ייצור יחידות מוטוריות אנושיות עם צמתים נוירו-שריריים פונקציונליים במכשירים מיקרופלואידיים

שיטה פשוטה יחסית זו יכולה לעזור במחקר התמקדות נוירונים מוטוריים וצמתים עצביים שריריים בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה משתמש בטכנולוגיית תאי גזע סטנדרטית ובמכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית אשר מגבירים את יכולת הרבייה. ניתוק של נוירונים מוטוריים ותאי שריר הוא תופעה מוקדמת במספר מחלות נוירו-שריריות.

מודל אנושי פשוט יכול לעזור לפתח אסטרטגיות כדי לנטרל את התופעה. אנו משתמשים במודל זה כדי לחקור את הפרעת הנוירון המוטורי, טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם זאת, מודל זה יכול לשמש גם להפרעות אחרות שבהן היחידה המוטורית חיונית. התחל על ידי העברת המכשיר באמצעות מלקחיים מן המכולה לצלחת פטרי המכיל 10 מיליליטר של 70% עד 100% אתנול לעיקור במשך 10 שניות.

מעבירים את המכשיר עם מלקחיים לפיסת נייר לאוויר יבש בזרם למינאר במשך כ -30 דקות. לאחר הייבוש של המכשיר, יש להשתמש במלקחיים כדי להעביר כל מכשיר לצלחת פטרי בודדת של 10 ס"מ. כדי לצפות את המכשיר בפולי-ל-אורניתין או אש"ף, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון אש"ף לבאר העליונה וצפו בנוזל העובר מהבאר העליונה דרך הערוץ לבאר התחתונה.

לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון אש"ף לבאר התחתונה, ולחזור על הצד השני של חריצי מיקרו. סיים על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של פתרון אש"ף בצד אחד כדי ליצור מעבר צבע של עוצמת הקול בין שני הצדדים המשתקפים של המכשיר כדי לצפות את חריצי המיקרו. דגירה במשך שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

לאחר שלוש שעות, לשטוף את המכשיר שלוש פעמים במשך חמש דקות עם DPBS. יש לצפות את המכשיר ב-20 מיקרוגרם למין מיליליטר ומדיום עצבי על ידי ביצוע ההליך בדומה לציפוי אש"ף. לדגור את המכשיר לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

למחרת להשתמש פיפטה 200 microliter ולמקם את הקצה בבאר מול פתיחת הערוץ כדי להסיר את ציפוי למינין מן הבארות. לאחר הוספת DPBS לכל הבארות, להשאיר את המכשירים עם DPBS בזרם למינאר בטמפרטורת החדר עבור זריעת תאים. חותכים את גליונות SCM לגודל המכשיר תוך השארת כמה מילימטרים בכל צד.

לאחר עיקור המכשירים וגליונות SCM בצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר של 70% עד 100% אתנול במשך 10 שניות, להעביר את המכשירים עם מלקחיים לצלחת שש באר ואת יריעות SCM צלחת פטרי 10 ס"מ לייבוש אוויר בזרם למינאר. מקם את ההתקן על הקצה כדי לאפשר לכל הצדדים להתייבש במשך כ -30 דקות. יש לצפות את המכשירים על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון אש"ף לבאר לכל מכשיר בלוח ששת הבארות.

ודא שהמכשיר צף על גבי פתרון אש"ף עם צד הערוץ והחריץ הזעיר הפונה כלפי מטה אל תוך הנוזל. מצפים את יריעות ה-SCM על ידי הוספת 10 מיליליטר של תמיסת אש"ף לצלחת פטרי באורך 10 ס"מ, והשתמשו במלקחיים כדי לדחוף את יריעות ה-SCM לנוזל. התקני דגירה וגליונות SCM במשך שלוש שעות כפי שהודגם בעבר.

לאחר שלוש שעות, לשטוף את המכשירים ואת יריעות SCM פעמיים במשך חמש דקות עם DPBS ואחריו לשטוף שוב במשך חמש דקות עם מים סטריליים. לאחר מכן מעבירים כל גיליון SCM לצלחת פטרי בודדת בגודל 10 ס"מ לייבוש אוויר. בעת עבודה תחת מיקרוסקופ ב-Laminar Flow, השתמש במלקחיים כדי להרכיב את התקן הסיליקון עם צד הערוץ והחריץ הזעיר כלפי מטה בזווית של 90 מעלות על גיליון ה- SCM המבטיח שכל הצדדים מיושרים.

לחץ קלות כלפי מטה על ההתקן כדי לוודא לאטום לא רק קצוות החיצוניים, אלא גם סביב בארות, ערוצים וחריצים זעירים. כדי לצפות את המכשיר עם למינין, בתוך זרימת למינאר ומתחת למיקרוסקופ, להוסיף 100 microliters של 20 מיקרוגרם לפתרון מיליליטר של למינין בבאר העליונה באמצעות 200 pipette מיקרוליטר. שימו לב לנוזל העובר מהבאר העליונה דרך הערוץ לבאר התחתונה ללא דליפה סביב הבאר והתעל.

לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון למינין לבאר התחתונה, לחזור על הצד השני של חריצי מיקרו ולסיים עם 100 microliters נוסף של למינין בצד אחד כדי ליצור שיפוע נפח בין שני הצדדים שיקוף של המכשיר כדי לצפות את חריצי מיקרו, ולאחר מכן לדגור על המכשיר בן לילה. למחרת, להסיר את הציפוי מן הבארות עם 200 pipette microliters על ידי מיקום הקצה בבאר מול פתיחת הערוץ, לאחר הוספת DPBS לכל הבארות, להשאיר את המכשירים עם DPBS בזרימה למינאר בטמפרטורת החדר עבור זריעת תאים. כדי לפלס את תאי אבות העצבים או NPCs במכשיר microfluidic, להסיר DPBS משתי בארות בצד אחד של חריצי מיקרו במכשיר באמצעות 200 pipette microliter.

כדי לזרוע בסך הכל 250, 000 NPCs ו 60 עד 100 microliters של יום 10 בינוני נוירון מוטורי לכל מכשיר, בחלק הימני העליון, זרע מחצית מתלה התא קרוב לפתיחת הערוץ בזווית של 45 מעלות. השהה למשך מספר שניות כדי לאפשר להשעיית התא לזרום דרך הערוץ לפני הוספת החצי הנותר של ההשעיה של התא בבאר התחתונה. השתמש בעט כדי לסמן את הצד הזרע כ- NPC או שווה ערך, לכיוון קל של ההתקן ללא מיקרוסקופ, ודגור במשך חמש דקות עבור התקשרות לתא.

לאחר מכן, לאט לאט למלא את שתי בארות זרע NPC עם יום נוסף 10 נוירון מוטורי בינוני לנפח כולל של 200 microliters לבאר. באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטרים, הסר DPBS משתי הבארות בצד השני של חריצי המיקרו שמול NPCs שזה עתה זרעו. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיית נוירונים מוטוריים ליום 10 לבארות הבלתי מנוצחות.

לאחר מכן להוסיף שישה מיליליטר של DPBS לכל צלחת 10 ס"מ סביב המכשיר כדי למנוע אידוי של המדיום במהלך הדגירה. כדי לשנות את המדיום, הסר לאט את המדיה בשתי הבארות עם NPCs על-ידי מיקום קצה הפיפטה של 200 מיקרוליטרים בקצה התחתון של קיר הבאר מול פתח הערוץ. כדי למנוע זרימה בינונית חזקה מלפגוע בתאים בערוץ, הוסף לאט 50 עד 100 מיקרוליטרים של נוירון מוטורי טרי בינוני לכל באר על ידי שינוי מתמיד בין הבאר העליונה והתחתון.

חזור על התהליך עד שכל באר מכילה 200 מיקרוליטרים של בינוני. ביום 17 של בידול הנוירון המוטורי, להסיר את הנוירון המוטורי מדיום בצד הבלתי מנוצח של חריצי מיקרו במכשיר עם 200 pipette microliter לשטוף את בארות עם DPBS. זרע בסך הכל 200, 000 mesoangioblasts ראשוני אנושי או MABs, ב 60 עד 100 microliters של בינוני צמיחה לכל מכשיר על ידי זריעת מחצית השעיית התא בבאר העליונה.

השהה למשך מספר שניות כדי לאפשר להשעיית התא לזרום דרך הערוץ לפני זריעת החצי הנותר של ההשעיה של התא בבאר התחתונה, כפי שהודגם קודם לכן עבור ציפוי NPC. לאחר מכן למלא את שתי בארות זרע MAB טרי עם מדיום צמיחה נוסף דגירה שוב כפי שהוכח.

כדי ליזום את טקטיקת הכימותרפיה ואת שיפוע נפח ביום ה -21 של בידול הנוירון המוטורי, להוסיף 200 microliters לכל באר של נוירון מוטורי בינוני עצבי המכיל גורמי גדילה לתא Myotube, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters לכל באר של מדיום בסיס נוירון מוטורי ללא גורמי גדילה לתא הנוירון המוטורי. חשוב להעריך את פוטנציאל הבידול של קווי התא לפני שיתוף פולחן אותם במכשירים microfluidic. מדד ההיתוך של MABs נקבע, וכ-8% הוערך כמספיק לתרבות משותפת.

תרביות הנוירונים המוטוריים שנוצרו היו 85 עד 95% חיוביות עבור סמני נוירונים מוטוריים. לאפיון וכימות כמות הצמתים הנוירו-שריריים או NMJs, מספר ההקלות המשותפות בין הנוירון המוטורי לסמנים טרום-סינפטיים שרשרת כבדה של נוירופילמנט וסינפטופיסין וסמן קולטן אצטילן פוסט-סינפטי אלפא בנגרוטוקסין, נספר דרך כל מחסנית מחלה ונורמל במספר שרשרת כבדה מיוזין שכותרתה מיוטיובים הנמצאים בערימת Z. NMJs הופיע כנקודת מגע אחת NMJs שבו neurite נגע אשכול של קולטן כולין עדין בנקודת אינטראקציה אחת.

או כנקודת מגע מרובה NMJs שבו נויריט התפרס ועסק עם אשכול קולטן כולין עדין על פני משטח גדול יותר. כימות של אחוז הנוירון המוטורי המחדש Myotubes הצביע על כך שלא כל Myotubes הכיל NMJs. עם הפעלת נוירון מוטורי עם אשלגן כלורי, זרם סידן נצפה ב- Fluo-4 שכותרתו Myotubes, אשר אישר חיבור פונקציונלי באמצעות נוירון מוטורי neurite ב Myotube, התוספת של חוסם NMJ d-טובוקרין, או DTC לתא Myotube הביא עיכוב של זרם סידן.

כדי לקבל את ההצלחה הגדולה ביותר עם דגם זה חשוב מאוד לבצע בדיקת איכות קו התא כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בערוצים של המכשיר. שילוב הצומת neuromuscular בצלחת עם סוגי תאים ישירים IPC אחרים מחקה אפילו טוב יותר את מצב במבחנה, זה גם מאפשר ללמוד את התפקיד של סוגי תאים אלה.