פיתוח מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית למדידת אנרגיה מיטוכונדריאלית בתחום

פיתוח מעבדה מיטוכונדריאלית ניידת מאפשר לפיזיולוגים לקחת את עבודתם לשטח, וכתוצאה מכך, הם יכולים להעריך מגוון מרתק של אתגרים אנרגטיים שבעלי חיים מציגים. השבי מלחיץ בעלי חיים רבים, ולכן בעזרת מעבדה ניידת אנו יכולים כעת לקחת את המעבדה לבעלי החיים במקום להחזיר אותם למעבדה. עם היכולת לבודד ולמדוד נשימה מיטוכונדריאלית בשטח, טכניקות שהיו בשימוש בעיקר על ידי ביו-רפואה יכולות כעת לשמש בהקשר אקולוגי ואבולוציוני.

התחל בחניית המעבדה הניידת על קרקע שטוחה, לאחר מכן הפעל את הגנרטור ויישר את הרכב. הרחב את השקופית לפני הגדרת הציוד. המשך להגדיר ולכייל את תאי הנשימה המיטוכונדריאליים לטמפרטורה הרצויה של הניסויים וללחץ הברומטרי הנוכחי בהתאם להוראות היצרן.

השתמש בקצה פיפטה חתוך של חמישה מיליליטר כדי להעביר את הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר, והפוך את הרקמה להומוגנית עם להב בעוצמה של 50% למשך חמש שניות. כדי לעכל את הרקמה, להוסיף חמישה מיליגרם של פרוטאז לכל גרם של שריר רטוב במשך שבע דקות, ערבוב הפתרון כל 30 שניות. סיים את התגובה על-ידי הוספת נפח שווה של מאגר הבידוד המכיל BSA.

לאחר מכן, צנטריפוגות את ההומוגנט ב 500 גרם במשך 10 דקות, ואז להעביר את supernatant באמצעות קצה פיפטה לחתוך חמישה מיליליטר דרך בד גבינה דו שכבתי לתוך צינור צנטריפוגה נקי 50 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה supernatant מסונן ב 3, 500 גרם במשך 10 דקות כדי לזרז גלולה מיטוכונדריאלית חומה. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף את אותו נפח של חיץ הבידוד המכיל BSA לצינור הצנטריפוגה, והשהה מחדש את גלולת המיטוכונדריה עם מגרד גמיש על ידי עבודה עדינה של גלולת המיטוכונדריה מדפנות צינור הצנטריפוגה, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב 3, 500 G למשך 10 דקות. השהה מחדש את הגלולה במאגר הבידוד ללא BSA כדי לחזור על שלב הצנטריפוגה כפי שתואר קודם לכן.

לאחר הצנטריפוגה השנייה, יש להשהות מחדש את כדורית המיטוכונדריה בחיץ המתלה בעזרת מגרד נקי וגמיש, ולהעביר את המיטוכונדריה המרחפת להומוגנייזר Dounce עם קצה פיפטה חתוך של מיליליטר אחד. עם homogenizer, בזהירות homogenize את ההשעיה המיטוכונדריאלית עם ארבעה עד חמישה מעברים. השתמשו בקצה פיפטה טרי חתוך של מיליליטר אחד כדי להעביר את התרחיף המיטוכונדריאלי ההומוגני בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.

למדידות הנשימה המיטוכונדריאלית של המצע המורכב יש להוסיף 945 מיקרוליטר של חיץ הנשימה לתא הנשימה המיטוכונדריאלי. ודא שהמערבל מסתובב כאשר טמפרטורת החיץ נשמרת על 37 מעלות צלזיוס. אטום את התא עם החלק העליון ולאחר מכן התחל להקליט את איסוף הנתונים.

לאחר שריכוז החמצן התייצב, הוסיפו 20 מיקרוליטר של התרחיף המיטוכונדריאלי לחדר, והניחו את המכסה. בתוכנה, לציין כי המיטוכונדריה נוספו לחדר. הוסף 10 מיקרוליטר כל אחד של גלוטמט מולארי אחד, 200 מילימולר מלאט, ו 200 מילימולר פירובט לתא עם מזרקים בודדים, ולחכות עד האות מתייצב לפני ציון המצע הוסיף בתוכנה.

השתמש מזרק נפרד כדי להוסיף חמישה מיקרוליטר של אדנוזין diphosphate, או ADP, לחדר. ציין את ADP נוסף בתוכנה, ולבחון את צריכת החמצן המהירה של מצב שלוש. לאחר מצב שלוש הנשימה וצריכת החמצן במיטוכונדריה הואטה למשך ארבע דקות כדי לציין נשימה במצב ארבע, סיים את ההקלטה ושמור את קובץ הנתונים.

עבור שני מצעים מורכבים, חזור על ההליך על ידי הוספת 963 מיקרוליטר של חיץ הנשימה לחדר. לאחר הוספת 20 מיקרוליטר של ההשעיה המיטוכונדריאלית, להוסיף ברצף שני מיקרוליטרים של ארבעה מיקרוגרם לכל מיקרוליטר רוטנון ו 10 מיקרוליטר של 500 מילימולר succinate לתא באמצעות מזרקים נפרדים. כאשר האות מתייצב, ציין את תוספת המצע בתוכנה.

עם תוספת של חמישה מיקרוליטר של ADP, לבחון את צריכת החמצן המהירה של המדינה שלוש ולציין את תוספת של ADP בתוכנה. לאחר מצב שלוש הנשימה וצריכת החמצן במיטוכונדריה הואטה למשך ארבע דקות כדי לציין נשימה במצב ארבע, סיים את ההקלטה ושמור את קובץ הנתונים. התוצאות המייצגות מציינות את נתוני הנשימה המיטוכונדריאלית הגולמית.

השיפוע התלול של שלב שלוש במצע המורכב מייצג את קצב הנשימה המקסימלי הגבוה. הבידוד המוצלח של המיטוכונדריה משריר השלד של הגפה האחורית נצפה על ידי פנייה חדה וייצוב שיפוע חדש של מצב ארבע. דפוס דומה ניתן לראות עבור נשימה מיטוכונדריאלית מורכבת מונעת על ידי שני מנועים.

התפקוד הלקוי של המיטוכונדריה הביא לצימוד של המיטוכונדריה לנשימה המיטוכונדריאלית המורכבת המונעת על ידי אחד. עם זאת, דוגמה אופיינית נוספת לתפקוד מיטוכונדריה לקוי הראתה את הקומפלקס הלא מצומד של שתי נשימה מיטוכונדריאלית עם קו שטוח לאחר הוספת ADP, וללא תור לייצר את מצב ארבעת הנתונים. הערכים המספריים של מצב שלוש, מצב ארבע, ויחס בקרת הנשימה, או RCR, הן עבור קומפלקס אחד והן עבור קומפלקס שניים נקבעו מנתוני מדידת הנשימה במהלך האיסוף, רקמות נוספות יכולות להיות מוקפאות במהירות הבזק על מנת להשתמש בהן בעתיד למדידת צפיפות מיטוכונדריה או נזק חמצוני.

בנוסף, לאחר ההליך, מיטוכונדריה מבודדים יכול גם להיות קפוא כדי למדוד את הפעילות של תחבורה אלקטרונים מתחמי שרשרת. היכולת לבודד ולמדוד נשימה מיטוכונדריאלית בשטח תסלול את הדרך לשיפור הבנתנו את תפקיד המיטוכונדריה באבולוציה של חיים מורכבים.