ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות היא שיטה סטטיסטית המשתמשת בפלואורסצנטיות של תוצאת זמן כדי לאתר במדויק את החתימה הדינמית של קולטנים מצמידי חלבון G בתאים חיים. כאן, אנו מעוניינים במיוחד, קולטני בטא-2 adrenergic. קולטני ספינגולפיד מספקים בעיקר מידע על דינמיקת דיפוזיה תרגומית ובעזרת אניזוטרופיה פלואורסצנטית גם דיפוזיה סיבובית.

על ידי הצגת תווית נוספת, אנו יכולים גם בעד איגוד או אפילו שינויים קונפורמיים אם לטפח העברת אנרגיית תהודה בין התוויות כפי שנבדקו. פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן כמותי דורשת יישור זהיר של מדידות ההתקנה וכיול. בדקות הבאות, אנו נספק מדריך ניסיוני לספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות של תאי חיים, ספקטרוסקופיית מתאם צולבת, והעברת אנרגיית תהודה של פורסטר של קולטנים מצמידי חלבון G, באמצעות תגים מסוגלים לשיבוט וכוח זרימה סינתטי.

ישיבה סלולרית ו transfixing צריך להתבצע בתנאים סטריליים. מניחים משקולת החלקת כיסוי נקייה על צלחת תרבית של שש בארות, ושטפו אותה עם תמיסת מלח סטרילית של פוספט מוסיפים שני מ"ל של מדיום תרבית תאים עם סרום בקר עוברי 10%, 100 מיקרוגרם, פניצילין לאמין ו-100 מיקרוגרם לסטרפטומיצין מ"ל לכל באר, ושמור אותו בצד. קח את תאי CHO אשר מתורבתים באותו מדיום עם פנול אדום ב 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוז CO2 לשטוף אותם עם חמישה PBS mL כדי להסיר את התאים המתים.

מוסיפים שני מ"ל של טריפסין ודגרה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לדלל את תאי הנתונים עם שמונה mL של בינוני עם פנול אדום לערבב בזהירות על ידי pipetting. לספור את התאים בתא Neubauer ולשבת את התאים בצפיפות של 150, 000 תאים לבאר בצלחת תרבית שש באר המכילה את הפתק כיסוי.

תן לתאים לגדול באינקובטור במשך 24 שעות על מנת להשיג כ 80% השפעה. לדלל שני מיקרוגרם של ה- DNA הווקטורי הרצוי. לדוגמה, CT SNAP או NT SNAP, ושישה מיקרוליטרים של ריאגנט טרנס-זיהום זה לשני צינורות נפרדים.

כל אחד המכיל 500 מיקרוליטר מופחת סרום בינוני עבור כל באר ודגורת אותם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים את שני הפתרונות יחד כדי להשיג את תערובת transfection ולדגירה אותו במשך 20 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. בינתיים, לשטוף את תאי CHO יושב פעם אחת עם PBS סטרילי.

החלף את PBS עם מ"ל אחד לכל באר של פנול אדום חינם בינוני, בתוספת 10% סרום בקר עוברי ללא אנטיביוטיקה. מוסיפים את כל תערובת הבנייה של טיפת מ"ל אחת חכמה לכל באר ודגר את התאים בן לילה ב 37 מעלות בחמישה אחוז CO2. לתיוג, לדלל את מצע SNAP המתאים במדיום mL אחד בתוספת סרום בקר עוברי 10%כדי להשיג ריכוז סופי של מיקרומולר אחד.

לשטוף את התאים transfected פעם אחת עם PBS ולהוסיף mL אחד לכל באר של פתרון מצע SNAP מיקרומולרי אחד. לדגור על התאים במשך 20 דקות ב 37 מעלות בחמישה אחוז CO2. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם פנול אדום חינם בינוני, ולהוסיף שני mL לכל מדיום חינם פנול אדום היטב.

לדגור על התאים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוז CO2. העבר את החלקה הכיסוי של כל הדגימות לאחר מכן לתא ההדמיה לשטוף עם 500 מאגר הדמיה Microliter. הוסף מאגר הדמיה של 500 מיקרו-ליטר לפני המעבר להגדרת FRED FCS.

מערך FRED FCS מצויד במטרה למים מיקרוסקופיים קונפוקליים, שני קווי לייזר, מערכת ספירה זרה אחת של מתיל זמן, שני BMTs היברידיים ושתי מניות לאיסוף פוטונים ותוכנת איסוף הנתונים. זה מאוד חיוני כדי ליישר את ההתקנה בכל פעם לפני מדידה בתאים חיים. להתאמת מיקוד, חור סיכה ומיקום צביעה, הנח שני תמיסת כיול ירוק ננו-מולרית על החלקת כיסוי זכוכית והפעל את 485 ננומטר ולייזר 560 ננומטר המופעל בערימות, עירור משולב או מצב PI.

התמקדו בתמיסה והתאמו את מיקום חור הסיכה וטבעת הצווארון כך שקצב הספירה הגבוה ביותר ונפח הקונפוקאלי הקטן ביותר מתקבלים כדי לקבל את הבהירות המולקולרית המרבית. חזור על תהליך זה עבור הערוצים האדומים עם פתרון כיול אדום 10 ננומולר ותערובת של שניהם. הנח פתרון DNA 10 ננומולר על תלוש כיסוי זכוכית, ולהתאים את המוקד של חור הסיכה ואת מיקום טבעת הצווארון כך הצבעים הצולבים בין ערוצי הזיהוי הירוק והאדום הוא הגבוה ביותר.

זה המקור למשרעת הגבוהה ביותר. למדידות בתאים חיים, מצא תא מתאים על ידי הגבלה עם מנורת הסמן והתבוננות דרך העין. להפעיל את שני הלייזרים במצב PI ולהתמקד בממברנה על ידי חיפוש הספירה המרבית לשנייה.

שים לב, ייתכן שיהיה צורך להפחית את כוח הלייזר עבור דגימות התא. עדיף פחות מחמישה מיקרו-ואט במטרה. זה תלוי מאוד על הפרחים המשומשים ואת ההתקנה.

שים לב עקומות קול אוטומטי והצלבה של בטא-2 AR מאוגד EGP ו snap תג בדיקות בתצוגה המקדימה המקוונת של תוכנת איסוף הנתונים ולאסוף כמה מדידות מיון עם זמן רכישה בין 60 ל 180 שניות. יצא את קורס המתאם וניגודיות מכל המדידות. אנא דאג כאן כדי להגדיר כראוי את חלונות זמן הבקשה וההשהיה ולהשתמש באפשרות קבלת זמן מיקרו בתוכנת מתאם הנתונים.

בסך הכל נדרשים שלושה מתאמים שונים. מתאם אוטומטי של חלון הזמן של בקשת הערוץ הירוק. מתאם אוטומטי של הערוצים האדומים וחלון זמן ההשהיה.

ולבסוף המתאם הצולב של אות הערוץ הירוק, וחלון הזמן המהיר היה אות הערוץ האדום בחלון זמן ההשהיה. להלן פונקציות המתאם האוטומטי של ה- FRED הירוק והאדום לפתרונות ומתאימה אותן למודל דיפוזיה של 3 DT עם טווח שלישייה נוסף הנדרש לכיול הצורה והגודל של נפח הזיהוי הקונפוקלי עבור שני ערוצי הצבע של השימוש, כאשר B הוא הבסיס של העקומה ומספר המולקולות והמיקוד, TD זמן דיפוזיה ו- S, אפס מעל אומגה אפס גורם הצורה של אלמנט נפח הקונפוקלי. שלישיית מצמוץ ופיזיקת צילום מתוארת AR משרעת זמן זמן הרפיה TR. השתמש במקדם הדיפוזיה הידוע עבור הכיול הירוק והאדום בולט ולקבל גורמי צורה כדי לקבוע את הממדים והנפח של רכיב נפח הקונפוקלי ההדבקה.

חשב את הספקטרום לרוחב כמו IFR, האות הפלואורסצנטי הירוק שנאסף בערוצים אפסים, ושניים לערוץ הזיהוי הנכון, ערוץ אחד ושלוש, כיחס של אותות הרקע שנאספו. קבע את הציפייה הישירה של זרימת הנתונים המקבלת על ידי אורכי גל עירור התורם על ידי היחס בין הרקע שנאסף בניגוד למדידות הכיול האדום ואת עירור חלון הזמן המהיר על ידי לייזר ירוק לחשבון הנכון ברקע ממש בעירור חלון זמן ההשהיה על ידי לייזר אדום. חשב את הבהירות המולקולרית של B הן את כוח הזרימה הירוק והן את כוח הזרימה האדום בהתבסס על הניגודיות שנאספו ברקע, ולהשיג מספר מולקולות ולהתמקד בהתאמה דיפוזיה 3 DT.

התאם הן את הקורלציות האולטרה מן הערוץ הירוק והאדום, כמו גם על פני מתאם מן ההנחיה הירוקה ואת עיכוב אדום של ה- DNA ברמה הכפולה למודל דיפוזיה 3 DT שומר על גורמים בצורת להשיג קבוע עבור פונקציות המתאם האוטומטי. גורם הצורה עבור פונקציות המתאם הצולב נמצא בדרך כלל בין שני ערכים אלה. קבעו את המשרעת בזמן המתאם האפס בהתבסס על ערכי הגופן של המספר הנראה לעין של מולקולות ומיקוד.

חישוב יחס המשרעת עבור מדגם היה 100% דיפוזיה משותפת של כוח רצפה ירוק ואדום. התאם את דגימות התא לדגם מתאים. איך הם מוצגים דיפוזיה קולטן ממברנה לא סקרן בצורה דו מודאלית היה זמן קצר, לא דיפוזיה ארוכה.

בנוסף, יש לקחת בחשבון את פיזיקת התמונות ואת מהבהב החוצה כוח הרצפה. כאן ל- TD1 ו- TD2, הם השניים הנדרשים לפיזור זמני פיזור. ואחד הוא שבריר מזמן הדיפוזיה הראשון בניגוד למדידת הכיול שבה הקוביות החופשיות וגדילי הדנ"א מפיצים דיפוזיה, בכל הכיוונים, קולטני הממברנה מראים רק דיפוזיה דו-ממדית לאורך קרום התא מחשבים את הריכוז של חלבוני תווית ירוקה או אדומה מהכבוד של מספר המולקולות והמיקוד.

והנפח של רכיב הנפח הקונפוקלאי, באמצעות מסה מוטה. התאם את שני מתאמי האלטו של המדגם בעל התווית הכפולה באמצעות אותו דגם כמו עבור המבנה ברמה אחת ופונקציית המתאם הצולב באמצעות מודל דיפוזיה דו-מודאלי, הערה לתיאור כללי של המערכת. כל שלושת היבולים צריכים להיות בכושר משותף.

מונח הדיפוזיה זהה לכל שלושת היבולים. וההבדל היחיד הוא שזמן המוניטין נופל, פונקציית המתאם הצולב. חשב את הריכוז של חלבוני עבודה ירוקים או אדומים ממספר המולקולות והמיקוד המתאימים ואת הנפח של אלמנט נפח הקונפוקלי.

הערכת השבר או הריכוז של חלבוני תווית ירוק ואדום אינטראקציה מדגימות התא באמצעות גורמי התיקון המתקבלים מדגימות ה- DNA, יחסי המשרעת של דגימת התא והריכוזים המתקבלים בהתאמה. התאם את שני המתאם לשנות של מדגם FRED כדגימות תווית אחת ואת מתאם הצלב הקדמי למודל דיפוזיה דו מודאלית המכיל מונח אנטי מתאם, שבו AF משקף את המשרעת של המתאם הכולל ו AR ו- TR זמן משרעת ורגיעה בהתאמה. במקרה של שינויים פלואורסצנטיים אנטי-מתואמים עקב פרד אחד או כמה מונחים אנטי מתאם עשוי להידרש, אשר הביא לטבילה של פונקציית המתאם הצלב פרד בזמנים מתאם נמוך בקנה אחד עם עלייה בשתי פונקציות מתאם אוטומטי.

מדידות הכיול של פתרונות הפרחים הירוקים והאדומים לתהליכים מגלחים של 6.5 והתעלות הירוקות, ו-6.8 בערוצים האדומים. לפיכך, נפח הקונפוקל יש את הגודל של 1.4 ו 1.9 femto מאוחר יותר ביום מדידה זה, בהירות המולקולה טמונה 12.5 קילוהרץ למולקולה, ו 2.6 קילוהרץ למולקולה. יש לנו 15% של crosstalk מן הפרח הירוק לתוך הערוצים האדומים לאחר עירור התורם ו 38% של ישיר למעט עירור של הטופס הפרחוני האדום על ידי הירוק, ממדידת ה- DNA שלנו, אנו קובעים את גורמי התיקון עבור נפח החפיפה confocal ל 0.6 ו 0.7 מדי, התאים transfected עם תווית אחת להראות דיפוזיה דו-מודאלית דו ממדית על קרום התא שבו כמחצית המולקולות מפוזרות לאט על ציר הזמן של 50 עד 100 אלפיות השנייה והחצי השני מהיר יחסית בסביבות שתי אלפיות השנייה בשני המבנים.

בנוסף, מצמוץ שלישייה קיים. עם זאת, במפלס האדום הצמדה לבנות זמן הרפיה נוסף נרכש ב 180 מיקרו שניות, אשר עשוי לנבוע הצמדה לא מאוגדת ישר. מהתווית הכפולה עצמה, שהועברה עם מבנה האנטי-הצמד שבו שתי התוויות משני צדדים שונים של קרום התא, נאספו שתי מדידות פחות את הרעש ואת המעיל האדום על קורלציה.

והמתאם בין הצלב של PI הוא די גבוה כאן. כאן 70% מהמולקולות, אם אתה לאט מתחת לציר זמן של מאה אלפיות השנייה, ורק 30% מהר סביב אלפית השנייה, השבר של מולקולות משחררות כפולה הוא נמוך וטמון בין 15 ל -25% הנתונים עבור הצמד CT נראים טוב יותר וזה פחות רועש. עם זאת, ניתן לראות את האנטימתאם העמוק ביותר בחזית הצפויה, וככל הנראה הוא מסה על ידי כמות גבוהה של crosstalk, ישיר לקבל עירור ומצמוץ שלישייה של שני כוח פרחוני, ופעם תוכניות ניתוח נתונים ניצול של עוצמת פלואורסצנטיות שנאסף DKS עשוי לעזור להציל את זה כפי שמוצג עבור ערכת הנתונים המדומה.

היתרון של טכניקת פרד FCS הוא שיחד עם הניידות, אנו יכולים לחקור את דינמיקת הכנס של GPCRs. עם זאת, ביצוע FRED FCs במעבדות הוא מאתגר ולבקש תאים transfected טוב, תיוג יעיל התקנה מכוילת מושלמת. רק כוח PRO זוג FRED הוא גם מאוד קריטי.

צעדי ניסוי קריטיים כוללים אופטימיזציה של אופטימיזציה transfection, מזעור של הרקע, ואת הפלואורסצנטיות האוטומטית. בנוסף, צינור ניתוח אטומים יסייע להבין את הדינמיקה השונה של כללים בתאים חיים. אנו מקווים שפרוטוקול זה יהיה שימושי לבצע את גישת FRED FCS בניסויים בתאים חיים.