותה מידה לוודא כי הפרמטרים רכישת הדמיה אינם מייצרים אותות רקע לא רצויים. מולטיפלקס בהכלאה במקום הפך תקן הזהב מבוסס מולקולרית, במיוחד בתחום neuroanatomy. שיטה זו יכולה להיות משולבת בקלות עם אימונוהיסטוכימיה.

detection-g-protein-coupled-receptor-expression-mouse-vagal-afferent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

האיבר הוומרו-נזלי (VNO) מזהה אותות כימיים בתוך-מיניים המעבירים מידע חברתי ורבייתי. ביצענו ניסויי דימוי Ca2+ באמצעות עכברים טרנסגניים המבטאים G-CaMP2 ברקמת ה-VNO. גישה זו מאפשרת לנו לנתח את דפוסי התגובה המורכבים של נוירוני הוומרו-נזל למספר רב של גירויי פרומונים.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

מקור: Baleriola, J., et. al., זיהוי mRNAs מקומיים אקסונליים בחלקי מוח באמצעות הכלאה ברזולוציה גבוהה באתר.  J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את זיהוי ה-mRNA בתוך אקסונים כולינרגיים בפרוסות היפוקמפוס קבועות של עכבר באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה וצביעת נוגדנים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת את הלוקליזציה המרחבית של mRNAs מתויגים בבדיקה וכולין אצטילטרנספראז בנוירונים כולינרגיים.

צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

כאן, אנו מתארים גישה פיזיולוגית המאפשרת זיהוי וניתוח מעמיק של אוכלוסייה מוגדרת של נוירונים חושיים בפרוסות רקמה קורונלית חריפות של האיבר הוומרונזאלי של העכבר באמצעות רישומי מהדק טלאי של תא שלם.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

פרוטוקול זה מתאר זיהוי מיקרוסקופיה confocal של G הקולטן חלבון בשילוב (GPCR) ההפנמה בתאי יונקים. הוא כולל את התרבות התא הבסיסי, transfection, ואת הליך מיקרוסקופיה confocal מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את לוקליזציה subcellular והפנמה של GPCR פיוז'ן-הביעו.

איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

למד זיהוי ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים אפרנטים וגאליים בעכברים באמצעות הכלאה במקום מולטיפלקס. שיטה זו מאפשרת מיפוי מדויק של פרופילים תעתיקיים בתאים הטרוגניים.

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

גלה סרטונים נוספים